Name: Desmitificación de la imagen de bioluminiscencia in vivo de un modelo de ratón de enfermedad de Chagas para estudios de eficacia de fármacos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-05-31T14:20:00.000+00:00
Duration: 7 min 59 s
Description: Aprende a realizar estudios de eficacia de fármacos en un modelo bioluminiscente de infección por Trypanosoma cruzi en ratones. Este método permite el seguimiento no invasivo de la carga parasitaria en tiempo real.

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Los autores agradecen a Amanda Franscisco, John Kelly y Fanny Escudié por proporcionar capacitación y apoyo en BLI en ensayos de eficacia de medicamentos, John Kelly y Simone Calderano por proporcionar parásitos, y Gabriel Padilla por apoyar con los estudios en animales. A.C.S recibió una beca CAPES PSDE para formarse en la London School of Hygiene and Tropical Medicine (Reino Unido). Los autores también desean agradecer a la Plataforma de Citometría de Flujo e Investigación en Imágenes (FLUIR) del Centro de Investigación Científica de la Universidad de São Paulo (CEFAP-USP) por el apoyo técnico en el análisis de los equipos IVIS Spectrum, y al Laboratorio de Genética y Control Sanitario ICB-USP por los ensayos de posexperimentación para el control de calidad de ratones como libres de patógenos específicos. Este proyecto fue financiado por DNDi. DNDi agradece a sus donantes, públicos y privados, que han proporcionado fondos para todas las actividades de DNDi desde su creación en 2003. Una lista completa de los donantes de DNDi se puede encontrar en https://dndi.org/about/donors/.

Protocolo para la evaluación de fármacos en modelo bioluminiscente in vivo de la enfermedad de Chagas

Los autores no tienen conflictos de intereses que declarar.

La imagen de bioluminiscencia es un método innovador que permite la detección de un gen de informe utilizando un espectro visible e infrarrojo de radiación electromagnética. Por lo tanto, no hay necesidad de marcadores radiomarcados para rastrear su espécimen35. BLI es adecuado para modelos de roedores y otras especies pequeñas. Es muy útil para estudios preclínicos porque es más seguro y permite varias rondas de imagen, causando molestias mínimas en los animales. Además, la imagen in vivo es muy flexible debido a la posibilidad de combinar bioluminiscencia, fluorescencia y otras técnicas como la tomografía por emisión de positrones36.
Las imágenes ópticas se rigen por propiedades físicas ópticas, como la absorción y la dispersión. Todos los tejidos absorben y dispersan la luz de longitudes de onda distintas de manera diferente37. Un paso crítico es seleccionar un gen indicador sin tener en cuenta la longitud de onda emitida de la luz producida por la reacción química. Si bien el nivel de expresión de un gen reportero puede ser alto in vitro en los ensayos bioluminiscentes, es posible que no se logren los mismos niveles de expresión cuando se progresa al entorno in vivo. En este protocolo, utilizamos la versión optimizada para codones de Photinus pyralis luciferasa (PpyRE9H)38 desplazada al rojo para tripanosomátidos9, que emite luz a 617 nm, una de las más adecuadas para estudios in vivo 39. Las longitudes de onda superiores a 600 nm son menos absorbidas y dispersadas por los cromóforos endógenos del cuerpo, especialmente la hemoglobina y la melanina. Así, las luces rojas pueden ser transmitidas a través de varios centímetros de tejido, permitiendo que los fotones lleguen a la cámara CCD incluso desde el interior de los tejidos viscerales39,40.
Un área de preocupación en los entornos de imágenes es la falta de una comprensión completa de su función y efectos. El binning, una técnica de preprocesamiento, combina la información adquirida por detectores contiguos en un píxel más grande. Este proceso mejora la relación señal-ruido, reduciendo el ruido de fondo y mejorando la sensibilidad. Sin embargo, disminuye la precisión de la resolución espacial, lo que da como resultado una imagen pixelada41,42. Esta compensación es una consideración importante en su estrategia de imagen.
Basado en el Perfil de Producto Objetivo y el Perfil de Candidato Objetivo para la enfermedad de Chagas34, el estudio de prueba de concepto se centra en la sensibilidad para detectar T. cruzi y ayudar a establecer si un nuevo candidato a fármaco puede lograr una cura estéril (representada por la falta de recaída después de varias rondas de inmunosupresión). Por lo tanto, ejecutamos el BLI utilizando el factor de agrupamiento más alto sin sobresaturar la imagen. Cuando la imagen se sobresatura, se realiza una nueva adquisición utilizando un factor de agrupamiento más bajo. Durante el análisis, se aplica una corrección matemática a las imágenes que requirieron un binning diferente. De esta manera, los datos finales deben presentarse utilizando el mismo binning. En la Tabla 1 se muestran los diferentes valores obtenidos cuando se aplicaron factores de agrupación distintivos en la misma imagen y ROI.
Tabla 1: Influencia de la configuración de agrupación en la cuantificación de BLI. Cuantificación de tres ROIs en la imagen del modelo agudo (d13) y del modelo crónico (d118), analizados en diferentes factores de binning. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66740/DaSilvaetal_Table1_Reviewed.xlsx" target="_blank">Haga clic aquí para descargar esta tabla.</a>
Debido al escenario actual de la enfermedad de Chagas en la clínica, los esfuerzos de descubrimiento de fármacos tienen como objetivo eliminar completamente los parásitos (cura parasitológica)27,34. Por lo tanto, el protocolo preclínico in vivo incluye enfoques que superan las limitaciones de la sensibilidad técnica de BLI. Uno de los enfoques es tratar a los ratones con ciclofosfamida para disminuir la respuesta inmunitaria que controla la carga parasitaria. Otra estrategia es disminuir la profundidad del tejido y eliminar las capas de músculo, piel y pelaje que obstruyen el camino de la luz hacia la cámara. A través del procedimiento ex vivo, se pueden detectar pequeñas manchas bioluminiscentes, revelando focos de parásitos por debajo del umbral BLI in vivo, como se muestra en la Figura 5C en el resultado ex vivo del ratón tratado por Posa.
El diseño de un experimento piloto para evaluar el modelo en sí y la dinámica de la infección es crucial para establecer un experimento preciso para la evaluación de la eficacia de los medicamentos antiparasitarios. Por lo tanto, el investigador podrá definir con anticipación la configuración adecuada de BLI y el curso del tiempo de infección. En un experimento exploratorio, una herramienta que puede ser útil para definir la configuración de adquisición es la 'Autoexposición'. Con esta herramienta, el investigador establece la prioridad de tres configuraciones (Tiempo de exposición, Binning y F/Stop) para obtener la mejor imagen posible. En particular, el investigador debe asegurarse de que las imágenes se adquieran dentro del rango dinámico de la cámara CCD, sin sobresaturación ni subexposición, lo que se puede verificar a través de los límites mínimo y máximo de la escala y la función de exposición automática (Menú Editar > Preferencias > Adquisición de pestañas > Autoexposición de pestañas). En este protocolo, la apertura de la cámara se estableció en el valor máximo (F/Stop: 1), y se definieron diferentes tiempos de exposición y factores de agrupación para modelos agudos y crónicos. Estos ajustes dan previsibilidad al tiempo para realizar diferentes rondas de imágenes simultáneamente. Teniendo en cuenta que el método reportero se basa en una reacción enzimática, tanto la biodistribución del sustrato en el ratón como la cinética de la luciferasa influyen en la señal bioluminiscente y, por tanto, en la cuantificación de la infección (Figura 1B). En consecuencia, la adquisición de imágenes en diferentes momentos de la cinética enzimática introduce una variabilidad de datos que no se puede tener en cuenta ni corregir y afecta al cálculo del flujo total (fotones/segundo) o de la radiación (fotones/segundo/cm2/esteradiano). Además, la infección por T. cruzi muestra un posicionamiento espacial dinámico en ratones (diferentes áreas y tejidos, profundidad y carga parasitaria). Por lo tanto, establecer un valor de los recuentos a adquirir podría pasar por alto las fuentes de señal más débiles (bajo número de parásitos en un determinado punto más profundo del tejido) si la fuente de otra señal más fuerte cumple con los criterios de autoexposición definidos.
Una característica complicada del software Living Image es mostrar la imagen adquirida en una escala de color automática. No existe la opción de preajustar la escala para exhibir automáticamente una imagen adquirida completamente nueva de acuerdo con los valores de escala seleccionados (consulte el paso del protocolo 6.2). Esta situación obliga al investigador a cambiar manualmente las imágenes una por una a los valores máximo y mínimo elegidos. Como consecuencia, los usuarios sin experiencia y no bien entrenados no tienen la lectura adecuada durante la sesión de adquisición, y podrían inducir a error a los datos o perder información importante en ese momento. Para eso, el experimento piloto es beneficioso.
Una de las preguntas más comunes sobre el diseño del experimento de prueba de concepto es cómo elegir la duración del tratamiento y la dosis. En el caso de las nuevas entidades químicas, estos parámetros suelen definirse por la potencia y la selectividad del compuesto in vitro, en combinación con los datos generados por el metabolismo y la farmacocinética del fármaco (DMPK) y los estudios de tolerabilidad realizados antes de las pruebas de eficacia in vivo. En resumen, una vez identificados los compuestos capaces de matar selectivamente al parásito en el interior de las células, se realizan in vitro los primeros experimentos ADME (absorción, distribución, metabolismo y excreción) para estimar la solubilidad acuosa, la permeabilidad celular y la estabilidad metabólica de los compuestos, entre otros parámetros. Si los compuestos muestran un buen equilibrio de propiedades in vitro (generalmente definidas en los perfiles de candidatos objetivo), entonces estos candidatos progresan a estudios de farmacocinética (PK) in vivo en ratones sanos, que describen la exposición al compuesto en la sangre (y posiblemente también en los tejidos) y proporcionan una idea general de la tolerabilidad a diferentes niveles de dosis17. 34,43. Idealmente, el objetivo de la evaluación de la farmacocinética en la mayoría de las enfermedades infecciosas es determinar la viabilidad de alcanzar concentraciones plasmáticas libres (corregidas por la unión a proteínas plasmáticas) que estén por encima de las concentraciones EC50/EC90 44 -la concentración efectiva que mata o al menos inhibe el crecimiento del 50% o el 90% de los parásitos, respectivamente- durante un período de tiempo suficientemente largo. Si se logra una exposición suficiente a un cierto nivel de dosis, entonces este régimen se puede utilizar durante los estudios de eficacia utilizando el modelo BLI de Chagas. En el caso de los estudios de reposicionamiento de fármacos, se debe disponer de datos farmacocinéticos in vitro e in vivo. Un buen comienzo para el reperfilado de fármacos son las bases de datos químicas como PubChem45, que proporcionan datos reconocidos que se pueden convertir en ratones utilizando el escalado alométrico46 para estimar los regímenes de tratamiento seguros y no tóxicos que se van a probar. Sin embargo, no siempre es así. Los estudios de PK siguen siendo un campo pasado por alto en la ciencia académica, y pocas empresas farmacéuticas publican sus resultados de PK. La comunidad científica del descubrimiento de fármacos recomienda incluir la evaluación farmacocinética in vivo junto con los ensayos de eficacia de los fármacos (farmacodinamia)47. Por lo tanto, las imágenes preclínicas son compatibles con las mediciones de compuestos simultáneamente, y este enfoque asociado mejora la solidez de los datos.
Además, se controla la manipulación, el peso y las condiciones de salud de los ratones durante todo el experimento. Los signos de toxicidad y los efectos secundarios, como encorvamiento, temblores, pérdida del equilibrio, falta de voluntad para moverse, renuencia a comer o beber, postración o cualquier otra anomalía presente en el grupo o por condiciones individuales del ratón, deben registrarse e informarse en estudios preclínicos. Uno de los objetivos de las imágenes ópticas es garantizar el bienestar de los animales. Por lo tanto, los criterios de valoración humanitarios deben aplicarse en ratones con signos de dolor descritos en la escala 'Grimace48. Además, los ratones se pesaron semanalmente durante la adquisición de BLI y, con mayor frecuencia, durante la dosificación del fármaco y el tratamiento con CTX. Siguiendo las normas de bienestar animal, los ratones que pierden más del 20% de su peso corporal deben ser sacrificados humanitariamente de inmediato.
El modelo bioluminiscente de T. cruzi es ahora el modelo experimental de última generación para el descubrimiento y desarrollo de nuevos tratamientos para la enfermedad de Chagas. Un modelo que replica las características clave de la infección por T. cruzi y la enfermedad de Chagas49, permitiendo el monitoreo en tiempo real de la parasitemia y la diferenciación de compuestos con variados perfiles de eficacia asociados a modos de acción conocidos. El BLI es una técnica que mejora la asertividad en la identificación de tejidos infectados. Permite la selección precisa de los tejidos infectados para ser utilizada en una amplia gama de enfoques, incluyendo todos los métodos clásicos ya aplicados en la investigación de T. cruzi 50,51. Además, permite a los investigadores explorar tecnologías de vanguardia y desarrollar otras nuevas33. Además, BLI proporciona una mejora del bienestar animal y un uso más racional de acuerdo con los principios de las 3R10,35, todo a la vez.
Varios grupos de investigación centrados en las enfermedades tropicales desatendidas se encuentran en países donde no se dispone de dispositivos de imagen in vivo. Para superar el escenario actual, nuevas redes internacionales como Global BioImaging y sus consorcios asociados promueven acciones para proporcionar acceso abierto a las instalaciones centrales de imagen y mejorar la formación del personal y de los científicos de imagen52,53. Estas iniciativas, junto con protocolos de usuario amigables como este, pueden proporcionar condiciones que democraticen las tecnologías de alta gama para todos los investigadores. La implementación de este método en el descubrimiento preclínico de fármacos ofreció una sólida lectura de eficacia y un valor predictivo de los resultados clínicos, facilitando el descubrimiento de fármacos para la enfermedad de Chagas.

La enfermedad de Chagas es endémica en América Latina y afecta aproximadamente a siete millones de personas en todo el mundo1. Anualmente, más de 50.000 muertes y pérdidas económicas de alrededor de 7 mil millones de dólares son el resultado de la naturaleza incapacitante de esta enfermedad2. La enfermedad de Chagas es causada por el protozoo Trypanosoma cruzi, un parásito hemoflagelado heteroxénico capaz de infectar mamíferos (silvestres y domésticos) y vectores triatominos (Hemiptera, Reduviidae)3 en las Américas, donde se establece la transmisión vectorial. Otras vías de infección importantes son la transfusión de sangre, el trasplante de órganos, la transmisión oral (por la ingestión de alimentos contaminados con un triatomino infectado)4 y la transmisión congénita. Las vías de transmisión no vectorial han contribuido a la diseminación de la enfermedad de Chagas a zonas no endémicas 3,5.
La enfermedad de Chagas se manifiesta en dos fases clínicas. La fase aguda es, en la mayoría de los casos, asintomática. Las infecciones sintomáticas suelen asociarse a signos inespecíficos como fiebre, fatiga, mialgia, linfadenopatías, esplenomegalia y hepatomegalia. La fase aguda también se asocia a menudo con parasitemia patente y circulación sistémica de parásitos. La muerte puede ocurrir hasta en el 10% de los casos diagnosticados, especialmente en los de infección oral6. La fase crónica a menudo se caracteriza por un largo período de ausencia de síntomas. Con el tiempo, aproximadamente un tercio de los pacientes infectados décadas antes presentan manifestaciones cardíacas, generalmente acompañadas de fibrosis e inflamación miocárdica, y/o trastornos gastrointestinales, en su mayoría relacionados con el desarrollo de síndromes de megaesófago y/o megacolon 3,5,6.
El tratamiento etiológico de la enfermedad de Chagas consiste en solo dos fármacos: benznidazol y nifurtimox. Estos agentes antiparasitarios están disponibles desde hace más de 50 años y tienen una toxicidad considerable y una eficacia limitada 5,7,8. En consecuencia, existe una necesidad apremiante de desarrollar tratamientos nuevos, seguros y más eficaces para los pacientes con enfermedad de Chagas.
Técnicas más sofisticadas y precisas permiten ahora obtener respuestas a viejas preguntas que permiten avanzar en la búsqueda de nuevos tratamientos para la enfermedad de Chagas. En este sentido, la comunidad científica se beneficia enormemente de los parásitos modificados genéticamente para estudios in vivo sobre el curso de la infección y evaluación de la eficacia de los fármacos 9,10,11,12. Un ensayo longitudinal basado en el sistema de imágenes de bioluminiscencia (BLI) permite evaluar la eficacia durante y después de la pauta de tratamiento, lo que lleva a la identificación de compuestos con actividad tripanocida10,13. El método BLI proporciona una medición directa de la carga parasitaria, tanto en circulación como en tejidos y órganos, a través de la cuantificación de la luz producida por el linaje11 modificado genéticamente de T. cruzi CL Brener Luc::Neon, que expresa constitutivamente la luciferasa 12 de luciérnagadesplazada al rojo.
Sin embargo, casi 10 años después del establecimiento del modelo animal BLI de la enfermedad de Chagas y de los estudios de eficacia de los fármacos, solo unos pocos grupos de investigación dominan esta técnica. Este hecho se debe no solo al reducido acceso a equipos de imagen adecuados, sino también a la falta de capacitación y disponibilidad de protocolos estructurados y detallados. Este método presenta varias ventajas frente a otros enfoques, que se basan en la evaluación de la parasitemia por microscopía, serología o evaluación de infecciones de órganos/tejidos por qPCR para la detección de ADN del parásito, ya que permite mejorar el bienestar de los ratones y reducir el uso de animales por la posibilidad de generar datos in vivo más robustos e integrados. Además, podría decirse que este método es más sensible, ya que permite la detección rápida de focos de parásitos en órganos viscerales después del tratamiento farmacológico 10,12. Por lo tanto, este protocolo tiene como objetivo orientar a los grupos de investigación en Parasitología y otras enfermedades infecciosas para establecer esta metodología en sus laboratorios detallando los procedimientos técnicos. Aquí, compartimos la experiencia obtenida a través de la implementación del modelo BLI de la enfermedad de Chagas en Brasil, el primero de su tipo en América Latina, como parte de los esfuerzos de descubrimiento de fármacos coordinados por la iniciativa Medicamentos para Enfermedades Desatendidas (DNDi).

<table><tbody><tr><td>BD LSRFortessa&comercio; Analizador de células X-20</td><td>Balanza de pesaje BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(animalario)</td><td>Disponible en varios proveedores</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IVIS Spectrum In Vivo Imaging System</td><td>Revvity (antes PerkinElmer)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software FlowJ v10.7.1</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Living Image Software for Spectrum v4.7.1</td><td>Revvity (antes PerkinElmer)</td><td></td><td>El software de análisis sin licencia llamado 'Aura Imaging' podría usarse para las funciones más básicas proporcionadas por Spectral Instruments Imaging (empresa Bruker) (https://spectralinvivo.com/software/)</td></tr><tr><td>Software de Microsoft Office,</td><td>Microsoft</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism v8.4.0</td>, <td>GraphPad Software Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM Glucosa Baja</td><td>Vitrocell</td><td>D0025</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato de sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761-500G</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino (FBS)</td><td>Gibco</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina 0.5% EDTA</td><td>Gibco</td><td>25300-062</td><td></td></tr><tr><td>LIT medio</td><td>En higromicina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>B (50 mg/mL)</td><td>Gibco</td><td>10687010</td><td></td></tr><tr><td>Grace&prime; s Medio para insectos</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>G9771</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>54457</td><td></td></tr><tr><td>IVISBrite d-luciferina sal potásica</td><td>Revvity (antes PerkinElmer)</td><td>122799</td><td>También se podría utilizar: VivoGlo Luciferin, grado in vivo (Promega/P1043); D-Luciferina, sal monopotásica (Thermo Scientific/88293) o PierceD-luciferina, sal monosódica* (Thermo Scientific/88291); D-Luciferina, Sal de Potasio (GoldBio/LUCK o eLUCK); D-Luciferina, Sal de Sodio* (GoldBio/LUCNA o eLUCNA) *Las diferencias entre la sal de sodio o potasio dependen mínimamente de la solubilidad, sin embargo, no afectan el rendimiento in vivo.&nbsp;</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>21600-044</td><td></td></tr><tr><td>Ciclofosfamida (CTX)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0768-5g</td><td></td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5879</td><td></td></tr><tr><td>(Hidroxipropil)metilcelulosa (HPMC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>09963-25G</td><td></td></tr><tr><td>Alcohol bencílico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>402834</td><td></td></tr><tr><td>Tween 80</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>P1754-1L</td><td></td></tr><tr><td>Benznidazol</td><td>ELEA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Posaconazol (formulación comercial de Noxafil)</td><td>Schering-Phough</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Giemsa</td><td>Disponible en varios proveedores</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aguja de sonda nasogástrica (acero inoxidable recto) - 22GA</td><td>Aton</td><td>&nbsp; CA2003</td><td></td></tr><tr><td>Jeringa de 1 mL y aguja de 31G</td><td>Disponible en varios proveedores</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Jeringa de 1 mL y aguja extraíble de 26G</td><td>Disponible en varios proveedores</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Jeringa de 1 mL y aguja extraíble 24G X&frac34;</td><td>Disponible en varios proveedores</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Jeringa estéril Filtro 0.2 y micro; m</td><td>Disponible de varios proveedores</td><td></td><td></td></tr><tr><td>A4 Papel negro mate de 120 gr o más grueso</td><td>Color del papel/ Canson (Disponible en varios proveedores)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>papel de aluminio</td><td>Disponible en varios proveedores</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cámara de Neubauer</td><td>Disponible en varios proveedores</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

desmitificación de la imagen de bioluminiscencia in vivo de un modelo de ratón de enfermedad de chagas para estudios de eficacia de fármacos

Demystifying In Vivo Bioluminescence Imaging of a Chagas Disease Mouse Model for Drug Efficacy Studies

Para controlar y disminuir el impacto en la salud pública de las enfermedades protozoarias humanas, como la enfermedad de Chagas, la leishmaniasis y la tripanosomiasis africana humana, es necesario acelerar el desarrollo de nuevos medicamentos y vacunas. Sin embargo, este proceso está lleno de dificultades, como la muy compleja biología de los parásitos y la patogénesis de las enfermedades y, como es típico de las enfermedades tropicales desatendidas, la financiación comparativamente limitada para la investigación y el desarrollo. Por lo tanto, los modelos de estudio in vitro e in vivo que puedan reproducir suficientemente las características clave de la infección y la enfermedad y que al mismo tiempo proporcionen un uso racional de los recursos son esenciales para avanzar en la investigación de estas afecciones. Un ejemplo es el modelo de ratón de imágenes de bioluminiscencia (BLI) in vivo para la enfermedad de Chagas, que proporciona una detección altamente sensible de la luz de longitud de onda larga generada por los parásitos Trypanosoma cruzi que expresan luciferasa. A pesar de que esta técnica se ha convertido en el enfoque estándar para los estudios de eficacia de fármacos in vivo , los grupos de investigación aún pueden tener dificultades para implementarla debido a la falta de capacitación práctica adecuada sobre el manejo de equipos y la aplicación de procedimientos de control de calidad, incluso cuando se dispone de equipos BLI adecuados. Teniendo en cuenta este panorama, este protocolo tiene como objetivo guiar desde la planificación de experimentos hasta la adquisición y análisis de datos, con detalles que faciliten la implementación de protocolos en grupos de investigación con poca o nula experiencia con BLI, ya sea para la enfermedad de Chagas o para otros modelos de ratones con enfermedades infecciosas.

Utilizando un modelo de ratón adecuado basado en parásitos transgénicos que expresan constitutivamente luciferasa, es posible reproducir las características clave de la infección humana por T. cruzi causando un daño mínimo al huésped, lo que permite el seguimiento en tiempo real de los parásitos por BLI de cuerpo entero del huésped de manera longitudinal (de por vida), hasta varios meses12.
La Figura 3 muestra un experimento piloto que demuestra el curso temporal de la infección por CL Brener Luc::Neon desde el día 1 después de la infección hasta 150 ppp en ratones BALB/c. En los primeros 20 dpi, la carga parasitaria inferida por bioluminiscencia aumenta, típica del pico de parasitemia, seguido de una fuerte disminución de la carga parasitaria, debido al control inmunológico de los ratones. Así, la fase aguda de la infección se considera los primeros 50 dpi. La fase crónica se define cuando la infección alcanza una tasa bioluminiscente constante, de 100 a 150 ppp.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66740/66740fig03v2.jpg"> Figura 3: Descripción del modelo. Cinética de la infección por Trypanosoma cruzi CL Brener Luc::Neon en ratones BALB/c (n = 11). Panel superior: imágenes bioluminiscentes ventrales y dorsales desde diferentes puntos temporales durante 150 días post-infección (dpi) con 1 x 10³ de tripomastigotes del torrente sanguíneo por inyección intraperitoneal. Escala del mapa de calor (en Log10) de la señal bioluminiscente en radiancia (p/s/cm2/sr). Código de color: Púrpura = 5 x 103; rojo = 1 x 107. Panel inferior: cuantificación de señales bioluminiscentes en flujo total (p/s) de ratones de cuerpo entero. Los datos se expresan como medias (líneas) y desviaciones estándar (regiones sombreadas). Los períodos definidos para las fases aguda y crónica de la infección en este modelo de ratón se resaltan en naranja. Los valores medios de luminiscencia de los ratones no infectados (n = 3) se muestran como umbral (línea gris claro). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66740/66740fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Los resultados terapéuticos también se pueden predecir, ya que las fases principales de la infección se reproducen bien en un modelo de ratón. Por lo tanto, BLI ahora se aplica a la ciencia traslacional a través de estudios de prueba de concepto que respaldan la toma de decisiones sobre el potencial de eficacia de los compuestos y la progresión en la línea de desarrollo10,27. En el modelo agudo de ratón, el tratamiento oral debe comenzar cuando la infección alcanza el pico de parasitemia (alrededor de 14-21 dpi), caracterizado por un alto número de tripomastigotes en el torrente sanguíneo (aproximadamente 1 x 105 tripomastigotes/mL - datos no mostrados) e infección sistémica. En la fase crónica, el tratamiento con ratones comienza a los 100 dpi, cuando la carga parasitaria es comparativamente mucho menor, con parasitemia subpatente estable.
Para demostrar la aplicación del protocolo descrito anteriormente en la evaluación de agentes antiparasitarios, comparamos la eficacia del tratamiento del benznidazol (BZ), el fármaco estándar utilizado para el tratamiento de la enfermedad de Chagas, y el posaconazol (Posa), un inhibidor de la 14α-desmetilasa (CYP51) que fracasó en los ensayos clínicos para la enfermedad de Chagas, y que también ha demostrado ser ineficaz como agente antiparasitario contra T. cruzi in vitro e in vivo, incluyendo en el modelo BLI descrito en este protocolo 13,18,28,29,30.
Para el modelo agudo de ratón, cohortes de 6 ratones por grupo fueron tratadas por vía oral con sonda nasogástrica31 durante 20 días con Posa a 20 mg/kg o BZ a 100 mg/kg, una vez al día. Los ratones también fueron tratados con BZ durante 5 días a 100 mg/kg una vez al día para evaluar el efecto de los tratamientos cortos. Después de la eliminación del compuesto (10 días después de finalizado el tratamiento), los ratones BLI negativos fueron inmunosuprimidos, una condición que promueve la recaída de la infección cuando no se logra una cura parasitológica (Figura 4A). El tratamiento con Posa dio como resultado una reducción del 99,49% ± 0,27% (media ± desviación estándar) en la carga de parásitos inferida por bioluminiscencia al final del tratamiento y se mantuvo en niveles similares de ratones no infectados durante el período de eliminación del compuesto del fármaco (excepto para el ratón #3, con una señal transitoria a 40 ppp, y el ratón #2, que demostró un punto BLI débil a 44 ppp). En comparación con el grupo no tratado, el tratamiento con BZ durante 20 días redujo entre un 100% ± un 0,01% la carga parasitaria inferida por bioluminiscencia al final del tratamiento. Por el contrario, el tratamiento corto con BZ durante 5 días condujo a una reducción del 99,98% ± del 0,03% a 19 ppp (similar al nivel umbral). Sin embargo, en este caso, la reducción de BLI fue transitoria y en las adquisiciones posteriores, todos los ratones presentaron reactivación de la infección (Figura 4B).
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66740/66740fig04v3.jpg"> Figura 4: Diseño del experimento de prueba de concepto y resultados obtenidos con imágenes de bioluminiscencia en el modelo agudo de la enfermedad de Chagas. (A) Gráfico esquemático del proceso de la línea de tiempo en el modelo de ratón de la enfermedad de Chagas aguda para estudios preclínicos para la evaluación de la eficacia del compuesto. Puntos negros: puntos de tiempo de imagen. Frasco de medicamento y barra naranja: inicio y fin del tratamiento, respectivamente. Icono de jeringa: inyecciones de ciclofosfamida. DPI: día después de la infección. Código de color: gris = infección no tratada; naranja = período de tratamiento; azul = fase de eliminación de compuestos; amarillo = período de inmunosupresión. (B) Curso temporal del tratamiento del Trypanosoma cruzi. Panel izquierdo: imágenes de bioluminiscencia ventral de ratones BALB/c (i) no tratados o tratados durante 20 días con (ii) posaconazol (Posa) a 20 mg/kg, (iii) benznidazol (BZ) a 100 mg/kg tratados durante 20 días y (iv) BZ a 100 mg/kg tratados durante 5 días con (n = 6/grupo). Todos los tratamientos se administraron por vía oral por sonda nasogástrica (10 mL/kg) una vez al día. El mapa de calor a escala Log10 indica la intensidad de la señal bioluminiscente desde el nivel más bajo (azul) hasta el más alto (rojo). Gráfico de la derecha: cuantificación de cuerpo entero de datos de imágenes de bioluminiscencia. Los datos se expresan como medias (líneas) y desviaciones estándar (regiones sombreadas). Clave: Matraz de medicamento: inicio del tratamiento (14 dpi); barra naranja: fin del tratamiento (18 ppp/33 ppp); inyectables de ciclofosfamida (a partir del día 44-53); Punto naranja: ratón analizado por procedimiento ex vivo ; § Datos excluidos debido a la fuga de D-luciferina en la orina. (C) Procedimiento ex vivo para la detección de focos de T. cruzi en órganos y tejidos. La clave de distribución de placas se presenta en la parte inferior de la figura (creada con BioRender.com: ZY26LG8AOF). La misma escala de radiación que se muestra en el panel vivo . <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66740/66740fig04largev2.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
En este modelo, el tratamiento antiparasitario puede reducir la carga parasitaria por debajo del límite de detección de BLI de 1000 parásitos. Por lo tanto, los ratones aparecen como BLI negativo10. Para asegurar que se ha logrado una cura parasitológica, es necesario promover la inmunosupresión de ratones mediante el tratamiento con ciclofosfamida29,32. Los ratones que aún tienen una carga parasitaria indetectable después del tratamiento farmacológico se convertirán en BLI positivos después de la inmunosupresión. Este efecto se muestra más ampliamente con el tratamiento con Posa en el modelo agudo, que promueve la recaída del parásito. En este experimento, el procedimiento ex vivo se realizó en ratones con la señal bioluminiscente más baja para evaluar el tropismo del tejido del parásito (Figura 4C). Los ratones no tratados muestran fuertes señales bioluminiscentes, especialmente en el tracto gastrointestinal (TGI) y los tejidos asociados, como la grasa visceral y el mesenterio. Además, la piel fue un sitio asociado con la persistencia del parásito. Los ratones tratados con Posa presentaron manchas bioluminiscentes de menor intensidad que estaban más restringidas al colon, el mesenterio y la grasa visceral. Por otro lado, en ratones tratados con un régimen de tratamiento curativo, como BZ 100 mg/kg durante 20 días, no se detecta ninguna señal bioluminiscente incluso bajo inmunosupresión. Por lo tanto, considerando que después de promover las condiciones para que la señal bioluminiscente se eleve por encima del nivel umbral de 1000 parásitos10, y aumentar la sensibilidad al exponer los órganos viscerales, se considera que BZ 100 mg/kg durante 20 días proporciona una cura estéril. La evaluación de la cura estéril fue validada previamente por diferentes técnicas 10,13,17,33,34.
Un diseño de estudio similar se aplicó al modelo crónico (Figura 5A), en el que los ratones (n = 6/grupo) comenzaron a ser tratados a los 100 días después de la infección. En este punto, se administraron Posa 20 mg/kg, BZ a 100 mg/kg o 10 mg/kg una vez al día por vía oral durante 20 días. Después del período de eliminación del fármaco, los ratones BLI negativos fueron inmunosuprimidos. Además, para evaluar la cura estéril, los ratones que aún eran BLI negativos al final de la fase de inmunosupresión se sometieron a análisis ex vivo .
En la infección crónica, el tratamiento con Posa a 20 mg/kg condujo a una disminución del 95,03% ± del 6,18% en la carga parasitaria inferida por bioluminiscencia al final del tratamiento y se mantuvo en niveles similares a los de los ratones no infectados durante el período de eliminación del fármaco. Después de la inmunosupresión, la mayoría de los ratones mostraron un nivel variable de señal y distribución de BLI (Figura 5B). El procedimiento ex vivo reveló que un ratón BLI negativo para todo el cuerpo tratado con Posa tenía una mancha bioluminiscente en el colon detectable mediante un examen ex vivo (Figura 5C).
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66740/66740fig05v3.jpg"> Figura 5: Diseño del experimento de evaluación de fármacos y resultados obtenidos en el modelo crónico de infección por Trypanosoma cruzi mediante imágenes de bioluminiscencia. (A) Gráfico esquemático del diseño experimental del modelo de ratón con enfermedad de Chagas crónica. Puntos negros: puntos de tiempo de imagen. Frasco de medicamento y barra naranja: inicio y fin del tratamiento, respectivamente. Icono de jeringa: inyecciones de ciclofosfamida. Dpi: día después de la infección. Código de color: Gris = infección no tratada; naranja = período de tratamiento; azul = fase de eliminación de compuestos; amarillo = inmunosupresión; lila = recaída. (B) Evaluación longitudinal de la eficacia del tratamiento en el modelo crónico de la enfermedad de Chagas. Panel izquierdo: BLI ventral de ratones BALB/c (i) no tratados o tratados durante 20 días con (ii) posaconazol (Posa) a 20 mg/kg; (iii) benznidazol (BZ) a 100 mg/kg, y (iv) BZ a 10 mg/kg (n = 6/grupo). Todos los tratamientos se administraron por vía oral por sonda nasogástrica una vez al día. Gráfico de la derecha: suma de los datos brutos de flujo total ventral y dorsal. Clave: matraz de medicamento: inicio del tratamiento (102 dpi); barra naranja: fin del tratamiento (121 dpi); Icono de barra y jeringa amarillas: Inyecciones de ciclofosfamida (a partir del día 131-142). Punto naranja: ratón analizado por procedimiento ex vivo . ! El ratón murió durante la anestesia. <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/66740/66740eq01.jpg" style="margin: auto;"> El ratón muestra anomalías abdominales. La escala del mapa de calor (Log10) indica la intensidad de bioluminiscencia en la unidad de radiancia desde el nivel más bajo (3 × 105 como azul) hasta el nivel más alto (1 × 107 como rojo). (C) Análisis ex vivo del tropismo de T. cruzi en tejido. Detección de bioluminiscencia de órganos extirpados de ratones inmunodeprimidos in vivo BLI negativos después del tratamiento con Posa y BZ a 100 mg/kg o ratones con la señal más baja en los grupos no tratados y BZ a 10 mg/kg. La clave de distribución de placas se muestra en la parte inferior de la figura (creada con BioRender.com: ZY26LG8AOF). La escala de radiancia es igual al panel in vivo . <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66740/66740fig05largev2.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
El tratamiento con BZ a 100 mg/kg redujo la bioluminiscencia a niveles umbral (93,87% ± 2,14%) a 122 ppp y en adelante hasta el final del experimento. Considerando el análisis ex vivo , BZ logró una tasa de curación del 100% (6/6 ratones), ya que ningún ratón presentó un retorno de señal bioluminiscente incluso cuando se examinaron los órganos inmunodeprimidos e internos. Es decir, no hay recaídas. No obstante, el régimen de tratamiento con BZ con una concentración más baja resultó en una ligera reducción de la bioluminiscencia (85,95% ± 18,43%) pero no en curación, ya que los ratones continuaron mostrando focos de señal bioluminiscente detectables en todos los puntos temporales posteriores. Así, este modelo permite diferenciar cuantitativamente entre tratamientos ineficaces (posaconazol y tratamiento subóptimo con benznidazol) y tratamientos eficaces (dosificación óptima y duración del tratamiento con benznidazol).
Figura complementaria 1: Análisis previo a la infección de la expresión de luciferasa en la población de T. cruzi mediante la medición del gen reportero de fluorescencia mNeonGreen. Citometría de flujo de la proteína fluorescente mNeonGreen expresada constitutivamente por el parásito CL Brener Luc::Neon. Histograma normalizado del número de parásitos (eje Y) por intensidad de fluorescencia mNeonGreen (eje X). La leyenda interna muestra la cepa y la forma analizadas, la mediana de fluorescencia y el porcentaje de población de fluorescencia. Las líneas de compuerta se definen por la cepa CL Brener de tipo salvaje (WT) como control no fluorescente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66740/daSilvaetal_Supplemental_Figure%201.zip" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Tabla complementaria 1: Ejemplo de tabla de análisis en la medición de BLI. Los datos brutos obtenidos de la cuantificación de imágenes de bioluminiscencia del día 19 post-infección en el modelo agudo se utilizaron en los resultados representativos que se muestran en la Figura 4B. Descripción de los grupos: Control como ratones no infectados (n = 3/grupo); vehículo como ratones infectados no tratados; posaconazol (Posa) a 20 mg/kg durante 20 días; benznidazol (BZ) a 100 mg/kg durante 20 días; BZ a 100 mg/kg tratado durante 5 días (n = 6/grupo). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66740/daSilvaetal_Supplemental_Table1.zip" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>

El protocolo proporcionado aquí describe los pasos detallados para realizar estudios de eficacia de fármacos en un modelo bioluminiscente de infección por Trypanosoma cruzi , con un enfoque en la adquisición, análisis e interpretación de datos. También se proporcionan procedimientos de solución de problemas y control de calidad para minimizar los problemas técnicos.

Desmitificación de la imagen de bioluminiscencia in vivo de un modelo de ratón de enfermedad de Chagas para estudios de eficacia de fármacos

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Desmitificación de la imagen de bioluminiscencia in vivo de un modelo de ratón de enfermedad de Chagas para estudios de eficacia de fármacos (Video) | JoVE Journal

Desmitificación de la imagen de bioluminiscencia in vivo de un modelo de ratón de enfermedad de Chagas para estudios de eficacia de fármacos

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