Establecimiento de un modelo mínimamente invasivo de embolia pulmonar en ratas mediante coágulos sanguíneos autólogos

El alcance de nuestra investigación es mejorar la confiabilidad y reproducibilidad de los modelos de roedores para la embolia pulmonar que imitan la fisiopatología humana. Nuestro objetivo es responder cómo se utilizan las técnicas mínimamente invasivas para inducir modelos de EP, con la esperanza de que faciliten el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas. Nuestros protocolos generan coágulos sanguíneos autólogos de manera estándar e inducen modelos quirúrgicos de EP en roedores con una invasividad mínima, mejorando así la confiabilidad y reproducibilidad de los experimentos con EP en animales. Hemos revelado que la resolución del coágulo es rápida en roedores. Esto explica por qué es difícil establecer un modelo de hipertensión pulmonar tromboembólica crónica. Las técnicas de visualización de coágulos aquí guiarán el desarrollo de un modelo animal CTAP confiable. Somos un laboratorio conjunto de ingenieros biomédicos y equipos clínicos cardiovasculares. Con este modelo, nuestro laboratorio se centrará en desarrollar nuevas estrategias de prevención tromboembólica y de complicaciones para la EP basadas en soluciones avanzadas a biomateriales.

[Narrador] Para comenzar, coloque al animal anestesiado en la plataforma de operación en posición supina. Extienda ambas cuatro extremidades horizontalmente desde el cuerpo y extienda las extremidades traseras para exponer adecuadamente el área de la ingle. Con cinta médica, asegure al animal en esta posición. Usa una afeitadora eléctrica para afeitar el vello alrededor del esternón y la ingle. Luego unte crema depilatoria sobre el vello residual y desinfecte la piel tres veces con povidona yodada. Inserte una aguja de calibre 27 conectada a una jeringa de un mililitro verticalmente a una profundidad de ocho milímetros para perforar la vena cava craneal izquierda o derecha. Luego sostenga la jeringa y tire suavemente hacia atrás del émbolo para crear una presión negativa dentro del barril. Retire gradualmente la aguja hasta que la sangre fluya. Luego mantenga esa posición hasta que se recolecten 0,3 mililitros de sangre. Para la preparación de coágulos de sangre, empuje la sangre recolectada en un tubo de centrífuga de 1,5 mililitros. Luego extraiga la sangre en el tubo de silicona del generador de trombos de fabricación propia hasta que la columna de sangre tenga 10 centímetros de largo. Espere 30 minutos para permitir que la sangre se coagule. Luego, enjuague la columna de sangre del trombo en una placa de Petri que contenga solución salina normal. Luego, con unas tijeras finas, corte la columna de trombos en coágulos de sangre uniformes, cada uno de cuatro milímetros de largo. Extraiga de 15 a 25 coágulos en el inyector de fabricación propia precargado con dos mililitros de solución salina normal. Después de desinfectar el área quirúrgica de la rata anestesiada, realice una incisión cutánea de cinco milímetros por encima del origen de los vasos epigástricos superficiales en el área de la ingle. Con un microscopio estereoscópico de aumento de 10x, separe una capa delgada de grasa subcutánea para exponer los vasos epigástricos superficiales. Aísle cuidadosamente la vena epigástrica superficial de la arteria, el nervio y el tejido graso. Luego controle el lado distal con un 8-0 sutura estéril y pinza la sutura con una micropinza. Controla el lado proximal con un 8-0 Asa de sutura estéril unida a otra micropinza. Ate el asa distal y corte la vena con un cauterizador. A continuación, haga una pequeña incisión transversal en el lado distal de la vena aislada y enjuague la sangre restante en la luz de la vena con solución salina normal. Una vez que la vena esté despejada, use micropinzas para agrandar la incisión venosa. Para la embolización, inserte suavemente la aguja del inyector de fabricación propia en la vena a través de la incisión de la vena. Asegure la aguja con una tercera pinza para evitar que se salga de la vena. Luego, empuje lentamente el émbolo para administrar una pequeña cantidad de solución salina normal. Continúe empujando el émbolo para administrar coágulos en la vena femoral a través del acceso superficial a la vena epigástrica. Lite la vena con la sutura proximal. Finalmente, sutura la incisión. Después de sacrificar a la rata con sobredosis de isoflurano, corte las costillas con unas tijeras grandes y abra el pecho evitando dañar los pulmones y los vasos grandes. Ahora inserte la aguja del dispositivo de infusión en el ventrículo izquierdo. Abra la válvula del dispositivo de infusión para permitir la infusión de solución salina heparinizada. Con unas tijeras, corte la vena cava inferior y el apéndice izquierdo para permitir el drenaje. Controla la velocidad de perfusión a 50 mililitros por minuto. Después de la perfusión, con una jeringa de 10 mililitros llena de una solución de paraformaldehído al cuatro por ciento, perfore el tronco de la arteria pulmonar a través del ventrículo derecho. Fije el tejido pulmonar realizando una profusión de paraformaldehído al cuatro por ciento a través de los pulmones para un volumen total de 30 mililitros. Para la visualización del árbol arterial pulmonar, agregue una cantidad igual de diluyente al compuesto de fundición de silicona. Después de mezclar la mezcla, agregue un agente de curado al cinco por ciento y mezcle la mezcla nuevamente. Luego extraiga un mililitro de la mezcla en una jeringa de un mililitro. Expulse el aire e inserte la aguja en el tronco de la arteria pulmonar a través del ventrículo derecho. Presione suavemente el émbolo para permitir que la mezcla de fundición de silicona llene el árbol arterial pulmonar. Coloque toda la masa en una placa de Petri antes de guardarla en un refrigerador de cuatro grados centígrados durante la noche para permitir que la mezcla de fundición se cristalice. Sumerja los pulmones secuencialmente en soluciones de alcohol etílico al 25%, 50%, 75%, 95% y 100% cada una durante 24 horas. Sumerja los pulmones deshidratados en salicilato de metilo durante 24 horas. Inmediatamente después de la embolización, los pulmones extraídos mostraron coágulos sanguíneos autólogos y áreas con infarto pulmonar. Una mayor carga de émbolos resultó en un área más grande de infarto pulmonar. En comparación con las muestras pulmonares tomadas inmediatamente después de la embolización, las muestras pulmonares recolectadas 24 horas después de la embolización mostraron áreas infartadas marcadamente disminuidas, lo que indica un fuerte potencial intrínseco de fibrinólisis en ratas. Esta figura muestra el árbol arterial pulmonar después del yeso y la limpieza del tejido para los pulmones normales y para los pulmones de embolia pulmonar.