Name: Vitrificación del tejido de la corteza ovárica para lograr un estado vítreo de agregación (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-08-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 53 s
Description: Aprende la vitrificación de tejido de corteza ovárica para preservación de fertilidad en pacientes oncológicas jóvenes. Este método mejora los protocolos de criopreservación y aumenta las probabilidades de embarazos exitosos futuros.

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<meta charset="utf8"></head><body>Evaluación de la viabilidad folicular en tejidos de corteza ovárica humana vitrificada

<table><tbody><tr><td>Viales de 1,8 ml</td><td>VWR International GmbH</td><td>479-6837</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta serológica de 10 ml</td><td>Sarstedt</td><td>86.1254.001</td><td></td></tr><tr><td>Placa de 4 pocillos</td><td>Gynemed</td><td>GYOOPW-FW04</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de 50 mL</td><td>Sarstedt</td><td>62.559.001</td><td></td></tr><tr><td>Placas de 6 pocillos</td><td>Sarstedt</td><td>83.3920</td><td></td></tr><tr><td>Bacillol AF</td><td>Hartmann</td><td>973385</td><td></td></tr><tr><td>Calceína AM</td><td>Merck</td><td>17783</td><td></td></tr><tr><td>Colagenasa tipo 1A</td><td>Merck</td><td>C2674</td><td></td></tr><tr><td>Cryosure DMSO</td><td>WAK Chemie</td><td>WAK-DMSO-10</td><td></td></tr><tr><td>Custodiol</td><td>Dr. Franz K&ouml; hler Chemie</td><td>00867288</td><td></td></tr><tr><td>DPBS CTS</td><td>Gibco Life technologies</td><td>A12856-01</td><td></td></tr><tr><td>ErgoOne ayuda para pipetas</td><td>Starlab</td><td>S7166-0010</td><td></td></tr><tr><td>Etilenglicol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>102466</td><td></td></tr><tr><td>Euronda contenedor de esterilización</td><td>euronda 282021</td><td></td><td></td></tr><tr><td>G-MOPS+</td><td>Vitrolife</td><td>10130</td><td></td></tr><tr><td>Metal mallas</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S0770</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras Metzenbaum</td><td>World Precision Instruments</td><td>501262102</td><td></td></tr><tr><td>N-Bath System</td><td>Nterilizer</td><td>N-Bath 3.0</td><td></td></tr><tr><td>Polivinilpirrolidona (PVP)</td><td>SAGE</td><td>ART-4005</td><td></td></tr><tr><td>Suplemento sustitutivo de suero (SSS)</td><td>Fujifilm Irvine scientific</td><td>99193</td><td></td></tr><tr><td>Vaso</td> <td>estérilSarstedt</td><td>75.562.105</td><td></td></tr><tr><td>Pinza estéril</td><td>Carl Roth</td><td>KL05.1</td><td></td></tr><tr><td>Sacarosa</td><td>Merck</td><td>S0389</td><td></td></tr></tbody></table>

vitrificación del tejido de la corteza ovárica para lograr un estado vítreo de agregación

Vitrification of Ovarian Cortex Tissue to Achieve a Glassy State of Aggregation

Este protocolo presenta los procedimientos para la preparación de medios de vitrificación, dispositivos de carga, vitrificación, preparación de medios de calentamiento rápido, calentamiento rápido y determinación de la viabilidad folicular. Se ha validado y publicado una comparación directa de la viabilidad folicular y los factores angiogénicos entre la congelación lenta y la vitrificación31,32.
El éxito general del protocolo de vitrificación descrito se evaluó comparando el recuento de folículos vitales antes y después de la vitrificación/calentamiento rápido. La configuración experimental se muestra en la Figura 1 y los resultados se presentan en la Figura 6. En 50 pacientes, se observó un recuento medio de 77,98 folículos vitales antes de la vitrificación y de 62,99 después de la vitrificación/calentamiento rápido, lo que refleja una tasa de supervivencia del 80,8%. Esto no fue significativamente diferente según la prueba de Wilcoxon33.
Las rejillas metálicas se personalizan individualmente con tijeras afiladas a un tamaño de 25 mm x 8 mm, que encaja en las tapas de los crioviales de 1,8 mL, como se muestra en la Figura 2A, C. Después de la esterilización mediante autoclave de vapor, las rejillas y tapas de los viales de 1,8 mL se ensamblan bajo un banco de flujo laminar, como se indica en la Figura 2B. Esta configuración proporciona una sujeción segura en la tapa sin necesidad de acciones adicionales y ofrece suficiente área para tejido de varios tamaños. Por lo general, se vitrifican piezas de tejido de 5 mm x 10 mm para el trasplante y piezas de 2 mm de diámetro para evaluar el recuento de folículos vitales después de una descongelación rápida. Ambos tamaños encajan perfectamente en las rejillas metálicas.
El equilibrio con soluciones de vitrificación (VS1, VS2 y VS3) se lleva a cabo en una placa de 6 pocillos en un agitador oscilante a temperatura ambiente debajo de un banco de flujo laminar, como se muestra en la Figura 3. Los plazos del plan garantizan la absorción efectiva del etilenglicol crioprotector. Se recomienda el uso de una placa de 6 pocillos sobre vasos individuales, ya que facilita el movimiento rápido del tejido entre soluciones y ayuda a prevenir confusiones.
Para una vitrificación vertical rápida en nitrógeno líquido, el tejido de la corteza ovárica se corta en trozos adecuados (Figura 4A). Las muestras de corteza ovárica se colocan en dispositivos de carga (Figura 4B, C) y se sumergen verticalmente en nitrógeno líquido (Figura 4D) para lograr un estado vítreo de agregación a través de la vitrificación. Las rejillas metálicas elegidas permiten la manipulación vertical del tejido, como se muestra en la Figura 4D. Además, las rejillas metálicas son altamente conductoras térmicamente, lo que garantiza velocidades de enfriamiento rápidas de 22 °C a -196 °C, lo cual es un paso de importancia crítica en el proceso de vitrificación.
Para un calentamiento rápido, RWS se prepara en un recipiente estéril a 37 °C. ES, RS1 y RS2 se preparan en una placa de 6 pocillos en un agitador oscilante a temperatura ambiente, como se muestra en la Figura 5. El alto volumen de RWS precalentado evita que la solución se enfríe excesivamente con la adición del tejido vitrificado y garantiza un ambiente constantemente cálido para el tejido durante todo el proceso de calentamiento rápido.
Para evaluar y asegurar altos estándares de calidad, los punzones de biopsia de 2 mm x 2 mm se tiñen con calceína antes de la vitrificación y después de un calentamiento rápido para determinar la viabilidad folicular mediante microscopía de fluorescencia34,35 (Figura 6). Los folículos viables emiten fluorescencia verde a 495 nm después de la absorción intracelular de calceína. Alternativamente, la viabilidad folicular (Tabla 3) puede evaluarse utilizando colorantes rojos neutros36.
Siguiendo los pasos descritos en este protocolo, el tejido ovárico se transforma en un estado vítreo de agregación, lo que facilita altas tasas de supervivencia después de un calentamiento rápido, como lo confirma la microscopía de fluorescencia.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66801/66801fig01.jpg"> 
Figura 1: Diseño del estudio. Se examinaron muestras de la corteza ovárica de 50 pacientes antes (frescas) y después de la vitrificación y el calentamiento rápido para determinar el número de folículos viables. Para cada grupo, se cultivaron dos piezas de tejido de 2 mm de diámetro durante 24 h antes de la evaluación del recuento de folículos. El tejido se digirió con colagenasa y se tiñó con calceína para evaluar la viabilidad. El número de folículos viables se determinó mediante un microscopio. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66801/66801fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66801/66801fig02.jpg"> 
Figura 2: Preparación de los dispositivos de carga. Las rejillas metálicas se cortaron a un tamaño de 8 mm x 25 mm (A). Las rejillas metálicas personalizadas se esterilizaron en autoclave (B). A continuación, las rejillas metálicas esterilizadas se insertaron en tapones de viales de 1,8 ml, listos para su uso (C). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66801/66801fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66801/66801fig03.jpg"> 
Figura 3: Preparación de soluciones de vitrificación. Se prepararon soluciones de vitrificación (VS) y se transfirieron a una placa de 6 pocillos. Los pocillos muestran el volumen de cada solución y los tiempos de incubación individuales utilizados en el protocolo de vitrificación. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66801/66801fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66801/66801fig04.jpg"> 
Figura 4: Procesamiento y vitrificación de la corteza ovárica. El tejido de la corteza ovárica se procesó para la criopreservación mediante la extracción de la médula y el corte del tejido en trozos de 5 mm x 10 mm (A). Después de la incubación en las soluciones de vitrificación que se muestran en la Figura 3, el tejido se cargó en el dispositivo de carga de vitrificación (B,C). Para la vitrificación vertical rápida de muestras de corteza ovárica, las tapas con el tejido cargado se insertaron rápidamente en nitrógeno líquido (D) esterilizado. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66801/66801fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66801/66801fig05.jpg"> 
Figura 5: Preparación de soluciones de calentamiento rápido. Se prepararon y transfirieron la solución de calentamiento rápido (RWS), la solución de equilibrio (ES) y las soluciones de enjuague (RS) 1 y 2 a una placa de 6 pocillos. Los recipientes y pocillos muestran el volumen de cada solución y los tiempos de incubación correspondientes. Tenga en cuenta que el RWS se mantiene a 37,2 °C en una placa calefactora. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66801/66801fig05large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66801/66801fig06.jpg"> 
Figura 6: Recuento de viabilidad. Para evaluar el número de folículos viables, se digierieron trozos de tejido de 2 mm de diámetro con colagenasa y se tiñeron con calceína. Las imágenes representativas muestran (A) tinción con calceína de 3 folículos recuperados antes de la vitrificación. (B) Un folículo viable recuperado después de la vitrificación y el calentamiento rápido. (C) Un folículo viable recuperado antes de la congelación lenta. (D) Folículos viables recuperados después de la congelación y descongelación lentas. La viabilidad folicular está indicada por la calceína, un colorante verde fluorescente que emite fluorescencia verde cuando las células viables la convierten enzimáticamente a 495 nm. Barra de escala = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66801/66801fig06large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>VS 1 (15 mL)</td>
			<td>Etilenglicol</td>
			<td>10%</td>
			<td>1,5 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>SSS</td>
			<td>10%</td>
			<td>1,5 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>G-MOPS+</td>
			<td></td>
			<td>12 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VS 2 (15 mL)</td>
			<td>Etilenglicol</td>
			<td>20%</td>
			<td>3 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>SSS</td>
			<td>10%</td>
			<td>1,5 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>G-MOPS+</td>
			<td></td>
			<td>10,5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VS 3 (15 mL)</td>
			<td>Etilenglicol</td>
			<td>35%</td>
			<td>5.25 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>SSS</td>
			<td>10%</td>
			<td>1,5 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Sacarosa</td>
			<td>0,5 mol/L</td>
			<td>2,57 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>PVP</td>
			<td>5 % (p/v)</td>
			<td>0,75 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>G-MOPS+</td>
			<td></td>
			<td>ad 15 mL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabla 1: Composición de las soluciones de vitrificación (VS).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>RWS (30 mL)</td>
			<td>Sacarosa</td>
			<td>0,8 mol/L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>8,22 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>SSS</td>
			<td>10%</td>
			<td>3 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>G-MOPS+</td>
			<td></td>
			<td>ad 30 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ES (15 mL)</td>
			<td>Sacarosa</td>
			<td>0,4 mol/L</td>
			<td>2,05 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>SSS</td>
			<td>10%</td>
			<td>1,5 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>G-MOPS+</td>
			<td></td>
			<td>ad 15 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RS 1 y 2 (15 mL)</td>
			<td>SSS</td>
			<td>10%</td>
			<td>1,5 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>G-MOPS+</td>
			<td></td>
			<td>ad 15 mL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabla 2: Composición de la solución de calentamiento rápido (RWS), la solución de equilibrio (ES) y las soluciones de enjuague (RS). Esta tabla proporciona los componentes y las concentraciones para la solución de calentamiento rápido (RWS), la solución de equilibrio (ES) y las soluciones de enjuague (RS) utilizadas en el procesamiento posterior a la vitrificación.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Parámetro</td>
			<td>Fresco</td>
			<td>Intervalo</td>
			<td>Calentamiento rápido después de la vitrificación</td>
			<td>Intervalo</td>
			<td>n</td>
			<td>*Valor P</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>SD</td>
			<td></td>
			<td>SD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recuento de viabilidad folicular [n]</td>
			<td>77.98</td>
			<td>0-386</td>
			<td>62.99</td>
			<td>0.5-349</td>
			<td>50</td>
			<td>0.130</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>77.95</td>
			<td></td>
			<td>80.02</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>*Prueba de Wilcoxon</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabla 3: Resultados representativos de la viabilidad folicular. Esta tabla presenta los resultados de las evaluaciones de viabilidad folicular antes de la criopreservación y después del calentamiento rápido. Se utilizaron dos piezas de tejido de 2 mm de diámetro por paciente para contar el número de folículos viables antes y después de la vitrificación/calentamiento rápido. Se analizaron muestras de tejido pareado de 50 pacientes mediante la prueba de Wilcoxon.

Vitrificación del tejido de la corteza ovárica para lograr un estado vítreo de agregación

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