Name: Desarrollo de ensayos para el cribado de fármacos de alto rendimiento contra micobacterias (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-25T13:50:00.000+00:00
Duration: 7 min 50 s
Description: Aprende a desarrollar ensayos de cribado de alto rendimiento contra Mycobacterium abscessus utilizando cepas doble reportero y automatización robótica. Este método acelera el descubrimiento de fármacos efectivos contra infecciones resistentes.

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<meta charset="utf8"></head><body>Ensayo de cribado de alto rendimiento para Mycobacterium abscessus mediante reporteros duales

<ol><li>Victoria, L., Gupta, A., Gomez, J. L., Robledo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycobacterium+abscessus+complex%3A+A+review+of+recent+developments+in+an+emerging+pathogen%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Infect+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Mycobacterium abscessus complex: A review of recent developments in an emerging pathogen.</a> Front Cell Infect Microbiol. 11, 659997(2021).</li>
<li>Luthra, S., Rominski, A., Sander, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+antibiotic-target-modifying+and+antibiotic-modifying+enzymes+in+Mycobacterium+abscessus+drug+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The role of antibiotic-target-modifying and antibiotic-modifying enzymes in Mycobacterium abscessus drug resistance.</a> Front Microbiol. 9, 2179(2018).</li>
<li>Nathavitharana, R. R., Strnad, L., Lederer, P. A., Shah, M., Hurtado, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Top+questions+in+the+diagnosis+and+treatment+of+pulmonary+M.+abscessus+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Open+Forum+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Top questions in the diagnosis and treatment of pulmonary M. abscessus disease.</a> Open Forum Infect Dis. 6 (7), ofz221(2019).</li>
<li>Cristancho-Rojas, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidemiology+of+Mycobacterium+abscessus%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Microbiol+Infect%22%5BJournal%5D)">Epidemiology of Mycobacterium abscessus.</a> Clin Microbiol Infect. 30 (6), 712-717 (2024).</li>
<li>Hua, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+repositioning%3A+Progress+and+challenges+in+drug+discovery+for+various+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Drug repositioning: Progress and challenges in drug discovery for various diseases.</a> Eur J Med Chem. 234, 114239(2022).</li>
<li>Doan, T. L., Pollastri, M., Walters, M. A., Georg, G. I. The future of drug repositioning. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDoan%2C+TL+%22Annual+reports+in+medicinal+chemistry%22">Annual reports in medicinal chemistry</a>. Macor, J. E. , Academic Press. 385-401 (2011).</li>
<li>Bento, C. M., Gomes, M. S., Silva, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+antibacterial+drug+screening+methods%3A+Current+prospects+for+mycobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Microorganisms%22%5BJournal%5D)">Evolution of antibacterial drug screening methods: Current prospects for mycobacteria.</a> Microorganisms. 9 (12), 2562(2021).</li>
<li>Attene-Ramos, M. S., Austin, C. P., Xia, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+throughput+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Encycl+Toxicol%22%5BJournal%5D)">High throughput screening.</a> Encycl Toxicol. 3, 916-917 (2014).</li>
<li>Gupta, R., Netherton, M., Byrd, T. F., Rohde, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reporter-based+assays+for+high-throughput+drug+screening+against+Mycobacterium+abscessus%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Reporter-based assays for high-throughput drug screening against Mycobacterium abscessus.</a> Front Microbiol. 8, 2204(2017).</li>
<li>Bento Clara, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+novel+double-reporter+strains+of+Mycobacterium+abscessus+for+drug+discovery%3A+A+study+in+mScarlet%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Spectr%22%5BJournal%5D)">Characterization of novel double-reporter strains of Mycobacterium abscessus for drug discovery: A study in mScarlet.</a> Microbiol Spectr. , e0036224(2024).</li>
<li>Kolbe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+optimization+of+chromosomally-integrated+fluorescent+Mycobacterium+tuberculosis+reporter+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Development and optimization of chromosomally-integrated fluorescent Mycobacterium tuberculosis reporter constructs.</a> Front Microbiol. 11, 591866(2020).</li>
<li>Lopez-Roa, P., Esteban, J., Munoz-Egea, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Updated+review+on+the+mechanisms+of+pathogenicity+in+Mycobacterium+abscessus%2C+a+rapidly+growing+emerging+pathogen%5BTitle%5D)+AND+%22Microorganisms%22%5BJournal%5D)">Updated review on the mechanisms of pathogenicity in Mycobacterium abscessus, a rapidly growing emerging pathogen.</a> Microorganisms. 11 (1), 90(2022).</li>
<li>Bray, M. A., Carpenter, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBray%2C+MA+%22Advanced+assay+development+guidelines+for+image-based+high+content+screening+and+analysis+in+Assay+guidance+manual%22">Advanced assay development guidelines for image-based high content screening and analysis in Assay guidance manual</a>. Markossian, S., et al. , Eli Lilly & Company and the National Center for Advancing Translational Sciences, Bethesda (MD). (2004).</li>
<li>Clinical and Laboratory Standards Institute. Methods for dilution antimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically; approved standard. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22CLSI+document+M07-A10%22">CLSI document M07-A10</a>. , 10th ed, Wayne, PA. (2015).</li>
<li>Silva, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lactoferricin+peptides+increase+macrophages%27+capacity+to+kill+Mycobacterium+avium%5BTitle%5D)+AND+%22mSphere%22%5BJournal%5D)">Lactoferricin peptides increase macrophages' capacity to kill Mycobacterium avium.</a> mSphere. 2 (4), e00301-e00317 (2017).</li>
<li>Bento, C. M., Gomes, M. S., Silva, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Looking+beyond+typical+treatments+for+atypical+mycobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Antibiotics+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Looking beyond typical treatments for atypical mycobacteria.</a> Antibiotics (Basel). 9 (1), 18(2020).</li>
<li>Spizek, J., Rezanka, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lincosamides%3A+Chemical+structure%2C+biosynthesis%2C+mechanism+of+action%2C+resistance%2C+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Lincosamides: Chemical structure, biosynthesis, mechanism of action, resistance, and applications.</a> Biochem Pharmacol. 133, 20-28 (2017).</li>
<li>Hurst-Hess, K. R., Rudra, P., Ghosh, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosome+protection+as+a+mechanism+of+lincosamide+resistance+in+Mycobacterium+abscessus%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Ribosome protection as a mechanism of lincosamide resistance in Mycobacterium abscessus.</a> Antimicrob Agents Chemother. 65 (11), e0118421(2021).</li>
<li>Kang, J. K., Kang, H. K., Hyun, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-inflammatory+effects+of+spiramycin+in+lps-activated+raw+264.7+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Anti-inflammatory effects of spiramycin in lps-activated raw 264.7 macrophages.</a> Molecules. 27 (10), 3202(2022).</li>
<li>Zimmermann, P., Ziesenitz, V. C., Curtis, N., Ritz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immunomodulatory+effects+of+macrolides-a+systematic+review+of+the+underlying+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">The immunomodulatory effects of macrolides-a systematic review of the underlying mechanisms.</a> Front Immunol. 9, 302(2018).</li>
<li>Pradhan, S., Madke, B., Kabra, P., Singh, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-inflammatory+and+immunomodulatory+effects+of+antibiotics+and+their+use+in+dermatology%5BTitle%5D)+AND+%22Indian+J+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Anti-inflammatory and immunomodulatory effects of antibiotics and their use in dermatology.</a> Indian J Dermatol. 61 (5), 469-481 (2016).</li>
<li>Volochnyuk, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+commercially+available+compounds+for+hts%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discov+Today%22%5BJournal%5D)">Evolution of commercially available compounds for hts.</a> Drug Discov Today. 24 (2), 390-402 (2019).</li>
<li>Sritharan, S., Sivalingam, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+review+on+time-tested+anticancer+drug+doxorubicin%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Sci%22%5BJournal%5D)">A comprehensive review on time-tested anticancer drug doxorubicin.</a> Life Sci. 278, 119527(2021).</li>
<li>Arwanih, E. Y., Louisa, M., Rinaldi, I., Wanandi, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resistance+mechanism+of+acute+myeloid+leukemia+cells+against+daunorubicin+and+cytarabine%3A+A+literature+review%5BTitle%5D)+AND+%22Cureus%22%5BJournal%5D)">Resistance mechanism of acute myeloid leukemia cells against daunorubicin and cytarabine: A literature review.</a> Cureus. 14 (12), e33165(2022).</li>
<li>Khasraw, M., Bell, R., Dang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epirubicin%3A+Is+it+like+doxorubicin+in+breast+cancer%3F+A+clinical+review%5BTitle%5D)+AND+%22Breast%22%5BJournal%5D)">Epirubicin: Is it like doxorubicin in breast cancer? A clinical review.</a> Breast. 21 (2), 142-149 (2012).</li>
<li>Schultz, C. W., Nevler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyrvinium+pamoate%3A+Past%2C+present%2C+and+future+as+an+anti-cancer+drug%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedicines%22%5BJournal%5D)">Pyrvinium pamoate: Past, present, and future as an anti-cancer drug.</a> Biomedicines. 10 (12), 3249(2022).</li>
<li>Bailly, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bacterial+thiopeptide+thiostrepton.+An+update+of+its+mode+of+action%2C+pharmacological+properties+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">The bacterial thiopeptide thiostrepton. An update of its mode of action, pharmacological properties and applications.</a> Eur J Pharmacol. 914, 174661(2022).</li>
<li>Kwok, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thiostrepton+selectively+targets+breast+cancer+cells+through+inhibition+of+forkhead+box+m1+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer+Ther%22%5BJournal%5D)">Thiostrepton selectively targets breast cancer cells through inhibition of forkhead box m1 expression.</a> Mol Cancer Ther. 7 (7), 2022-2032 (2008).</li>
<li>Kim, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thiostrepton%3A+A+novel+therapeutic+drug+candidate+for+Mycobacterium+abscessus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Thiostrepton: A novel therapeutic drug candidate for Mycobacterium abscessus infection.</a> Molecules. 24 (24), 4511(2019).</li>
<li>Perry, C. M., Scott, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cefdinir%3A+A+review+of+its+use+in+the+management+of+mild-to-moderate+bacterial+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Drugs%22%5BJournal%5D)">Cefdinir: A review of its use in the management of mild-to-moderate bacterial infections.</a> Drugs. 64 (13), 1433-1464 (2004).</li>
<li>Ramon-Garcia, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repurposing+clinically+approved+cephalosporins+for+tuberculosis+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Repurposing clinically approved cephalosporins for tuberculosis therapy.</a> Sci Rep. 6, 34293(2016).</li>
<li>Kumar, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycobacterium+abscessus+l%2Cd-transpeptidases+are+susceptible+to+inactivation+by+carbapenems+and+cephalosporins+but+not+penicillins%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Mycobacterium abscessus l,d-transpeptidases are susceptible to inactivation by carbapenems and cephalosporins but not penicillins.</a> Antimicrob Agents Chemother. 61 (10), e00866-e00917 (2017).</li>
<li>Alvirez-Freites, E. J., Carter, J. L., Cynamon, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+and+in+vivo+activities+of+gatifloxacin+against+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">In vitro and in vivo activities of gatifloxacin against Mycobacterium tuberculosis.</a> Antimicrob Agents Chemother. 46 (4), 1022-1025 (2002).</li>
<li>Braback, M., Riesbeck, K., Forsgren, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Susceptibilities+of+Mycobacterium+marinum+to+gatifloxacin%2C+gemifloxacin%2C+levofloxacin%2C+linezolid%2C+moxifloxacin%2C+telithromycin%2C+and+quinupristin-dalfopristin+%28synercid%29+compared+to+its+susceptibilities+to+reference+macrolides+and+quinolones%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Susceptibilities of Mycobacterium marinum to gatifloxacin, gemifloxacin, levofloxacin, linezolid, moxifloxacin, telithromycin, and quinupristin-dalfopristin (synercid) compared to its susceptibilities to reference macrolides and quinolones.</a> Antimicrob Agents Chemother. 46 (4), 1114-1116 (2002).</li>
</ol>

Mycobacterium abscessus (Mab) es un patógeno oportunista responsable de infecciones pulmonares, especialmente en personas con fibrosis quística y otros trastornos pulmonares. Las infecciones causadas por el Mab son infamemente difíciles de tratar debido a la exquisita resistencia intrínseca a los medicamentos, comparable a la tuberculosis multirresistente1. Los fármacos disponibles son en gran medida ineficaces debido a la envoltura celular micobacteriana altamente impermeable y a un genoma que codifica varias enzimas que desactivan losantibióticos. Por lo tanto, el tratamiento incluye la combinación de varios medicamentos que tarda meses o años. Este desafiante régimen de múltiples fármacos, combinado con un bajo cumplimiento por parte de los pacientes, da como resultado una tasa de curación promedio del 30 % al 50 %3. Además, la prevalencia de infecciones pulmonares causadas por micobacterias no tuberculosas ha aumentado en las últimas décadas, incluidas las causadas por Mab 1,4. En consecuencia, la comunidad científica está compitiendo para desarrollar nuevos compuestos para tratar las infecciones por Mab.
Una de las estrategias que se persiguen con este objetivo es la reutilización de fármacos, es decir, el proceso de identificación de nuevas oportunidades terapéuticas para los fármacos existentes. De este modo, se evita el mayor reto que acompaña a la fase de descubrimiento y desarrollo de un nuevo fármaco: el tiempo5. Este sencillo concepto aprovecha los perfiles farmacocinéticos y de seguridad ya establecidos de varios fármacos para reducir los costes de desarrollo y acortar el tiempo que se tarda en llevar un fármaco desde el laboratorio hasta la cabecera delpaciente. Por lo tanto, se han compilado bibliotecas que combinan cientos o miles de dichos compuestos, lo que permite a los investigadores probar rápidamente la posibilidad de reutilizar medicamentos contra el patógeno de interés.
La mayoría de los estudios sobre el desarrollo de fármacos contra el Mab se basan en un ensayo tradicional que evalúa la actividad in vitro de un compuesto frente a las micobacterias, es decir, las unidades formadoras de colonias7. A pesar de su precisión, este procedimiento requiere mucho tiempo, y rápidamente se vuelve inviable cuando alguien pretende probar bibliotecas que contienen miles de compuestos. Con este fin, se han integrado en el desarrollo de fármacos cribados de alto rendimiento (HTS), ensayos robustos que aprovechan la robótica y los dispositivos de manipulación de líquidos, lo que permite cribar rápidamente miles de compuestos en paralelo8. Por lo general, esto se hace probando una sola concentración inicialmente, utilizando placas de microtitulación de formatos de 96, 384, 1536 o 3456 pocillos, que actúan como punto de partida para identificar los resultados y optimizarlos aún más en el proceso para su uso clínico.
Los ensayos basados en reporteros proporcionan una ventaja significativa para la robustez de HTS debido a su simplicidad y sensibilidad en comparación con otros ensayos basados en colorantes y absorbancias 7,9. Sin embargo, hasta donde sabemos, solo unos pocos estudios han optimizado un cribado de alto rendimiento contra Mab9.
Recientemente, nuestro laboratorio ha desarrollado cepas reporteras dobles capaces de emitir luminiscencia y fluorescencia10 de forma concomitante. La Mab operon_mScarlet es una de esas variedades. Es autoluminiscente debido a la expresión del operón LuxABCDE , que incluye una luciferasa bacteriana (por expresión de los genes luxAB ) y un sustrato de aldehído de cadena larga (por expresión de los genes luxCDE ). Por otro lado, la lectura fluorescente se obtiene a través de la expresión de una proteína fluorescente roja recientemente desarrollada, mScarlet, que supera a las proteínas eGFP y mCherry más utilizadas, proporcionando una señal más potente11. El uso de esta cepa nos permite evaluar la viabilidad bacteriana en cultivo líquido midiendo la señal luminiscente en un lector de microplacas sin añadir reactivos ni realizar pasos adicionales. En términos de detección, la fluorescencia intrínseca permite la visualización al microscopio en células vivas o fijas sin utilizar colorantes ni anticuerpos. Tener una sola cepa con ambas lecturas proporciona a los investigadores una ventaja significativa cuando se utiliza en ensayos HTS: la variabilidad reducida entre ensayos con diferentes lecturas, ya que no es necesario intercambiar cepas en función de la naturaleza del ensayo.
Por lo tanto, este trabajo desarrolló un ensayo de alto rendimiento contra Mab utilizando una deformación doble reportera diseñada internamente (Figura 1). Esto permitió una evaluación rápida de la actividad in vitro de los fármacos 1280 destinados a la reutilización utilizando una biblioteca comercial (véase la Tabla de Materiales). En primer lugar, las actividades se evaluaron en un ensayo de cultivo en caldo utilizando luminiscencia y, en segundo lugar, utilizando macrófagos infectados con Mab aprovechando la señal fluorescente, emulando mejor el proceso de infección observado in vivo12.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66860/66860fig01v2.jpg"> Figura 1: Resumen gráfico del protocolo establecido. El actor clave en este cribado es una cepa de micobacterias doble reportera desarrollada internamente , que se utiliza en todos los experimentos. En primer lugar, utilizando un dosificador de reactivos y bacterias planctónicas, se realiza un cribado inicial probando los compuestos en una sola concentración. Los resultados identificados continúan en el ensayo de validación, donde se prueban tres concentraciones diferentes. Ambos experimentos se realizan utilizando la lectura luminiscente. Los resultados validados continúan en el ensayo de infección, donde también se prueban tres concentraciones diferentes, y los macrófagos derivados de la médula ósea se infectan en MOI 1. Un sistema de imágenes de alto contenido adquiere la señal fluorescente bacteriana y se utiliza un software de análisis para evaluar la carga intracelular a través de la fórmula Mycoload. El número de compuestos se reduce a medida que aumenta la complejidad del ensayo. Creado con BioRender.com. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66860/66860fig01largev2.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

<table><tbody><tr><td>10% Formalina tamponada neutra</td><td>Bio Optica</td><td>05-01005Q</td><td>solución de fijación</td></tr><tr><td>384 pocillos de polipropileno negro de fondo redondo sin tratar microplaca</td><td>Corning</td><td>3658</td><td>Se pueden utilizar microplacas blancas; se puede utilizar poliestireno</td></tr><tr><td>50 TS Lavadora</td><td>BioTek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Membrana de sellado Breathe-Easy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z380059-1Célula PAK</td><td></td></tr><tr><td>:: explorer</td><td>Revvity</td><td></td><td>robot de manipulación de equipos</td></tr><tr><td>Claritromicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3487-100MG</td><td>Disuelto en DMSO a la concentración deseada</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Fisher Scientific</td><td>D/4121/PB15</td><td>Diluir en medio de crecimiento líquido a la concentración deseada</td></tr><tr><td>Harmony 5.1</td><td>Software de análisis</td><td>Revvity</td><td></td></tr><tr><td>Heracell VIOS 160i CO2 Incubadora, 165 L</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>incubadora de células</td></tr><tr><td>JANUS con brazo de 4 puntas y brazo MDT Manipulador</td> de <td>líquidos</td><td>Revvity</td><td></td></tr><tr><td>KB 8182</td><td>Termaks</td><td>incubadora con</td><td></td> agitación</tr><tr><td>Libra S4+</td><td>Biochrom</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Multidrop&nbsp; Dispensador de reactivos Combi</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Opera Phenix Plus</td><td>Sistema de imagen Revvity</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PhenoPlate</td><td>Revvity</td><td></td><td>6055302 Necesario para microscopios de alto contenido</td></tr><tr><td>Tampón de fosfato solución salina (PBS) 1x</td><td>NA</td><td>NA Solución</td><td>de lavado</td></tr><tr><td>Prestwick Chemical libraries&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Biblioteca química comercial destinada a la reutilización de fármacos</td></tr><tr><td>Incubadora de agitación 3031</td><td>GFL</td><td></td><td></td></tr><tr><td>VICTOR Nivo</td><td>Revvity</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cell culture medium:</td><td></td><td></td><td>Cuando sea necesario, agregue un 10% del suplemento</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>10938-025</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Biowest</td><td>S1810</td><td></td></tr><tr><td>HEPES Solución tampón (1 M)</td><td>Gibco</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>LCCM</td><td>NA</td><td></td><td>NA Medios acondicionados de la línea celular L929 que libera el factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF); suplemento de medio de cultivo celular</td></tr><tr><td>L-glutamina (200 mM)</td><td>Thermo Scientific</td><td>25030024</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato de sodio 100 mM (100X)</td><td>Gibco</td><td>11360-039</td><td></td></tr><tr><td><Solución > lavado fuerte para infecciones</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agua</td><td></td><td></td> apirogénica <td>Múltiples proveedores disponibles</td></tr><tr><td>Solución salina equilibrada de Hank 10x</td><td>Gibco</td><td>14060-040</td><td>Diluir a 1x con agua apirogénica</td></tr><tr><td><fuerte>Solución permeabilizante</></td><td></td><td></td><td>PBS fuerte con 0,1% Triton X100</td></tr><tr><td>PBS 1x</td><td>NA</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Triton X100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>Otros proveedores disponibles</td></tr><tr><td><solución de tinción fuerte></fuerte></td><td></td><td></td><td>PBS con DAPI (500 ng/mL) y HCS Rojo Lejano (10 ng/mL)</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9564</td><td></td></tr><tr><td>HCS Rojo Lejano&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>H32721</td><td></td></tr><tr><td>PBS 1x</td><td>NA</td><td>NA Múltiples</td><td>proveedores disponibles</td></tr><tr><td><fuerte>Crecimiento líquido medio</fuerte></td><td></td><td></td><td>Cuando sea necesario, agregue un 10% de suplemento</td></tr><tr><td>Middlebrook 7H9 Caldo</td><td>BD Difco</td><td>271310</td><td></td></tr><tr><td>Tween80</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4780</td><td>0.05% concentración final. Otros proveedores disponibles</td></tr><tr><td><fuerte>Suplemento líquido del medio de crecimiento:</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP9702-100</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucosa anhidra</td><td>Fisher Scientific</td><td>G/0450/60</td><td></td></tr></tbody></table>

desarrollo de ensayos para el cribado de fármacos de alto rendimiento contra micobacterias

Assay Development for High-Throughput Drug Screening Against Mycobacteria

Evaluación del factor Z' La Figura 2 muestra los datos de uno de los dos experimentos realizados para calcular el factor Z'. El control positivo fue claritromicina a 4 μg/mL. Ambos experimentos arrojaron factores Z' de 0,64 y 0,62, lo que significa que las condiciones y la lectura utilizadas para este ensayo se pueden aplicar al ensayo de cribado posterior (Z' &gt; 0,5). No obstante, se calculó el factor Z' para todos los experimentos restantes (ensayo de infección) para controlar el rendimiento de cada experimento.
Como prueba de concepto del ensayo HTS diseñado, se probó una biblioteca de compuestos destinados a la reutilización de fármacos. Comprende 1280 moléculas diversas y pequeñas, el 95% de las cuales son medicamentos aprobados por la FDA y la EMA. Estas moléculas ofrecen una alta diversidad química y farmacológica.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66860/66860fig02.jpg"> Figura 2: Resultados de la evaluación del factor Z'. Mab a 2,5 x 105 UFC/mL se incubó con y sin claritromicina a 4 μg/mL durante 48 h a 37 °C. Después del período de incubación, se midió la luminiscencia para evaluar la viabilidad de las micobacterias. El gráfico muestra los valores de luminiscencia individuales de las micobacterias viables tratadas y no tratadas en un experimento independiente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66860/66860fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Proyección de éxitos en la biblioteca Todos los compuestos se probaron a 6,66 μM frente a Mab. Debido al tamaño de la biblioteca, los compuestos se dividieron en cuatro placas de 384 pocillos de microtitulación diferentes (Figura 3A-D). Los resultados se normalizaron tanto para el solvente como para el efecto de borde verificado.
En este ensayo de cribado, se identificaron treinta y tres aciertos, treinta de los cuales disminuyeron significativamente la emisión de luminiscencia, reduciendo la viabilidad de las micobacterias (Figura 3). Curiosamente, tres compuestos condujeron a una mayor emisión de luminiscencia, posiblemente relacionada con un mayor metabolismo o proliferación bacteriana (Figura 3). Los 33 resultados se llevaron al ensayo de validación, incluidos los tres compuestos que aumentaron la luminiscencia, para probar si se mantendría este perfil.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66860/66860fig03.jpg"> Figura 3: Resultados del cribado en la biblioteca. (A-D) Mab a 2,5 x 105 UFC/mL se incubó con 1280 compuestos a 6,66 μM durante 48 h a 37 °C. Después de la incubación, se midió la luminiscencia para evaluar la viabilidad de las micobacterias. Los gráficos muestran la RLU de un experimento independiente, presentada como unidades arbitrarias después de la normalización del efecto solvente y del borde. Se calculó la RLU AVG y su SD correspondiente para cada placa para determinar un umbral (en gris; AVG ± 3SD). Los símbolos redondos representan un compuesto probado. En azul, cualquier compuesto fuera de ese umbral se considera un éxito. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66860/66860fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Ensayo de validación de aciertos Las concentraciones utilizadas para este ensayo fueron 13,3 μM, 6,66 μM y 3,3 μM. Cada compuesto se probó por duplicado para aumentar la robustez.
Es importante destacar que los compuestos 30, 31 y 32, previamente asociados con una RLU más alta (Figura 3A, C), mantuvieron este perfil, con más del 200% de viabilidad micobacteriana lograda en los pozos tratados con el compuesto 32 (Figura 4).
Los compuestos 20 y 33 se consideraron inactivos, ya que la viabilidad micobacteriana es cercana al 100% en todas las concentraciones analizadas (Figura 4).
Los compuestos 9 y 21 mostraron una inactividad similar en las dos concentraciones más bajas; sin embargo, a diferencia de 20, permanecen activos en el nivel más alto, 13,3 μM, y el compuesto 21 muestra una mayor potencia (Figura 4).
El compuesto 3 también muestra inactividad en la concentración más baja y una pérdida de actividad a 6,66 μM, aunque menor que el compuesto 21 (Figura 4). Solo en la concentración más baja, los compuestos 2, 7, 8, 10, 16, 18, 24 y 28 mostraron un menor potencial terapéutico. Sin embargo, 2, 10 y 28 aún conducen a un &lt;50% de la viabilidad de las micobacterias.
A nivel mundial, los catorce compuestos restantes estaban activos en todas las concentraciones analizadas.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66860/66860fig04.jpg"> Figura 4: Resultados del ensayo de validación de aciertos. Se incubó Mab a 2,5 x 105 UFC/mL con cada golpe previamente identificado a 13,3 μM, 6,66 μM y 3,3 μM (1,3%, 0,7% y 0,3% de DMSO, respectivamente) durante 48 h a 37 °C. Después del período de incubación, se midió la luminiscencia para evaluar la viabilidad de las micobacterias. El gráfico muestra los porcentajes de micobacterias viables tratadas en relación con las micobacterias no tratadas de un experimento independiente, con cada compuesto probado por duplicado. Los símbolos redondos representan los duplicados de cada compuesto. Las barras representan el promedio de esos duplicados. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66860/66860fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Ensayo de infección De los treinta y tres compuestos probados, se seleccionaron veintiocho para el ensayo de infección (Figura 4). Los compuestos 7, 8, 9, 20 y 33 no fueron seleccionados para este ensayo. Mientras que el 9, el 20 y el 33 quedaron fuera por su inactividad al validarse (Figura 4), los dos primeros quedaron fuera por razones técnicas. Sin embargo, estos compuestos fueron identificados como rifampicina y linezolid, antibióticos ya utilizados para el tratamiento de las infecciones por Mab12. Se identificaron todos los compuestos probados en el ensayo de infección y se enumeran en la Tabla 1. La actividad antimicrobiana de los compuestos contra los macrófagos infectados con Mab se evaluó utilizando la fluorescencia intrínseca de las bacterias como lectura.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Compuesto</td>
			<td>Nombre</td>
			<td>Compuesto</td>
			<td>Nombre</td>
		</tr><tr><td>1</td>
			<td>Sulfathiazol</td>
			<td>18</td>
			<td>Cefuroxima</td>
		</tr><tr><td>2</td>
			<td>Ciprofloxacino</td>
			<td>19</td>
			<td>Rifaximina</td>
		</tr><tr><td>3</td>
			<td>Cefotaxima</td>
			<td>21</td>
			<td>Cefdinir</td>
		</tr><tr><td>4</td>
			<td>Daunorrubicina</td>
			<td>22</td>
			<td>Claritromicina</td>
		</tr><tr><td>5</td>
			<td>Doxorrubicina</td>
			<td>23</td>
			<td>Besifloxacina</td>
		</tr><tr><td>6</td>
			<td>Thiostrepton</td>
			<td>24</td>
			<td>Levofloxacino</td>
		</tr><tr><td>10</td>
			<td>Amikacina</td>
			<td>25</td>
			<td>Rifabutin</td>
		</tr><tr><td>11</td>
			<td>Moxalactama</td>
			<td>26</td>
			<td>Gatifloxacina</td>
		</tr><tr><td>12</td>
			<td>Sulfamethizole</td>
			<td>27</td>
			<td>Epirubicina</td>
		</tr><tr><td>13</td>
			<td>Sulfamonometoxina</td>
			<td>28</td>
			<td>Pamoato de pirvinio</td>
		</tr><tr><td>14</td>
			<td>Cefoxitin</td>
			<td>29</td>
			<td>Moxifloxacina</td>
		</tr><tr><td>15</td>
			<td>Novobiocina</td>
			<td>30</td>
			<td>Troleandomicina</td>
		</tr><tr><td>16</td>
			<td>Cefmetazol</td>
			<td>31</td>
			<td>Lincomicina</td>
		</tr><tr><td>17</td>
			<td>Roxitromicina</td>
			<td>32</td>
			<td>Espiramicina</td>
		</tr></tbody></table>Tabla 1: Lista de los compuestos probados en el ensayo de infección. Los compuestos validados en el paso 4 se probaron en el ensayo de infección (paso 5).
La toxicidad de los compuestos frente a los macrófagos infectados con Mab fue el primer parámetro evaluado. El umbral establecido para considerar un compuesto como tóxico o no tóxico fue del 85% de macrófagos viables (Figura 5). De los veintiocho compuestos analizados, 4, 5, 6, 27 y 28 se consideraron tóxicos. (Figura 5). Por lo tanto, estos cinco compuestos se excluyeron de la siguiente evaluación de actividad intramacrofágica.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66860/66860fig05.jpg"> Figura 5: Toxicidad de Hits hacia macrófagos infectados con Mab. Los ratones BALB/c BMM se infectaron con Mab (MOI=1) y se incubaron con cada golpe previamente identificado a 13,3 μM, 6,66 μM y 3,3 μM (1,3%, 0,7% y 0,3% de DMSO, respectivamente) durante 48 h a 37 °C con 7% de CO2. Las células se observaron en un microscopio de fluorescencia de cribado de alto contenido, utilizando el número de núcleos (teñidos con DAPI) para medir la viabilidad celular. El gráfico muestra los porcentajes de macrófagos infectados viables tratados en relación con los macrófagos infectados viables no tratados de dos experimentos independientes. Los símbolos redondos representan la viabilidad de la célula para cada ensayo. Las barras representan el promedio de dos experimentos independientes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66860/66860fig05large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Para inferir la actividad intramacrofágica de los veintitrés compuestos restantes frente al Mab intracelular (Figura 6), se utilizó la fórmula Mycoload (explicada previamente en el paso 6) para obtener el porcentaje de viabilidad micobacteriana normalizada a los macrófagos infectados no tratados. La mayoría de los compuestos perdieron su potencial terapéutico frente a las micobacterias internalizadas (Figura 6) en comparación con el ensayo de validación de aciertos (Figura 4), ya que el número de aciertos se redujo de veinticinco a seis en la concentración más alta probada. Sorprendentemente, los tres compuestos que aumentaron la viabilidad del Mab planctónico en comparación con las bacterias no tratadas (30, 31 y 32; Figura 3 y Figura 4) mostraron actividad antimicobacteriana frente al Mab intracelular, presentándose los compuestos 30 y 32 una diferencia estadísticamente significativa en comparación con el DMSO, incluso a 3,3 μM en el caso del compuesto 32 (Figura 6). Las micobacterias tratadas con los compuestos 11 y 23 mostraron una viabilidad &lt;50% a 13,3 μM; sin embargo, esto no fue significativamente diferente del control DMSO (Figura 6). Los compuestos 21, 26 y 29 fueron lo suficientemente potentes a 13,3 μM como para justificar una diferencia estadística significativa, siendo 29 el más activo (Figura 6). Por último, los compuestos 17, 22 y 25 fueron extremadamente potentes en todas las concentraciones probadas contra micobacterias internalizadas. Estos se identificaron como roxitromicina, claritromicina y rifabutina, respectivamente (Tabla 1). De los tres compuestos, la claritromicina fue el más activo frente al Mab, con una viabilidad micobacteriana que nunca superó el 10%, presentando un valor p &lt;0,0001 en todas las concentraciones ensayadas en comparación con el DMSO (Figura 6).
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66860/66860fig06.jpg"> Figura 6: Actividad intramacrofágica de Hits frente a macrófagos infectados con Mab. Los BMM de ratones BALB/c se infectaron con Mab (MOI=1) y se incubaron con cada golpe previamente identificado a 13,3, 6,66 y 3,3 μM (1,3, 0,7 y 0,3% de DMSO, respectivamente) durante 48 h a 37 °C con 7% de CO2. Las células se obtuvieron en un microscopio de fluorescencia de cribado de alto contenido y se utilizó la señal fluorescente para calcular la micocarga (véase el paso 6). El gráfico muestra los porcentajes de Mycoload encontrados en los macrófagos infectados tratados en relación con los macrófagos infectados no tratados en dos experimentos independientes. La estadística se realizó mediante ANOVA de dos vías con la prueba de comparación múltiple de Dunnet; *, p &lt; 0,05; **, p &lt; 0,01; , p &lt; 0,001; , p &lt; 0,0001 en comparación con el DMSO (control de disolventes). Los asteriscos siguen el mismo código de color para cada concentración que la leyenda del gráfico. Los símbolos redondos representan la Mycoload para cada ensayo. Las barras representan el promedio de dos experimentos independientes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66860/66860fig06large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Figura complementaria 1: Ejemplo de un diseño de placa de 384 pocillos utilizado en la evaluación del factor Z'. Blanco: pozos en blanco (solo medio de crecimiento líquido); amarillo - control positivo (bacterias tratadas con un antibiótico); Rojo - control negativo (bacterias no tratadas). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66860/Supplementary%20Figure%201.zip" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Figura complementaria 2: Ejemplo de un diseño de placa de 384 pocillos utilizado en el cribado de la biblioteca. Blanco: pozos en blanco (solo medio de crecimiento líquido); verde - control de solventes; rojo - control negativo (bacterias no tratadas); Azul: compuestos que se van a examinar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66860/Supplementary%20Figure%202.zip" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Figura complementaria 3: Ejemplo de un diseño de placa de 384 pocillos utilizado para la validación de impactos. Blanco: pozos en blanco (solo medio de crecimiento líquido); verde - control de disolventes (por duplicados); rojo - control negativo (bacterias no tratadas); Azul: compuestos que se van a cribar (por duplicado). Los colores difuminados representan diluciones en serie 1:2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66860/Supplementary%20Figure%203.zip" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Figura complementaria 4: Ejemplo de un diseño de placa de 96 pocillos utilizado para un ensayo de infección. Blanco - pozos en blanco (agua para evitar la evaporación); rojo - control negativo (macrófagos no tratados); amarillo - control positivo (macrófagos tratados con un antibiótico); verde - control de solventes; Azul: compuestos que se van a probar. Los colores difuminados representan diluciones en serie 1:2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66860/Supplementary%20Figure%204.zip" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Figura complementaria 5: Protocolo de análisis de imágenes. En este trabajo se utiliza un protocolo detallado de análisis de imágenes, que puede adaptarse a software de código abierto. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66860/Supplementary%20Figure%205.zip" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>

Desarrollo de ensayos para el cribado de fármacos de alto rendimiento contra micobacterias

Mycobacterium abscessus (Mab) infections are challenging to treat due to high intrinsic drug resistance, comparable to multidrug-resistant tuberculosis. ...

assay-development-for-high-throughput-drug-screening-against

Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Este video muestra un ensayo para evaluar la eficacia de medicamentos contra la infección por Mycobacterium tuberculosis (Mtb). Se genera un modelo de infección in vitro que contiene agregados de Mtb/macrófagos que imita la infección in vivo. Tras la introducción de antibióticos adecuados, su eficacia se prueba mediante un ensayo de resuzarina para controlar la supervivencia de las bacterias con concentraciones crecientes del fármaco.

Un ensayo para evaluar la eficacia de un fármaco frente a un modelo de infección por Mycobacterium tuberculosis

Aquí, se describe un ensayo fenotípico aplicable a las pantallas de alto rendimiento / alto contenido de ARN sintético de interferencia pequeña (siRNA), compuesto químico, y bibliotecas de mutantes de Mycobacterium tuberculosis. Este método se basa en la detección de tuberculosis de la micobacteria fluorescentemente etiquetada dentro de la célula huésped etiquetada fluorescentemente usando microscopia confocal automatizada.

Un Ensayo Fenotípico Microscópico Para La Cuantificación De Micobacterias Intracelulares Adaptadas Para La Detección De Alto Rendimiento / Alto Contenido

Hemos desarrollado un sistema de cribado de alto rendimiento modular para el descubrimiento de nuevos compuestos contra Mycobacterium tuberculosis, la orientación intracelular y en caldo creciente bacterias, así como la citotoxicidad contra la célula huésped de mamífero.

Sistema para la eficacia y la citotoxicidad de detección de inhibidores de focalización intracelular<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

Son muy deseables nuevos modelos y ensayos que mejorarían el proceso de desarrollo temprano de fármacos antituberculosos de próxima generación. Aquí, describimos un ensayo rápido, económico y compatible con BSL-2 para evaluar la eficacia de un fármaco contra Mycobacterium tuberculosis que se puede adaptar fácilmente para el cribado de alto rendimiento.

Un ensayo compatible de alto rendimiento para evaluar la eficacia del fármaco contra los macrófagos a pases<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

Este método describe el uso de infrarrojos sistema colorante formación de imágenes basada para la detección de H1N1 en bronquioalveolar lavado (BAL) de líquidos de los ratones infectados en una alta sensibilidad. Esta metodología se puede realizar en un 96 - o 384-así placa, requiere &lt;10 l de volumen material de prueba y tiene el potencial para el cribado simultáneo de múltiples patógenos.

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Screening de alto rendimiento para los de amplio espectro químico Inhibidores de Virus ARN

Aquí se describe la citotoxicidad celular y ensayos de infectividad redondas individuales que permiten la detección rápida y precisa de los compuestos para determinar su citotoxicidad celular (CC 50) y los valores de IC50 contra WT y VIH-1 resistente drogas.

Detección rápida de la transcriptasa inversa del VIH y inhibidores de la integrasa

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De Alto Rendimiento Cuantitativa en tiempo real RT-PCR ensayo para determinar los perfiles de expresión de los tipos I y III de interferón subtipos

Aprende a desarrollar ensayos de cribado de alto rendimiento contra Mycobacterium abscessus utilizando cepas doble reportero y automatización robótica. Este método acelera el descubrimiento de fármacos efectivos contra infecciones resistentes.

Desarrollo de ensayos para el cribado de fármacos de alto rendimiento contra micobacterias

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