Name: Monitorización de la apertura de la barrera hematoencefálica en ratas con un sistema de ultrasonido preclínico focalizado (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-13T13:20:00.000+00:00
Duration: 3 min 32 s
Description: Aprende a monitorizar la apertura de la barrera hematoencefálica en ratas mediante ultrasonido focalizado y resonancia magnética. Este protocolo permite controlar la infusión de microburbujas y evaluar la entrega de agentes de contraste de forma precisa.

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Este estudio fue parcialmente apoyado por el Instituto Nacional de Investigación Dental y Craneofacial (NIDCR) K99DE032397, la Subvención de Semillas del Departamento de UCSF (No. 7504831), la subvención RAP de UCSF (PI: Kazim Narsinh, MD) y la Fundación Alemana de Investigación (DFG, GA 3535/1-1).

Todos los experimentos con animales en este estudio fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de California, San Francisco (UCSF). En este estudio se utilizaron ratas macho Sprague-Dawley (200-250 g). Las ratas fueron alojadas y cuidadas de acuerdo con las Pautas de la Oficina de Cuidado y Uso de Animales de los Institutos Nacionales de Salud en ratones y ratas. Los detalles de los reactivos y el equipo utilizado se enumeran en la Tabla de Materiales.
1. Preparación animal
NOTA: Para los procedimientos internos, los animales se transportaron a la sala de preparación y los procedimientos se llevaron a cabo de la siguiente manera:
<ol>
	<li>Coloque las ratas individualmente en una cámara de Lucite y exponga isoflurano (2%-3%) mezclado con oxígeno extraído de un tanque de oxígeno medicinal hasta que estén inconscientes (siguiendo los protocolos aprobados institucionalmente). 
	NOTA: La anestesia con isoflurano permite la implementación de un protocolo de resonancia magnética a largo plazo.</li>
	<li>Retire las ratas de la cámara y afeite el vello de las áreas anterior y posterior del cuello con una crema depilatoria (depilatoria).</li>
	<li>Aplique un ungüento lubricante en los ojos.</li>
	<li>Coloque la nariz en el cono de la nariz para mantener la anestesia con respiración espontánea (vaporizador de isoflurano entre 2%-2,5%, medidor de flujo de oxígeno a 1-1,5 L/min).</li>
	<li>Coloque la rata anestesiada en una mesa quirúrgica caliente y confirme con un pellizco en el dedo del pie. 
	NOTA: El protocolo de resonancia magnética incluía secuencias mejoradas con contraste, como imágenes de eco de gradiente ponderadas en T1 e imágenes de eco de espín ponderadas en T2. Estas secuencias se llevaron a cabo antes y después de la inyección de agentes de contraste basados en gadolinio (GAD) para evaluar la permeabilidad de la barrera hematoencefálica (BBB). Esto implica la administración de agentes de contraste GAD mientras la rata está en un escáner de resonancia magnética7. Para facilitar este proceso, se utilizó un tubo de catéter que se extiende desde el catéter canulado en la rata. La extensión incluyó un conector de catéter y un tubo de polietileno de 30 cm. Para asegurar la permeabilidad y evitar fugas, el tubo de extensión se enjuagó con glicerol heparinizado (250 UI de heparina/1 mL de glicerol).</li>
</ol>
2. Sistema de ultrasonido focalizado guiado estereotácticamente
NOTA: Los animales fueron transferidos y colocados en una mesa en un sistema FUS estereotáctico. La nariz de la rata se colocó en el cono de la nariz para mantener la anestesia. El sistema FUS consta de un generador de funciones, un amplificador de RF y un osciloscopio. Antes de configurar el transductor, nos aseguramos de la correcta conexión de todos los dispositivos con el sistema. La configuración del transductor se completó mediante los siguientes pasos:
<ol>
	<li>Coloque un puntero afilado en la posición del Bregma en el cráneo y guarde la posición. La posición de Bregma se puede identificar señalando la ubicación de 9.0 mm anterior a Lambda en la línea media8. La Lambda se puede encontrar en el centro de la línea entre los tímpanos bilaterales9.</li>
	<li>Coloque gel de ultrasonido en la cabeza de la rata, la bolsa de acoplamiento de agua y el transductor (frecuencia de 1 MHz). Asegúrese de que no haya burbujas de aire entre la piel de la rata, la bolsa de acoplamiento de agua y el transductor.</li>
	<li>Conecte un cable BNC coaxial del transductor a la entrada del módulo del sistema FUS.</li>
	<li>En un ordenador de control) Haga clic en cargar para ver imágenes de ratas preregistradas; Se eligen una serie de puntos focales y presión acústica.</li>
	<li>En un ordenador de control) Haga clic en la prueba de movimiento en el módulo de tratamiento para asegurarse de que el transductor pueda cambiar entre puntos dentro de un período de ráfaga.</li>
	<li>Configure los parámetros de sonicación descritos en el paso 3.</li>
</ol>
3. Infusión de microburbujas y sonicación
<ol>
	<li>Activar la microburbuja. 
	NOTA: La microburbuja utilizada en este estudio se caracterizó por un diámetro de 1,7 μm y una concentración de 0,2 × 109 partículas por mililitro10. El vial de microburbujas se activó en base a las instrucciones de prescripción proporcionadas por el proveedor y un informe publicado anteriormente11.
	<ol>
		<li>Prepare una jeringa de 5 mL con punta Luer Lock y rellénela con 5 mL de inyección de cloruro de sodio al 0,9% sin aditivos.</li>
		<li>Retire la tapa verde y conecte la jeringa a la clavija dispensadora ventilada (consulte la Tabla de materiales) enroscándola en el sentido de las agujas del reloj.</li>
		<li>Retire la protección de la clavija y colóquela en el centro del tapón de goma del vial. Presione firmemente hasta que la punta esté completamente insertada en el tapón.</li>
		<li>Vacíe toda la jeringa de 5 ml en el vial empujando la varilla del émbolo.</li>
		<li>Agite el vial enérgicamente durante 20 s para mezclar todo el contenido. Un líquido blanco y lechoso consistente mostrará que se han formado microesferas lipídicas de hexafluoruro de azufre.</li>
		<li>Para obtener la dosis requerida, invierta la jeringa y extraiga lentamente el volumen previsto de la suspensión en una jeringa de 5 ml.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Utilice una bomba de infusión. 
	NOTA: Se utilizó el enfoque de infusión12 para administrar microburbujas a las ratas utilizando una bomba de jeringa. Se conectó una jeringa que contenía microburbujas a un conector de catéter insertado en la rata. Las microburbujas se transfirieron a través de tubos de polietileno y el caudal de la bomba de infusión se ajustó a 0,66 mL/min. Esta velocidad de infusión permite la inyección de 2 mL de microburbujas de una jeringa de 3 mL durante 3 min. La infusión comenzó antes de la sonicación durante 1 minuto y continuó durante todo el período de sonicación de 2 min.</li>
	<li>Realizar sonicación. 
	NOTA: En este estudio, se eligieron pulsos FUS con los siguientes parámetros: (1) Región diana: hipocampo izquierdo; (2) Número de manchas: 6 para cubrir el hipocampo en el cerebro; (3) Longitud de ráfaga: 10 ms; (4) Período de ráfaga: 1200 ms; (5) Presión acústica: 0,65 MPa; (6) "Modo ráfaga" en el menú del modo de sonicación en el sistema FUS; (7) Tiempo de sonicación: 120 s.</li>
</ol>
4. Procedimiento de resonancia magnética con un escáner preclínico 3T
<ol>
	<li>Después de la sonicación, transfiera los animales a una mesa en un escáner preclínico 3T libre de criógenos.</li>
	<li>Coloca a las ratas en posición prona. Mantenga la temperatura de la almohadilla térmica en el escáner y controle la frecuencia respiratoria mediante un sensor de almohada neumática. Realizar el protocolo de resonancia magnética para evaluar varios tipos de imágenes de resonancia magnética (Tabla 1).</li>
	<li>Incluir otras técnicas de imagen cuantitativa, como la imagen ponderada por difusión (DWI), el mapeo T2*, el mapeo T1 y la resonancia magnética con contraste dinámico (DCE), además de la resonancia magnética con contraste, para demostrar su potencial practicidad para diversos estudios de imagen. Consulte la Tabla 1 para conocer los protocolos de resonancia magnética utilizados en este estudio.</li>
	<li>Inyecte agentes de contraste de resonancia magnética basados en GAD (Gadavist, 1 mmol/kg) después de la secuencia de eco de gradiente de resonancia magnética ponderada en T1 y adquiera imágenes posteriores al GAD 
	NOTA: Para una rata de 200 g, inyectamos 200 μL del agente de contraste para RMN y lo seguimos con una solución salina de 200 μL para enjuagar el tubo.</li>
</ol>
5. Examen macroscópico del cerebro de rata
NOTA: Después de la resonancia magnética, se inyectaron 2 mL de solución azul de Evans (2% diluido con solución salina tamponada con fosfato) y se dejó reposar a la rata durante al menos 30 minutos para permitir que la solución se extendiera y circulara por todo el cuerpo. Posteriormente, las ratas fueron sacrificadas con una sobredosis de isoflurano (5%) para el examen macroscópico del cerebro (siguiendo protocolos aprobados institucionalmente). Para confirmar la eutanasia, se requirió un puñetazo en los dedos de los pies y se observó que el animal cesaba la respiración durante al menos 1 minuto. Se realizó el procedimiento de perfusión, seguido de un examen del cerebro de rata. El procedimiento de perfusión se resume de la siguiente manera:
<ol>
	<li>Realizar una toracotomía con una tijera quirúrgica para exponer los órganos del tórax y visualizar la región cardíaca.</li>
	<li>Incisión (~5 mm) en la aurícula derecha.</li>
	<li>Introducir solución salina en el ventrículo izquierdo con fines de perfusión.</li>
	<li>Abra el hueso del cráneo con unas tijeras quirúrgicas para develar y presentar el cerebro. 
	NOTA: La perfusión adecuada debe dar como resultado una apariencia uniformemente brillante del cerebro, mientras que las áreas azules persistentes indican una fuga de albúmina asociada a la BBB, según lo detectado por el azul de Evans.</li>
</ol>

Enhancing Drug Delivery to the Brain: MRI-Guided Ultrasound Techniques in Rats

<ol><li>Daneman, R., Prat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Blood-Brain+Barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">The Blood-Brain Barrier.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 7 (1), a020412(2015).</li>
<li>Meng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+focused+ultrasound+in+the+brain%3A+from+thermoablation+to+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurol%22%5BJournal%5D)">Applications of focused ultrasound in the brain: from thermoablation to drug delivery.</a> Nat Rev Neurol. 17 (1), 7-22 (2021).</li>
<li>Mungur, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-intensity+focused+ultrasound+technique+in+glioblastoma+multiforme+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Oncology%22%5BJournal%5D)">Low-intensity focused ultrasound technique in glioblastoma multiforme treatment.</a> Frontiers in Oncology. 12, 903059(2022).</li>
<li>Boado, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacokinetics+and+brain+uptake+of+a+genetically+engineered+bifunctional+fusion+antibody+targeting+the+mouse+transferrin+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Pharm%22%5BJournal%5D)">Pharmacokinetics and brain uptake of a genetically engineered bifunctional fusion antibody targeting the mouse transferrin receptor.</a> Mol Pharm. 7 (1), 237-244 (2010).</li>
<li>Hendricks, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+delivery+methods+bypassing+the+blood-brain+and+blood-tumor+barriers%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosurgical+Focus%22%5BJournal%5D)">Novel delivery methods bypassing the blood-brain and blood-tumor barriers.</a> Neurosurgical Focus. 38 (3), E10(2015).</li>
<li>Hynynen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-invasive+MR+imaging-guided+focal+opening+of+the+blood-brain+barrier+in+rabbits%5BTitle%5D)+AND+%22Radiology%22%5BJournal%5D)">Non-invasive MR imaging-guided focal opening of the blood-brain barrier in rabbits.</a> Radiology. 220 (3), 640-646 (2001).</li>
<li>Hynynen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+and+reversible+blood-brain+barrier+disruption+by+non-invasive+focused+ultrasound+at+frequencies+suitable+for+trans-skull+sonications%5BTitle%5D)+AND+%22NeuroImage%22%5BJournal%5D)">Local and reversible blood-brain barrier disruption by non-invasive focused ultrasound at frequencies suitable for trans-skull sonications.</a> NeuroImage. 24 (1), 12-20 (2005).</li>
<li>Yao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-invasive%2C+targeted+creation+of+neuromyelitis+optica+pathology+in+AQP4-IgG+seropositive+rats+by+pulsed+focused+ultrasound%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuropathol+Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Non-invasive, targeted creation of neuromyelitis optica pathology in AQP4-IgG seropositive rats by pulsed focused ultrasound.</a> J Neuropathol Exp Neurol. 78 (1), 47-56 (2019).</li>
<li>Cecyn, M. N., Abrahao, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Where+do+you+measure+the+Bregma+for+rodent+stereotaxic+surgery%5BTitle%5D)+AND+%22IBRO+Neurosci+Rep%22%5BJournal%5D)">Where do you measure the Bregma for rodent stereotaxic surgery.</a> IBRO Neurosci Rep. 15, 143-148 (2023).</li>
<li>Kotopoulis, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SonoVue+vs.+Sonazoid+vs.+Optison%3A+Which+bubble+is+best+for+low-intensity+sonoporation+of+pancreatic+ductal+adenocarcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">SonoVue vs. Sonazoid vs. Optison: Which bubble is best for low-intensity sonoporation of pancreatic ductal adenocarcinoma.</a> Pharmaceutics. 14 (1), 98(2022).</li>
<li>Bracco Diagnostics Inc. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22LUMASON+%28sulfur+hexafluoride+lipid-type+A+microspheres%29+for+injectable+suspension%2C+for+intravenous+use+or+intravesical+use%22">LUMASON (sulfur hexafluoride lipid-type A microspheres) for injectable suspension, for intravenous use or intravesical use</a>. , Lumason - accessdata.fda.gov. (2016).</li>
<li>Lapin, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Consistent+opening+of+the+blood+brain+barrier+using+focused+ultrasound+with+constant+intravenous+infusion+of+microbubble+agent%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Consistent opening of the blood brain barrier using focused ultrasound with constant intravenous infusion of microbubble agent.</a> Sci Rep. 10, 16546(2020).</li>
<li>Vlachos, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Permeability+dependence+study+of+the+focused+ultrasound-induced+blood-brain+barrier+opening+at+distinct+pressures+and+microbubble+diameters+using+DCE-MRI%5BTitle%5D)+AND+%22Magn+Reson+Med%22%5BJournal%5D)">Permeability dependence study of the focused ultrasound-induced blood-brain barrier opening at distinct pressures and microbubble diameters using DCE-MRI.</a> Magn Reson Med. 66 (3), 821-830 (2011).</li>
<li>Singh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+all-ultrasound+cranial+imaging+method+to+establish+the+relationship+between+cranial+FUS+incidence+angle+and+transcranial+attenuation+in+non-human+primates+in+3D%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">An all-ultrasound cranial imaging method to establish the relationship between cranial FUS incidence angle and transcranial attenuation in non-human primates in 3D.</a> Sci Rep. 14 (1), 1488(2024).</li>
<li>Plaksin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetic+resonance+imaging+analysis+predicts+nanoparticle+concentration+delivered+to+the+brain+parenchyma%5BTitle%5D)+AND+%22Commun+Biol%22%5BJournal%5D)">Magnetic resonance imaging analysis predicts nanoparticle concentration delivered to the brain parenchyma.</a> Commun Biol. 5 (1), 1-11 (2022).</li>
<li>Singh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guiding+and+monitoring+focused+ultrasound+mediated+blood-brain+barrier+opening+in+rats+using+power+Doppler+imaging+and+passive+acoustic+mapping%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Guiding and monitoring focused ultrasound mediated blood-brain barrier opening in rats using power Doppler imaging and passive acoustic mapping.</a> Sci Rep. 12 (1), 14758(2022).</li>
</ol>

Los autores no tienen conflictos de intereses relevantes que declarar.

Se ha desarrollado un protocolo y un procedimiento animal utilizando un modelo de rata de cateterismo de la vena yugular para estudios de apertura de BHE. Si bien existen numerosos protocolos preclínicos, este protocolo incorpora un sistema FUS disponible comercialmente y un modelo de rata, lo que minimiza los procedimientos de preparación de animales y, por lo tanto, garantiza la reproducibilidad experimental.
En este protocolo, la selección de microburbujas se basó en su estabilidad y almacenamiento a temperatura ambiente. Otras microburbujas comerciales pueden considerarse como alternativas. Kotopoulis et al. investigaron y compararon varios tipos de microburbujas para la sonoporación de baja intensidad de cánceres de páncreas10. Con base en los resultados in vitro , se encontró que la microburbuja seleccionada en este estudio era la formulación óptima a intensidades más bajas, mientras que otras microburbujas eran más efectivas a intensidades más altas. Sin embargo, las microburbujas más adecuadas para abrir la BHE en un modelo de rata siguen sin estar claras. Vlachos et al.13 investigaron los efectos de la presión acústica y el tamaño de las microburbujas sobre el volumen de la abertura de la BHE y el daño tisular, como la disrupción vascular y el edema. El protocolo sugerido anima a futuros estudios a investigar e identificar los parámetros de microburbujas y sonicación más adecuados para su uso en un modelo de rata.
En este estudio, se seleccionó el sistema FUS preclínico debido a sus capacidades rápidas y precisas para la orientación multipunto. El sistema está programado para atravesar automáticamente puntos focales predefinidos, una característica que facilita la sonicación regional dirigida al área del tejido objetivo. Como alternativa, se pueden emplear transductores de ultrasonido focalizado (FUS) establecidos, como los ofrecidos por Sonic Concepts y ExAblate Neuro (ver Tabla de materiales), para abrir la barrera hematoencefálica14,15. En particular, el transductor ExAblate Neuro está diseñado para ser compatible con las imágenes de RM, proporcionando orientación y supervisión en tiempo real del proceso de tratamiento. En el futuro, estos transductores se pueden integrar en el protocolo desarrollado.
El protocolo de resonancia magnética propuesto incorpora varias secuencias de resonancia magnética para demostrar su potencial práctico para diversos estudios de imágenes. Se recomiendan secuencias de eco de gradiente ponderadas en T1 antes y después del contraste y secuencias de eco de espín ponderadas en T2 para capturar los cambios en la intensidad de la señal inducidos por los agentes de contraste de resonancia magnética de la fuga de BBB. Los usuarios tienen la opción de incluir mapeo DWI, DCE y T2* en su protocolo de imágenes. Como alternativa al uso de un escáner de resonancia magnética, Singh et al.16 introdujeron métodos que utilizan imágenes de ultrasonido Doppler para la localización focal y el mapeo acústico pasivo para detectar la cavitación de microburbujas, que se correlaciona con las regiones abiertas por BBB. Por lo tanto, este protocolo es prometedor para su implementación dentro de un sistema de ultrasonido, presentando una alternativa potencial.
En este estudio se empleó el enfoque de infusión12 , que se refiere a la infusión durante la sonicación. Dado que este enfoque proporciona continuamente microburbujas al cerebro, puede resultar en una apertura más estable y consistente de la BHE en comparación con la infusión en bolo. Lapin et al.12 investigaron la comparación entre los enfoques de infusión y bolo para una apertura consistente de la BHE, encontrando que una tasa de 7,2 μL de microburbuja Definity / kg / min o inferior podría abrir la BHE sin lesiones a varios niveles de presión. Sin embargo, este enfoque puede tener una limitación potencial para mantener la concentración de microburbujas dentro de la jeringa a lo largo del tiempo. Las microburbujas pueden tender a flotar y agregarse en la parte superior de la jeringa, lo que posiblemente cause una disminución en la dosis de microburbujas. Alternativamente, la inyección en bolo de microburbujas se puede realizar en el seno retroorbitario. Los estudios futuros que utilicen el protocolo propuesto deben explorar comparaciones con diferentes métodos y tipos de infusión de microburbujas para optimizar la apertura de la BHE en un modelo de rata.
La limitación de este estudio es la ausencia de validación histoquímica para el daño macroscópico, como los resultados de tinción con hematoxilina y eosina (H&E) o violeta de cristal. Sin embargo, el protocolo propuesto puede utilizarse para optimizar los parámetros de sonicación y resonancia magnética para evitar daños macroscópicos en el cerebro. Además, se pueden incorporar procedimientos para el análisis histopatológico en estudios futuros para abordar esta limitación.

La BBB regula el movimiento de iones, moléculas y células entre los vasos sanguíneos y los tejidos cerebrales1. Esta función permite el mantenimiento de la función neuronal y la salud, al tiempo que evita la entrega de agentes macromoleculares terapéuticos a los tejidos cerebrales. La permeabilidad limitada de la BBB puede resultar en una disminución de la eficacia y efectividad de los tratamientos para tumores cerebrales y enfermedades neurodegenerativas, como la enfermedad de Parkinson, la esclerosis lateral amiotrófica y la enfermedad de Alzheimer2. Por lo tanto, se han investigado varios enfoques, como la administración mejorada por convección, las inyecciones intracraneales directas, la disrupción osmótica y el diseño mejorado de fármacos, para evitar la BBB para la administración controlada de agentes terapéuticos3,4,5.
Sin embargo, estos enfoques tienen limitaciones intrínsecas como la invasividad, el riesgo de infección, el riesgo de hemorragia, la heterogeneidad y el rápido flujo de fármacos. El ultrasonido focalizado pulsado (FUS) de baja intensidad con inyección de microburbujas es una técnica no invasiva prometedora que permite la disrupción localizada y reversible de la BBB. Los efectos mecánicos de los ultrasonidos junto con las microburbujas pueden alterar transitoriamente la permeabilidad de la BBB (es decir, la apertura de la BBB)6,7. Para futuros avances en las aplicaciones de tratamiento que utilizan la apertura de BBB, los experimentos in vivo con animales pequeños son esenciales.
En este estudio, introdujimos protocolos de resonancia magnética y procedimientos con animales para monitorear la apertura de la BHE en un modelo de rata. El protocolo incluyó un modelo de rata con un catéter de vena yugular canulado por una organización comercial (ver Tabla de Materiales). Un modelo de cateterismo de venas yugulares en ratas tiene los beneficios potenciales de la administración rápida de medicamentos, las pruebas de monitoreo hemodinámico y el cateterismo estable. La apertura de la BHE se logró utilizando un sistema FUS preclínico. Diseñado específicamente para la apertura de BBB en modelos de animales pequeños como ratas y ratones, este sistema incorpora componentes esenciales, como un sistema de sobremesa, una computadora de control, un transductor, un desgasificador de agua y los accesorios complementarios. El uso de este sistema FUS preclínico guiado estereotácticamente no solo mejora la precisión, sino que también agiliza los procedimientos con animales y los protocolos de resonancia magnética, lo que contribuye a la reproducibilidad y simplicidad del protocolo experimental general.

<table><tbody><tr><td>Jeringa de 1 mL</td><td>BD plastipak</td><td></td><td></td></tr><tr><td>20 mL, Cloruro de Sodio 0.9%</td><td>Hospira, Inc</td><td>00409-7101-67</td><td></td></tr><tr><td>Jeringa de 3 mL BD</td><td>plastipak</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Jeringa de 5 mL</td><td>BD plastipak</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aguja roma, 21 G</td><td>Tecnologías de infusión SAI</td><td>B21-50</td><td></td></tr><tr><td>Conector de catéter, 21 G</td><td>Infusión SAI tecnologías</td><td>CC-25-25</td><td></td></tr><tr><td>Solución de bloqueo de catéter</td><td>Tecnologías de infusión SAI</td><td>Sku # HGS-10</td><td>(500 &micro;/mL) Glicerol</td></tr><tr><td>Evans</td><td>Blue Sigma aldrich</td><td>E2129-10g</td><td></td></tr><tr><td>ExAblate Neuro</td><td>Insightec Inc., Israel</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gadavist</td><td>Bayer</td><td>2068062</td><td></td></tr><tr><td>GE&nbsp; Vaporizador de isoflurano&nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IPS-12RS Bomba de jeringa</td><td>Inovenso</td><td>IPS-12</td><td></td></tr><tr><td>isoflurano USP</td><td>Vet uno</td><td>501017</td><td></td></tr><tr><td>Lumason microbbuble</td><td>Bracco Diagnostics Inc</td><td>SKJ709700</td><td></td></tr><tr><td>ratas macho Sprague-Dawley (200&ndash; 250 g)&nbsp;</td><td>Aguja de Charles River Laboratories</td><td></td><td></td></tr><tr><td>, 18 G</td><td>BD Precisionglide</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato</td><td>Mediatech</td><td>21-030-CVR</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de polietileno</td><td>BD Intramedic</td><td></td><td></td></tr><tr><td>preclínico 3T libre de criógenos Bruker Biospin scanner&nbsp;</td><td>Ratón Bruker</td><td>Biospec3T</td><td></td></tr><tr><td>con cateterismo de venas yugulares</td><td>Charles River Laboratories</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RK-50&nbsp; transductor de ultrasonido focalizado</td><td>FUS Instruments</td><td>Tx-50-1000-0</td><td></td></tr><tr><td>RK-50 sistema de ultrasonido focalizado de sobremesa</td><td>FUS Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sonic Concepts</td><td>Sonic Concepts Inc., WA, EE. UU.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pasador dispensador ventilado&nbsp;</td><td>B Braun</td><td>4550560</td><td></td></tr></tbody></table>

monitorización de la apertura de la barrera hematoencefálica en ratas con un sistema de ultrasonido preclínico focalizado

Monitoring Blood-Brain Barrier Opening in Rats with a Preclinical Focused Ultrasound System

El cerebro tiene una barrera sanguínea semipermeable altamente selectiva, denominada barrera hematoencefálica (BBB), que impide la entrega de agentes macromoleculares terapéuticos al cerebro. La integración de la ultrasonido focalizado pulsado (FUS) de baja intensidad guiado por RM con la preinyección de microburbujas es una técnica prometedora para la modulación no invasiva y no tóxica de la BBB. La resonancia magnética puede ofrecer un contraste superior de los tejidos blandos y diversas evaluaciones cuantitativas, como la permeabilidad vascular, la perfusión y la distribución espacio-temporal de los agentes de contraste de la resonancia magnética. En particular, se ha demostrado que las técnicas de resonancia magnética con contraste con contraste a base de gadolinio son el estándar de oro para detectar aberturas de BHE. Este estudio describe una metodología integral que involucra protocolos de resonancia magnética y procedimientos con animales para monitorear la apertura de la BHE en un modelo de rata. El modelo de rata proporciona el beneficio adicional de la utilización del catéter de vena yugular, lo que facilita la administración rápida de medicamentos. Un transductor FUS preclínico guiado estereotácticamente facilita el refinamiento y la simplificación de los procedimientos con animales y los protocolos de resonancia magnética. Los métodos resultantes se caracterizan por su reproducibilidad y simplicidad, eliminando la necesidad de conocimientos quirúrgicos especializados. Esta investigación pretende contribuir a la optimización de los procedimientos preclínicos con modelos de ratas y fomentar una mayor investigación sobre la modulación de la BHE para mejorar las intervenciones terapéuticas en los trastornos neurológicos.

Este estudio presenta un protocolo preclínico para monitorear la apertura de la BHE en un modelo de rata utilizando un sistema FUS comercial. El sistema FUS se instaló sobre una mesa o un carro grande (Figura 1). Las ratas fueron anestesiadas con isoflurano mezclado con oxígeno mediante un cono nasal en el marco con el soporte del transductor. Se insertó un hidrófono que resuena a 500 kHz para detectar la cavitación acústica dentro del transductor FUS con una frecuencia resonante de 1,0 MHz.
Como se muestra en la Figura 2, el sistema FUS incluye configuraciones de sonicación y la capacidad de ajustar las posiciones objetivo. Se debe realizar una «prueba de movimiento» para asegurar que el transductor pueda trasladarse entre puntos dentro de un período de ráfaga.
Cuando se abre la BHE, las moléculas de GAD y azul de Evans atraviesan la BHE. La imagen de RM ponderada en T1 captó las alteraciones inducidas por GAD en la intensidad de la señal de RM (Figura 3A). Tras el procedimiento de perfusión, el tejido teñido con azul de Evans fue directamente visible (Figura 3B).
Se realizaron experimentos con tres ratas para demostrar la reproducibilidad de la apertura de la BHE. Figura 4A muestra las imágenes de eco de gradiente ponderadas en T1 tras la sonicación y la administración de GAD. Se observó un aumento significativo en la intensidad de la señal de RM en el blanco a través de los tres experimentos. Las imágenes de RM con contraste dinámico indicaron que el cambio más significativo en la intensidad de la señal ocurrió entre 7 y 8 minutos después de la inyección en bolo del agente de contraste para RM (Figura 4B). Las secuencias de eco de gradiente ponderadas en T1 y de eco de spin ponderadas en T2 mostraron claramente una región de apertura de la BHE, mientras que no se observaron cambios significativos en el mapa de T1 antes de la administración de GAD (Figura 4C).
Los protocolos con animales y de RM propuestos en este estudio demuestran la viabilidad de realizar estudios de imagen por resonancia magnética utilizando un modelo con rata con cateterización de la vena yugular. La imagen de perfusión por RM y/o la imagen de tensor de difusión pueden integrarse en el protocolo para investigar un nuevo biomarcador de RM para detectar la apertura de la BHE.
<img alt="Configuración experimental para imágenes por ultrasonido; incluye transductor de 1 MHz, osciloscopio, soporte para rata y más." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66793/66793fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 1"> 
Figura 1: Sistema preclínico de FUS en banco de trabajo y posicionamiento de la rata. (A) Sistema preclínico de FUS en banco de trabajo. (B) Posicionamiento de la rata dentro del sistema. (C) Transductor de 1 MHz e hidrófono, con el hidrófono colocado en el centro del transductor de FUS. (D) Posicionamiento del transductor y del recipiente de acoplamiento con agua sobre la cabeza de la rata. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66793/66793fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Visualización de los parámetros de sonicación y localización del punto en MRI para el análisis de enfoque de ultrasonido focalizado." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66793/66793fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 2"> 
Figura 2: Interfaz de usuario del software del sistema FUS preclínico. La interfaz de usuario del software del sistema FUS preclínico permite modificar los ajustes de sonicación y las posiciones del blanco. Antes de iniciar la sonicación, se debe realizar la «prueba de movimiento» para asegurar que el transductor pueda desplazarse entre puntos dentro de un período de ráfaga. Esta función mide el tiempo de movimiento del transductor entre puntos sin aplicar sonicación. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66793/66793fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Cortes cerebrales coronales y axiales con muestras reales de R1 y R2 para el análisis comparativo de anatomía." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66793/66793fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 3"> 
Figura 3: Imágenes ponderadas en T1 posteriores a la administración de GAD y regiones cerebrales tras la apertura de la BHE. (A) Imagen ponderada en T1 posterior a la administración de GAD y (B) fotografía del cerebro de rata tras la apertura de la BHE. Las etiquetas R1 y R2 en (A) corresponden a las regiones mostradas en (C). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66793/66793fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Resonancia magnética con contraste dinámico; imagen cerebral de rata; intensidad de señal; ponderado en T1, T2, mapeo de T1." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66793/66793fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 4"> 
Figura 4: Imágenes por resonancia magnética tras la sonicación y la inyección de GAD. (A) Imágenes por resonancia magnética ponderadas en T1 de tres ratas tras la sonicación y la inyección de GAD. (B) Resonancia magnética con contraste dinámico (DCE) de la Rata n.º 3, que muestra los cambios temporales en la intensidad de la señal. El agente de contraste para resonancia magnética basado en GAD se inyectó en el momento indicado por la flecha roja. (C) Imágenes por resonancia magnética ponderadas en T1 y T2, y mapas de T1 de la Rata n.º 3, adquiridas antes de la inyección del agente de contraste GAD. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66793/66793fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.</a>
<table border="1" fo:font-size="8px" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>2D DWI</td>
			<td>Cor 2D</td>
			<td>Cor 2D mapa T1</td>
			<td>Cor 2D</td>
			<td>Cor 2D</td>
			<td>Cor 2D DCE (Bolo 1)</td>
			<td>Cor 2D</td>
			<td>Cor 2D</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>mapa R2*</td>
			<td></td>
			<td>FLASH pre</td>
			<td>RARE pre</td>
			<td></td>
			<td>FLASH post</td>
			<td>RARE post</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secuencia</td>
			<td>EPI</td>
			<td>GRE</td>
			<td>TSE</td>
			<td>GRE</td>
			<td>TSE</td>
			<td>GRE</td>
			<td>GRE</td>
			<td>TSE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TR</td>
			<td>2100 ms</td>
			<td>500 ms</td>
			<td>2400, 1600, 1100, 800, 450, 300 ms</td>
			<td>30 ms</td>
			<td>2000 ms</td>
			<td>39.3 ms</td>
			<td>30 ms</td>
			<td>1500 ms</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TE</td>
			<td>22.1 ms</td>
			<td>12 ecos;</td>
			<td>10.29 ms</td>
			<td>5.1 ms</td>
			<td>65 ms</td>
			<td>2.9 ms</td>
			<td>5.1 ms</td>
			<td>65 ms</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>3 - 47 ms</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grosor</td>
			<td>1 mm</td>
			<td>1 mm</td>
			<td>1 mm</td>
			<td>1 mm</td>
			<td>1 mm</td>
			<td>1 mm</td>
			<td>1 mm</td>
			<td>1 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Campo de visión</td>
			<td>40 x 40</td>
			<td>40 x 40</td>
			<td>40 x 40</td>
			<td>40 x 40</td>
			<td>40 x 40</td>
			<td>40 x 40</td>
			<td>40 x 40</td>
			<td>40 x 40</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matriz</td>
			<td>192</td>
			<td>192</td>
			<td>192</td>
			<td>256</td>
			<td>192</td>
			<td>128</td>
			<td>256</td>
			<td>192</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FA (grados)</td>
			<td>90</td>
			<td>60</td>
			<td>90/180</td>
			<td>20</td>
			<td>90/180</td>
			<td>12</td>
			<td>20</td>
			<td>45/180</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Número de cortes</td>
			<td>5</td>
			<td>5</td>
			<td>5</td>
			<td>5</td>
			<td>5</td>
			<td>5</td>
			<td>5</td>
			<td>5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tiempo de adquisición</td>
			<td>4 min 12 s</td>
			<td>3 min 12 s</td>
			<td>10 min 38 s</td>
			<td>2 min 9 s</td>
			<td>1 min 52 s</td>
			<td>8 min 23 s</td>
			<td>3 min 52 s</td>
			<td>1 min 24 s</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opciones</td>
			<td>Segmento 12, 3 direcciones, b = 0, 54, 180, 522 s/mm2</td>
			<td>Número de promedios = 2, espaciado entre ecos = 4 ms</td>
			<td>Espaciado entre ecos 10.3 ms, factor RARA 2</td>
			<td></td>
			<td>Factor RARE 10, promedios 4</td>
			<td>200 µL de agente (Gadavist, 1 mmol/kg)</td>
			<td></td>
			<td>Factor RARE 10, promedios 4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>para rata de 200 g, 1 min pre, 7 min post, inyectar 200 µL/min, 200 µL de solución salina como impulso</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabla 1: Protocolo preclínico de RM a 3T en resonador RM.

Este estudio describe un protocolo combinado de imágenes de resonancia magnética (IRM) y ultrasonido focalizado pulsado (FUS) de baja intensidad, utilizando ratas vivas con cateterismo de venas yugulares para monitorear la apertura de la barrera hematoencefálica (BBB).

Monitorización de la apertura de la barrera hematoencefálica en ratas con un sistema de ultrasonido preclínico focalizado

The brain has a highly selective semipermeable blood barrier, termed the blood-brain barrier (BBB), which prevents the delivery of therapeutic ...

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Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

Microburbujas mediada por la interrupción ultrasonido focalizado de la barrera hemato-encefálica (BHE) es una técnica prometedora para no invasiva la entrega de fármacos en el...

Resonancia magnética guiada por disrupción de la barrera sangre-cerebro con ultrasonido transcraneal Enfocado en un modelo de rata

Este video describe un método para interrumpir temporalmente la barrera hematoencefálica (BBB) mediante la creación de aberturas transitorias utilizando ultrasonido focalizado mediado por microburbujas (FUS). Estas aberturas locales transitorias de la BBB pueden utilizarse con el tiempo para administrar moléculas de fármacos de mayor tamaño directamente en el parénquima cerebral.

Apertura de la barrera hematoencefálica mediada por microburbujas basada en ultrasonidos Focus: una técnica para crear aberturas transitorias localizadas en la barrera hematoencefálica de ratones mediante sonoporación

El ultrasonido enfocado con agentes de microburbuja puede abrir la barrera hematoencefálica de forma focal y transitoria. Esta técnica se ha utilizado para entregar una amplia gama de agentes a través de la barrera hematoencefálica. Este artículo proporciona un protocolo detallado para la entrega localizada al cerebro de roedores con o sin orientación de RMN.

Un enfoque de sobremesa para la ubicación específica de la barrera hematoencefálica que se abre con ultrasonido enfocado en un modelo de rata

La barrera hematoencefálica (BBB) se puede interrumpir temporalmente con ultrasonido enfocado mediado por microburbujas (FUS). Aquí, describimos un protocolo paso a paso para la apertura de BBB de alto rendimiento in vivo utilizando un sistema FUS modular accesible para expertos que no son de ultrasonido.

Un Alto Rendimiento De Imagen Guiada Por Neuronavegación Estereotáctica Y Sistema De Ultrasonido Enfocado Para La Apertura De La Barrera Hematoencefálica En Roedores

Este protocolo delinea los pasos necesarios para la administración de genes a través de la apertura de la barrera hematoencefálica (BBB) por ultrasonido focalizado, la evaluación de la expresión génica resultante y la medición de la actividad de neuromodulación de los receptores quimiogenéticos a través de pruebas histológicas.

Apertura de la barrera hematoencefálica inducida por ultrasonido focalizado para dirigirse a las estructuras cerebrales y evaluar la neuromodulación quimiogenética

Este protocolo describe los procedimientos quirúrgicos y técnicos que permiten imágenes de fluorescencia multifotónica in vivo en tiempo real del cerebro del roedor durante los tratamientos de ultrasonido enfocado y microburbujas para aumentar la permeabilidad de la barrera hematoencefálica.

Microscopía multifotónica intravital en tiempo real para visualizar ultrasonido enfocado y tratamientos de microburbujas para aumentar la permeabilidad de la barrera hematoencefálica

Una técnica se describe en términos generales para la apertura de la barrera sangre-cerebro en el ratón utilizando microburbujas y ultrasonido. Usando esta técnica, el manganeso se puede administrar al cerebro del ratón. Debido a que el manganeso es un agente de contraste de MRI que se acumula en las neuronas despolarizadas, este enfoque permite imágenes de la actividad neuronal.

Neuroimagen Funcional Utilizando ultrasonidos hematoencefálica perturbación de la barrera y la RM-manganeso mayor

Aquí presentamos un ensayo de permeabilidad vascular de cerebro de ratón mediante inyección intraperitoneal de trazadores fluorescentes seguido de perfusión que es aplicable a los modelos animales de disfunción de la barrera blood - brain. Una hemi-cerebro se utiliza para evaluar cuantitativamente la permeabilidad y el otro para tracer visualización/immunostaining. El procedimiento toma 5-6 h por 10 ratones.

Un en Vivo Barrera Blood - brain permeabilidad ensayo en ratones usando fluorescencia etiquetada trazadores

El objetivo general de este procedimiento es proporcionar una técnica muy reproducible para evaluación en vivo de la interrupción de la barrera blood - brain en modelos de rata de accidente cerebrovascular isquémico.

Una evaluación In Vivo de la interrupción de la Barrera Blood - Brain en un modelo de rata de ictus isquémico

Aquí presentamos un protocolo que describe la configuración de un cellulo en BBB (barrera hematoencefálica)-cultura de membrana porosa poliester Minibrain insertar sistema para evaluar el transporte de biomoléculas o agentes infecciosos a través de una BBB humana y sus impacto fisiológico en las células cerebrales vecinas.

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Aprende a monitorizar la apertura de la barrera hematoencefálica en ratas mediante ultrasonido focalizado y resonancia magnética. Este protocolo permite controlar la infusión de microburbujas y evaluar la entrega de agentes de contraste de forma precisa.

Monitorización de la apertura de la barrera hematoencefálica en ratas con un sistema de ultrasonido preclínico focalizado

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