Preparación de un modelo de pancreatitis aguda grave en ratones mediante una combinación de caeruleina e inyección intraperitoneal de lipopolisacáridos

El tratamiento de la pancreatitis aguda grave es difícil debido a las altas tasas de mortalidad utilizando modelos animales, específicamente ratones con antecedentes seleccionados C57BL / 6J. Estamos investigando SAP como patológico para identificar dianas terapéuticas y desarrollar nuevos tratamientos, proporcionando un método de poliratones en la única investigación de SAP.

Esta investigación descubrió una alta expresión de los genes HMGB1 que lesionaban la pancreatitis, lo que sugiere su asociación con el cálculo inflamatorio de la pancreatitis aguda grave. Nuestro protocolo involucra a la caeruleína para inducir la contracción de la vesícula biliar e interrumpir el ayuno en ratones, lo que provoca daño en el tejido pancreático al bloquear la secreción de líquido digestivo. Combinado con la inyección de LPS, inducimos pancreatitis severa con insuficiencia orgánica en ratones. Este enfoque no es invasivo y es fácil de implementar con ciclos cortos y alta repetibilidad.

[Demostrador] Para comenzar, mida y registre el peso del ratón experimental. Para la inyección intraperitoneal de Caerulein, agarre y sostenga el ratón con el vientre hacia arriba y la cabeza colocada más abajo que la cola. Sostenga la jeringa con la mano derecha e inserte la aguja en la piel subcutánea en el lado izquierdo de la línea blanca abdominal. Mueva la aguja hacia adelante aproximadamente de tres a cinco milímetros e insértela en la cavidad abdominal en un ángulo de 45 grados. Mantenga la aguja estacionaria e inyecte lentamente la Caeruleína. Saque la aguja, luego masajee suavemente y presione el lugar de la inyección con un hisopo de algodón estéril para difundir completamente el medicamento en la cavidad abdominal. 12 horas después de la inyección, coloque el ratón en el centro de la cuadrícula en la caja experimental de espaldas al experimentador. Encienda el software de seguimiento de video y configure el monitoreo para cuatro campos de visión simultáneos. Marque la longitud y el ancho del objeto experimental que puede moverse dentro de la caja en la pantalla de monitoreo en tiempo real. Registre la actividad del mouse durante 15 minutos. Los cambios macroscópicos medidos en el modelo de ratones con lesión pancreática durante los cinco ciclos demostraron que los ratones en el Grupo de Lesión Pancreática 5 mantuvieron un bajo nivel de distancia de movimiento en tres minutos, mientras que la relación de inmovilidad en tres minutos aumentó con cada ciclo posterior. El Grupo de Lesión Pancreática 5 mostró la distancia de movimiento total más pequeña en comparación con los otros grupos experimentales, y la diferencia fue estadísticamente significativa. A excepción del Grupo 1 de Control y Lesión Pancreática, todos los grupos mostraron un crecimiento negativo del peso del valor D, siendo el Grupo 5 de Lesión Pancreática el que mostró el mayor cambio. El análisis de la tasa de supervivencia indicó una tasa de mortalidad del 80% en el Grupo de Lesión Pancreática 5 al quinto día, a diferencia de los otros grupos que no mostraron diferencias significativas con el Control. Después de 36 horas de inyección intraperitoneal de Caeruleína, eutanasia y asegure al ratón en posición supina sobre una placa de espuma. Haga una incisión abdominal mediana y gire el tubo del intestino delgado hacia la derecha para exponer el páncreas. Desconecte el duodeno y el conducto pilórico. Ubique el intestino delgado debajo del páncreas, luego libere completamente el tejido pancreático a lo largo del conducto intestinal. Con unas pinzas desdentadas, sujete el bazo y tire suavemente hacia arriba. Diseccionar bruscamente el tejido del ligamento pancreático posterior hasta la cabeza del páncreas. Luego desconecte el conducto biliar y los vasos sanguíneos. Retire el tejido pancreático de la cavidad abdominal y seque la humedad de la superficie con papel absorbente. Mida y registre el peso del tejido pancreático. Después de preparar secciones de parafina, desencerar los tejidos pancreáticos dos veces en xileno durante cinco minutos cada uno. Tratar cada sección con 100 microlitros de proteinasa K e incubar a 37 grados centígrados durante 20 minutos. Agregue la cantidad requerida de peróxido de hidrógeno al 3% al tejido e incube durante 20 minutos para infiltrarlo por completo. Cubra toda el área de la muestra con 50 microlitros de tampón de equilibrio e incube durante 10 minutos. Luego agregue 56 microlitros de tampón de incubación TDT a cada muestra de tejido e incube durante una hora. Lave las secciones de tejido cuatro veces con PBS durante cinco minutos cada una antes de incubar durante 30 minutos en 100 microlitros de solución de reacción Streptavidin-HRP. Para la tinción de DAB, agregue 50 microlitros de DAB a cada sección de tejido. Sumerja las secciones en una solución de tinción de hematoxilina durante tres a cinco minutos antes de enjuagar con agua pura. Deshidrate las muestras con cuatro rondas de etanol anhidro fresco durante cinco minutos cada una. Realice un examen histológico bajo un microscopio de luz blanca. La tinción de TUNEL en los tejidos pancreáticos de ratones reveló un aumento de la necrosis celular en el Grupo de Lesión Pancreática 5, con valores de escala de grises significativamente más altos y tasas de necrosis positivas en comparación con otros grupos. La inmunotransferencia de proteínas evaluó la expresión de caspasa-3, un marcador de necrosis celular, y mostró un aumento significativo en los tejidos del Grupo 5 de lesión pancreática. La citometría de flujo de suspensiones de células acinares pancreáticas, etiquetada con un CPI de ajuste de Nexin 5, indicó una tasa de muerte celular notablemente mayor en el Grupo de Lesión Pancreática 5 en comparación con otros, con significación estadística.