Aislamiento, expansión y diferenciación de progenitores fibro-adipogénicos a partir del modelo de ratón espinoso
15 de noviembre de 2024
Este protocolo describe el aislamiento de progenitores fibroadipogénicos (FAPs) del músculo esquelético y cardíaco a partir de ratones espinosos (Acomys) mediante disociación enzimática y clasificación celular activada por fluorescencia. Los FAPs obtenidos de este protocolo pueden expandirse y diferenciarse eficazmente a miofibroblastos y adipocitos.
Nuestra visión general es comprender y comprender mejor la comunicación celular y el comportamiento celular que conduce a la metástasis de los tejidos y cómo los procesos celulares están mal regulados en la reparación de la alimentación. Para ello, estamos utilizando varios modelos de los cuales uno es el ratón espinoso. Uno de los principales problemas de este nuevo modelo de ratón es la falta de herramientas para estudiarlo.
Aquí proporcionamos un nuevo protocolo, que contiene una digestión enzimática confiable y tinción de anticuerpos. Lo que nos permite clasificar con éxito los progenitores fibro-adipogénicos y cultivarlos in vitro para un análisis más detallado de su destino. Hemos probado varias combinaciones y concentraciones de enzimas, así como múltiples anticuerpos, y nuestro método proporciona referencias para el protocolo más fiable y robusto.
Como ahora tenemos una digestión enzimática confiable, continuaremos probando otros marcadores y anticuerpos para analizar con éxito las células endoteliales, los pericitos, las células inmunitarias y las células miogénicas.
Descripción general
Este protocolo describe el aislamiento de progenitores fibroadipogénicos (FAPs) del músculo esquelético y cardíaco de ratones espinosos (Acomys) mediante disociación enzimática y clasificación de células activadas por fluorescencia. El método proporciona una digestión enzimática confiable y una tinción con anticuerpos para la clasificación eficaz y el cultivo in vitro de FAPs.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Biología celular
- Medicina regenerativa
- Investigación con células madre
Antecedentes
- Comprender la comunicación y el comportamiento celular es fundamental para la homeostasis tisular.
- Los precursores fibroadipogénicos desempeñan un papel importante en la reparación del tejido.
- El modelo del ratón espinoso presenta desafíos únicos debido a la escasez de herramientas de investigación.
- Se necesitan protocolos confiables para estudiar los FAP en este modelo.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un protocolo robusto para el aislamiento de FAP a partir de ratones espinosos.
- Posibilitar el análisis adicional de la diferenciación de FAP hacia miofibroblastos y adipocitos.
- Proporcionar una base para el estudio de otros tipos celulares en el modelo del ratón espinoso.
Métodos Utilizados
- Disociación enzimática del tejido muscular.
- Ordenación celular por fluorescencia (FACS) para el aislamiento de FAP.
- Prueba de diversas combinaciones y concentraciones de enzimas.
- Uso de múltiples anticuerpos para una ordenación eficaz.
Resultados principales
- Aislamiento y expansión exitosos de FAPs a partir de ratones espinosos.
- Las FAPs pueden diferenciarse en miofibroblastos y adipocitos.
- Establecimiento de un protocolo fiable de digestión enzimática.
- Referencias proporcionadas para métodos robustos de tinción con anticuerpos.
Conclusiones
- El protocolo desarrollado mejora el estudio de las FAP en ratones espinosos.
- Estudios futuros pueden explorar marcadores y tipos celulares adicionales.
- Este trabajo contribuye a comprender los mecanismos de reparación tisular.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
El aislamiento y expansión optimizados de progenitores fibroadipogénicos (FAPs) a partir del modelo de ratón espinoso aborda una brecha crítica en la investigación de medicina regenerativa al permitir el estudio robusto de los mecanismos de reparación tisular. Esta capacidad apoya los esfuerzos iniciales de descubrimiento centrados en la comunicación celular, la remodelación de la matriz extracelular y la biología regenerativa comparativa. El protocolo mejora la confianza predictiva en la validación de dianas y la reducción de riesgos mecanicistas para el desarrollo de modelos preclínicos.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite investigar las vías regenerativas y la comunicación celular cruzada en un modelo de mamífero altamente regenerativo.
- Apoya la validación funcional de dianas mediante el aislamiento y la expansión de FAPs para estudios mecanicistas posteriores.
- Facilita la reducción de riesgos biológicos al proporcionar una plataforma para comparar las respuestas regenerativas del ratón espinoso y de Mus musculus.
Desarrollo de ensayos y cribado
- Proporciona poblaciones celulares validadas para ensayos estandarizados in vitro de diferenciación y remodelación de la matriz.
- Mejora la reproducibilidad de los ensayos mediante protocolos robustos de digestión enzimática y clasificación celular basada en anticuerpos.
- Permite la evaluación cuantitativa de las decisiones de destino celular de los FAP bajo condiciones definidas.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Se alinea con sistemas relevantes para la enfermedad al modelar la reparación tisular y la fibrosis en un contexto de mamífero.
- Apoya el descubrimiento traslacional de biomarcadores al permitir estudios comparativos de mecanismos regenerativos.
- Fortalece las decisiones de avance ajustadas al riesgo para carteras de medicina regenerativa.
Integración de la Línea de Procesamiento y Flujo de Trabajo
Este protocolo se integra en la continuidad desde el descubrimiento hasta la fase preclínica al proporcionar un método confiable para aislar y expandir FAPs para estudios mecanicistas, de cribado y traslacionales.
- Biología del Descubrimiento: Avanza en la comprobación de hipótesis sobre el destino celular y la remodelación de la matriz en contextos regenerativos.
- Selección: Proporciona poblaciones celulares reproducibles y bien caracterizadas para el desarrollo de ensayos y la evaluación de compuestos.
- Analítica: Permite la medición cuantitativa de los resultados de diferenciación y la pureza de las poblaciones celulares.
- Investigación Traducional: Facilita la comparación entre especies de los procesos regenerativos y la alineación de biomarcadores.
- Reutilización Empresarial: Establece un protocolo reutilizable para el aislamiento de tipos celulares adicionales a partir del modelo del ratón espinoso.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva en la validación de dianas regenerativas y en estudios mecanicistas.
- Valor operativo: Estandariza los procedimientos de aislamiento y expansión celular para garantizar reproducibilidad y escalabilidad.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance/no avance al reducir la ambigüedad biológica en investigaciones de etapa temprana.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de programas de medicina regenerativa.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en citometría de flujo, disociación enzimática de tejidos y cultivo celular.
- Exige acceso a instrumentación FACS y paneles de anticuerpos validados.
- Necesita la estandarización entre equipos de los protocolos de digestión y tinción para garantizar la reproducibilidad.
- Puede requerir adaptación para otros tipos de tejidos o especies a medida que avanza la investigación.
- Depende de la optimización continua para marcadores celulares y poblaciones adicionales.
Preguntas frecuentes sobre biofármacos
Chapters in this video
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Introduction
1:13
Collection of Skeletal and Cardiac Muscles from Spiny Mouse for Isolating Fibro‐Adipogenic Progenitors (FAPs)
2:46
Digestion of Mouse Skeletal and Cardiac Muscles for Fluorescence‐Activated Cell Sorting and Culture of Fibro‐Adipogenic Progenitors (FAPs)
5:01
Fluorescence‐Activated Cell Sorting and Culture of Fibro‐Adipogenic Progenitors (FAPs)
