Name: Un enfoque para la construcción de comunidades de biopelículas multiespecies a partir del suelo de la rizosfera (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-05-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 29 s
Description: Aprenda a construir comunidades de biopelículas multiespecies a partir de suelos de rizosfera usando semillas de pepino. Este método estandarizado avanza el desarrollo de biofertilizantes de segunda generación para mejorar el crecimiento vegetal.

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Este trabajo contó con el apoyo financiero de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (42307173 y 42107328) y el Programa Nacional de Investigación y Desarrollo Clave (2022YFD1500202 y 2022YFF1001800). P.W, Z.X diseñó el estudio. P.W, B.X, Z.C, J.X y N.Z analizaron los datos y crearon las cifras. P.W escribió el primer borrador del manuscrito. Z.X., R.Z. y Q.S. revisaron el manuscrito.

Este protocolo es generalmente aplicable a la rizosfera de la microbiota del suelo de diversas plantas. Aquí, el pepino se usa como ejemplo. Los detalles de los reactivos y equipos utilizados para el estudio se enumeran en la Tabla de Materiales.
1. Aislamiento bacteriano
<ol><li>Aislamiento del suelo de la rizosfera<ol><li>Cultivo de pepino<ol><li>Desinfecte las semillas de pepino con una solución de etanol al 75% y hipoclorito de sodio (NaClO) al 2%, luego enjuáguelas con agua estéril11.</li>
			<li>Germinar las semillas en condiciones estériles y seleccionar aquellas que alcancen la etapa de dos hojas12. Posteriormente, trasplante las plántulas de pepino germinadas constantemente a macetas que contengan 2 kg de tierra negra. NOTA: Se utilizan dos tipos de suelo negro de diferentes lugares en el noreste de China para reducir los errores sistemáticos.</li>
		</ol></li>
		<li>Preparación de la suspensión del suelo<ol><li>Prepare el tampón PBS-S utilizando la formulación: 6,33 g de NaH2PO4· H2O, 16,5 g de Na2HPO4·7H2O, 200 μL de Silwet L-77 y 1 L de agua destilada.</li>
			<li>Cuando las plántulas alcancen la etapa12 de cuatro hojas, invierta la maceta y aísle las raíces junto con tierra de rizosfera de 2 mm de espesor con guantes esterilizados.</li>
			<li>Coloque las raíces en 30 mL de tampón PBS-S en un tubo de centrífuga de 50 mL. Después de agitar durante 20 minutos, filtre la suspensión a través de un filtro de celdas de nailon de 100 μm para eliminar las raíces y los sedimentos grandes.</li>
			<li>Transfiera el filtrado a otro tubo de centrífuga de 50 ml, centrifugue a 3200 x g durante 15 min a temperatura ambiente y almacene temporalmente a 4 °C.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Extracción de células bacterianas del suelo de la rizosfera. NOTA: Esta metodología adopta el método de centrifugación diferencial13, aunque el método de centrifugación en gradiente de densidadNycodenz 14 también se aplica para este paso.<ol><li>Diluir la suspensión del suelo con una solución de Na4P2O7 al 0,2% a 500 mL y centrifugar a 1.000 x g durante 10 min para separar inicialmente los organismos del suelo.</li>
		<li>Vuelva a homogeneizar el precipitado, centrifugue a la misma velocidad baja durante 60 s y repita el proceso tres veces. Combine los sobrenadantes, centrifuérrelos a 12.000 x g durante 20 minutos y luego deseche el sobrenadante.</li>
		<li>Resuspender el precipitado en 50 mL de tampón PBS-S, constituyendo la suspensión celular bacteriana del suelo de la rizosfera.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Secuenciación e identificación de la microbiota del biofilm de la rizosfera
<ol><li>Preparación de los medios NOTA: El caldo de soja tríptico (TSB) y el glutamato de glicerol de sales mínimas (MSgg) están disponibles comercialmente. Las formulaciones a continuación son solo para referencia.<ol><li>Prepare el medio TSB utilizando la siguiente formulación: 15 μg/mL de triptona, 5 μg/mL de peptona de soja, 5 μg/mL de NaCl, pH = 7.</li>
		<li>Prepare el medio MSgg utilizando la siguiente formulación: 5 mM KH2PO4, 100 mM de ácido propano sulfónico (MOPS) 3-(N-morfolino), 2 mM MgCl2, 700 μM CaCl2, 50 μM MnCl2, 50 μM FeCl3, 1 μM ZnCl2, 2 μM de tiamina, 0,5% glicerol, 0,5% glutamato, 50 μg/mL de triptófano, 50 μg/mL de fenilalanina, pH = 7.</li>
		<li>Para preparar los medios TSB-MSgg, mezcle los medios TSB con los medios MSgg en una proporción de 1:1 (v/v)15.</li>
	</ol></li>
	<li>Cocultivo de biofilm Pellicle<ol><li>Incubar la suspensión celular en medio TSB a 30 °C durante la noche (normalmente 12 h) para activar las bacterias.</li>
		<li>Coloque filtros de celdas de nailon de 100 μm en placas de 24 pocillos. Incube las bacterias en medios TSB y establezca tres repeticiones. Cultivar el biofilm de la película durante 36 h a 30 °C. NOTA: Si el biofilm de la película del último paso no está bien cultivado, el medio TSB-MSgg es un sustituto eficaz del medio TSB.</li>
		<li>Retire el filtro que contiene la biopelícula de la película. Agregue 2 ml de tampón PBS-S a una nueva placa de células de 24 pocillos, coloque el filtro de 24 pocillos en ella para lavar la biopelícula y retire las células libres. Repite el proceso de lavado tres veces.</li>
	</ol></li>
	<li>Extracción de ADN de biofilm pelicular<ol><li>Extraiga el genoma de la biopelícula utilizando un kit de ADN siguiendo las instrucciones del fabricante.</li>
	</ol></li>
	<li>Secuenciación de alto rendimiento NOTA: Las empresas de biotecnología pueden ayudar a completar los experimentos de secuenciación para la mayoría de los laboratorios. Si se necesita una composición microbiana en la solución restante, señéela en este paso. El paso de secuenciación varía en función de los instrumentos. Siga las instrucciones del fabricante. El paso 2.4.1 es solo para referencia.<ol><li>Amplifique las regiones V3-V4 del gen de ARNr 16S basándose en la base de datos con secuencias de genes de ARNr 16S de longitud completa. Crear OTUs de especies de acuerdo con el número mínimo de secuencias por muestra16. Agrupe las anotaciones de clasificación de especies y adquiera las composiciones de las comunidades de cada muestra.</li>
		<li>En función de los datos de secuenciación, seleccione las cinco cepas principales en términos de su abundancia relativa.</li>
	</ol></li>
	<li>Aislamiento y cultivo bacteriano de alto rendimiento NOTA: Este paso está diseñado de acuerdo con la última metodología microbiológica y bioinformática17. El método de placa recubierta de dilución está disponible para el aislamiento bacteriano aquí, aunque requiere más tiempo y es menos específico en comparación con las técnicas de alto rendimiento.<ol><li>Mezclar el biofilm cultivado. Utilice la dilución limitante para asegurarse de que no más del 30% de los pocillos de la placa de 24 pocillos muestren crecimiento bacteriano. NOTA: Para determinar la dilución más adecuada, realice experimentos preliminares utilizando una amplia gama de tasas de dilución. La dilución óptima no debe contener más de dos bacterias cultivables por mililitro, lo que representa una incubación bacteriana en menos del 30% de los pocillos.</li>
		<li>Amplifique el gen 16S rRNA de las bacterias mientras agrega etiquetas para los pocillos y las placas y secuséntelos utilizando la plataforma Illumina17 de alto rendimiento.</li>
		<li>Realizar análisis bioinformáticos utilizando software disponible comercialmente para obtener información taxonómica de pureza y especies para cada cultivo.</li>
		<li>Cultive las cinco bacterias puras más abundantes mediante cultivo en línea continua y use glicerol para preservar las bacterias a -80 °C.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Construcción de comunidades microbianas sintéticas
<ol><li>Cultivo de biofilm reconstruido NOTA: Para más detalles, consulte Ren et al.18. Las 5 cepas corresponden a 31 combinaciones sintéticas, incluyendo 5 consorcios de una sola especie, 10 de dos especies, 10 de tres especies, 5 de cuatro especies y 1 de cinco especies.<ol><li>Incubar las 5 cepas en el medio TSB hasta que su OD600 llegue a 1 para activarlas.</li>
		<li>Prepare varias placas de 24 pocillos con medio TSB y coloque filtros de celdas de nailon de 100 μm sobre ellas. NOTA: Si la biopelícula del último paso no está bien cultivada, el medio TSB-MSgg es un sustituto eficaz del medio TSB.</li>
		<li>Incuba las 31 combinaciones de comunidades sintéticas en el medio. Asegúrese de que el número de bacterias de inoculación sea constante en cada pocillo. Establece tres repeticiones para cada combinación.</li>
		<li>Cultivar el biofilm a 30 °C durante 36 h.</li>
	</ol></li>
	<li>Cuantificación del biofilm de la película<ol><li>Siga el mismo procedimiento que en el paso 2.2.3.</li>
		<li>Transfiera la biopelícula a una nueva placa de 24 pocillos que contenga 180 μL de solución de violeta cristalina y tiña durante 20 minutos.</li>
		<li>Transfiera la muestra teñida a otra placa de 24 pocillos que contenga 200 μL de etanol al 96%, eluya durante 30 minutos y mida OD590.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Cuantificación del número de células de la película
NOTA: Para determinar la proporción de cada especie y los recuentos de células en la película y la solución restante, es necesaria la PCR cuantitativa. Para más detalles, véase Sun et al.16.
<ol><li>Diseñar cebadores específicos de cepa para las comunidades microbianas sintéticas seleccionadas.</li>
	<li>Utilice Roary para realizar comparaciones del genoma y averiguar los genes de copia única específicos de la cepa de cada cepa. Asegúrese de que los cebadores estén dirigidos a estos genes.</li>
	<li>Ligasa los fragmentos amplificados a plásmidos PMD19T. Genere curvas estándar utilizando los plásmidos que contienen los fragmentos correspondientes como plantillas.</li>
	<li>Siga los mismos pasos que se mencionaron en el paso 2.2.</li>
	<li>Prepare los componentes de la reacción de la siguiente manera: 7,2 μL deH2O, 10 μL de 2x mezcla maestra de qPCR, 0,4 μL de 10 μM de cada cebador y 2 μL de ADN molde.</li>
	<li>Realice la PCR con un instrumento de PCR en tiempo real en las siguientes condiciones: 95 °C durante 10 min, 40 ciclos de 95 °C durante 30 s y 60 °C durante 45 s, seguidos de un segmento de curva de fusión estándar.</li>
	<li>Realizar seis réplicas biológicas para cada tratamiento.</li>
</ol>

Desarrollo de biopelículas sinérgicas multiespecies a partir de suelos de rizosfera

<ol><li>Davey, M. E., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+biofilms%3A+from+ecology+to+molecular+genetics%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Mol+Biol+Rev%22%5BJournal%5D)">Microbial biofilms: from ecology to molecular genetics.</a> Microbiol Mol Biol Rev. 64 (4), 847-867 (2000).</li>
<li>Campbell, R., Greaves, M. P., Lynch, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomy+and+community+structure+of+the+rhizosphere%5BTitle%5D)+AND+%22Rhizosphere%22%5BJournal%5D)">Anatomy and community structure of the rhizosphere.</a> Rhizosphere. , 11-34 (1990).</li>
<li>Berendsen, R. L., Pieterse, C. M., Bakker, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+rhizosphere+microbiome+and+plant+health%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">The rhizosphere microbiome and plant health.</a> Trends Plant Sci. 17 (8), 478-486 (2012).</li>
<li>Lugtenberg, B., Kamilova, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant-growth-promoting+rhizobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Plant-growth-promoting rhizobacteria.</a> Annu Rev Microbiol. 63, 541-556 (2009).</li>
<li>Compant, S., Clément, C., Sessitsch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+growth-promoting+bacteria+in+the+rhizo-+and+endosphere+of+plants%3A+Their+role%2C+colonization%2C+mechanisms+involved+and+prospects+for+utilization%5BTitle%5D)+AND+%22Soil+Biol+Biochem%22%5BJournal%5D)">Plant growth-promoting bacteria in the rhizo- and endosphere of plants: Their role, colonization, mechanisms involved and prospects for utilization.</a> Soil Biol Biochem. 42, 669-678 (2010).</li>
<li>Bais, H. P., Fall, R. R., Vivanco, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biocontrol+of+Bacillus+subtilis+against+infection+of+Arabidopsis+roots+by+Pseudomonas+syringae+is+facilitated+by+biofilm+formation+and+surfactin+production%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Biocontrol of Bacillus subtilis against infection of Arabidopsis roots by Pseudomonas syringae is facilitated by biofilm formation and surfactin production.</a> Plant Physiol. 134 (1), 307-319 (2004).</li>
<li>Trivedi, P., Leach, J. E., Tringe, S. G., Sa, T., Singh, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant-microbiome+interactions%3A+From+community+assembly+to+plant+health%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Plant-microbiome interactions: From community assembly to plant health.</a> Nat Rev Microbiol. 18, 607-621 (2020).</li>
<li>Sun, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacillus+velezensis+stimulates+resident+rhizosphere+Pseudomonas+stutzeri+for+plant+health+through+metabolic+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22ISME+J%22%5BJournal%5D)">Bacillus velezensis stimulates resident rhizosphere Pseudomonas stutzeri for plant health through metabolic interactions.</a> ISME J. 16, 774-787 (2021).</li>
<li>Pandhal, J., Noirel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+microbial+ecosystems+for+biotechnology%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Lett%22%5BJournal%5D)">Synthetic microbial ecosystems for biotechnology.</a> Biotechnol Lett. 36, 1141-1151 (2014).</li>
<li>Grosskopf, T., Soyer, O. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+microbial+communities%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Synthetic microbial communities.</a> Curr Opin Microbiol. 18, 72-77 (2014).</li>
<li>Lundberg, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+core+Arabidopsis+thaliana.+root+microbiome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Defining the core Arabidopsis thaliana. root microbiome.</a> Nature. 488, 86-90 (2012).</li>
<li>Bai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+overlap+of+the+Arabidopsis+leaf+and+root+microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Functional overlap of the Arabidopsis leaf and root microbiota.</a> Nature. 528, 364-369 (2015).</li>
<li>Bakken, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+and+purification+of+bacteria+from+soil%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Separation and purification of bacteria from soil.</a> Appl Environ Microbiol. 49 (6), 1482-1487 (1985).</li>
<li>Yang, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+cell+extraction+from+fresh+and+stored+soil+samples%3A+Impact+on+microbial+viability+and+community+compositions%5BTitle%5D)+AND+%22Soil+Biol+Biochem%22%5BJournal%5D)">Direct cell extraction from fresh and stored soil samples: Impact on microbial viability and community compositions.</a> Soil Biol Biochem. 155, 108178(2021).</li>
<li>Ren, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+screening+of+multispecies+biofilm+formation+and+quantitative+PCR-based+assessment+of+individual+species+proportions%2C+useful+for+exploring+interspecific+bacterial+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Microb+Ecol%22%5BJournal%5D)">High-throughput screening of multispecies biofilm formation and quantitative PCR-based assessment of individual species proportions, useful for exploring interspecific bacterial interactions.</a> Microb Ecol. 68, 146-154 (2013).</li>
<li>Sun, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+interactions+affect+the+biomass+of+synthetic+bacterial+biofilm+communities%5BTitle%5D)+AND+%22mSystems%22%5BJournal%5D)">Metabolic interactions affect the biomass of synthetic bacterial biofilm communities.</a> mSystems. 8, e01045-e01123 (2023).</li>
<li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+cultivation+and+identification+of+bacteria+from+the+plant+root+microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">High-throughput cultivation and identification of bacteria from the plant root microbiota.</a> Nat Protoc. 16, 988-1012 (2021).</li>
<li>Ren, D., Madsen, J. S., Sørensen, S. J., Burnolle, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+prevalence+of+biofilm+synergy+among+bacterial+soil+isolates+in+cocultures+indicates+bacterial+interspecific+cooperation%5BTitle%5D)+AND+%22ISME+J%22%5BJournal%5D)">High prevalence of biofilm synergy among bacterial soil isolates in cocultures indicates bacterial interspecific cooperation.</a> ISME J. 9, 81-89 (2015).</li>
<li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Root+colonization+by+beneficial+rhizobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Root colonization by beneficial rhizobacteria.</a> FEMS Microbiol Rev. 48 (1), 066(2024).</li>
<li>Palková, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicellular+microorganisms%3A+Laboratory+versus+nature%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Multicellular microorganisms: Laboratory versus nature.</a> EMBO Rep. 5, 470-476 (2004).</li>
<li>Xu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+communication+in+plant-microbe+beneficial+interactions%3A+a+toolbox+for+precise+management+of+beneficial+microbes%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Chemical communication in plant-microbe beneficial interactions: a toolbox for precise management of beneficial microbes.</a> Curr Opin Microbiol. 72, 102269(2023).</li>
</ol>

Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

Siguiendo el protocolo, se construyen una serie de comunidades robustas de biofilm sintético multiespecie a partir de la microbiota en suelos de rizosfera de diferentes plantas. Mediante técnicas cuantitativas de PCR se descifra claramente la composición de cada comunidad. La biomasa de la biopelícula indica la fuerza de sus posibles interacciones metabólicas, aunque no se pudieron revelar aquí varias propiedades y mecanismos detrás de la cooperación19. Dado el tamaño y la complejidad de las comunidades microbianas naturales, las comunidades sintéticas (SynComs) representan un sistema modelo para superar los obstáculos existentes14. Este protocolo destaca la metodología sistemática y fundamental de construcción de comunidades de biopelículas sintéticas a partir de la compleja microbiota del suelo de la rizosfera.
Es evidente en la última parte que SQR9, XL-1 y XL-2 muestran un fuerte potencial para la colonización estable en la rizosfera actual. Los investigadores pueden comenzar a investigar las relaciones metabólicas y los mecanismos de cocolonización basados en estas cepas. A partir de entonces, también se podrá acceder a investigaciones posteriores sobre inoculantes microbianos para el pepino.
A pesar de las ventajas mencionadas, es importante no pasar por alto los inconvenientes del protocolo. Debido a las diferencias entre el cultivo de laboratorio y las condiciones in situ , los resultados de cada comunidad sintética podrían no representar con precisión la microbiota en suelos reales de rizosfera20. Es necesaria la confirmación a través de una mayor inoculación de la rizosfera. Además, la reproducibilidad de estos resultados es relativamente pobre. Las especies de biopelículas de película película en el laboratorio pueden haber sufrido mutaciones a lo largo de muchas generaciones en comparación con los tipos silvestres en el suelo, lo que lleva a algunas imprecisiones incontrolables.
Hay varias alternativas a ciertos pasos en el protocolo. Por ejemplo, en el paso 1.2, el método de centrifugación en gradiente de densidad de Nycodenz es relativamente más eficiente para recolectar muestras de células del suelo13. Además, en el paso 2.4, el último cultivo de alto rendimiento y la identificación de bacterias aumentan significativamente la eficiencia experimental, aunque a un costo más alto. Por lo tanto, el método tradicional de placa recubierta de dilución sigue siendo adecuado para seleccionar algunas especies. Por último, en el paso 3.2, la biomasa de la biopelícula cultivada puede evaluarse tanto mediante tinción con cristal violeta como pesándola directamente en una balanza analítica.
Este protocolo va más allá de la mera creación de materiales experimentales básicos para la investigación microbiana y medioambiental. La identificación de las comunidades de biopelículas sintéticas bacterianas multiespecie sintéticas más robustas es solo el primer paso para desentrañar el ecosistema abierto y complejo de la rizosfera. Al centrarse en las especies principales de SynComs, los investigadores pueden obtener información sobre situaciones reales in situ de una manera más específica y rápida. Este enfoque también puede ofrecer una perspectiva novedosa para explorar biopelículas a mayor escala, como los agregados de suelo de la rizosfera, y para el manejo preciso de las comunidades microbianas de la rizosfera para el crecimiento y la salud de las plantas21.
Lo más importante es que esta metodología arrojará luz sobre futuras investigaciones sobre las interacciones entre especies que gobiernan el ensamblaje y la dinámica de la microbiota del suelo de la rizosfera. Por ejemplo, cuando se trata de una comunidad compleja de rizosfera, otros métodos analíticos, como el análisis de redes de co-ocurrencia o el modelado metabólico a escala genómica15 , a menudo se combinan con estos pasos fundamentales para construir artificialmente una comunidad de biopelículas representativa. Esto incluye consideraciones sobre las relaciones entre especies.

Las biopelículas representan comunidades microbianas intrincadas, ya sea adheridas a superficies o unidas con interfaces. Existe un amplio reconocimiento de que la mayoría de las bacterias que se encuentran en diversos entornos, como hábitats naturales, entornos clínicos y contextos industriales, perduran dentro de las comunidades de biopelículas1. En el suelo, la rizosfera, que abarca la superficie de la raíz y su región adyacente de 2 mm de espesor, forma un nicho ecológico con una mayor disponibilidad de nutrientes. Bacterias específicas han desarrollado estrategias para explotar este nicho, fomentando la proliferación microbiana y fomentando la formación de comunidades de biopelículas en la rizosfera2.
Los microbios de la rizosfera se consideran el "segundo genoma" de las plantas3. Los microorganismos promotores del crecimiento vegetal (PGPM) participan en simbiosis mutualista con las plantas, proporcionando importantes funciones de promoción del crecimiento y biocontrol4. Por un lado, el PGPM puede suministrar nutrientes a las raíces de las plantas, mejorar la absorción de nutrientes, defenderse contra patógenos y degradar contaminantes en el suelo de la rizosfera5. Por otro lado, el PGPM utiliza los exudados de las raíces de las plantas como fuente de nutrientes para el crecimiento y la evolución, influyendo así en el suelo de la rizosfera y el sistema radicular a través de su propio metabolismo. Vale la pena señalar que el requisito previo para todas estas funciones es la colonización efectiva de PGPM en la rizosfera de la planta, formando biopelículas estables6.
La biopelícula de la rizosfera afecta el proceso de ensamblaje de los microbios de la rizosfera, y las características temporales y espaciales del ensamblaje de los microbios de la rizosfera están estrechamente relacionadas con la interacción de la biopelícula multiespecie7. Sirve como centro de interacciones planta-microbioma, proporcionando un nicho estable y controlable para que interactúen de manera efectiva. Por lo tanto, el estudio de la biopelícula de la rizosfera también es una dirección importante para obtener información sobre la interacción entre las plantas y los microbios.
Sin embargo, en la actualidad hay poca investigación sobre las biopelículas multiespecie de la rizosfera. La alta complejidad de la composición del microbioma hace que sea difícil responder a las preguntas ecológicas fundamentales que rodean a las comunidades microbianas naturales8. En el proceso de los experimentos, es necesario tener en cuenta muchas condiciones, como el tipo de suelo, el tipo de planta y el gran número de comunidades microbianas. Diversos factores limitan la investigación de las biopelículas multiespecie de la rizosfera.
Para investigar más a fondo las comunidades de biopelículas multiespecie del suelo de la rizosfera, como las interacciones sinérgicas entre especies o la alimentación cruzada de metabolitos8, es deseable construir artificialmente una comunidad microbiana sintética simplificada, representativa, estable y manejable en condiciones de laboratorio 9,10. Aquí, un protocolo estandarizado combina varias de las últimas técnicas microbiológicas y bioinformáticas.

<table><tbody><tr><td>0,2 % Na4P2O7 solución</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.</td><td>20041418</td><td>Se utiliza para diluir la suspensión del suelo.</td></tr><tr><td>100 μ m Filtro de células de nailon</td><td>Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.</td><td>F613463-0001</td><td>Se utiliza para filtrar la solución de cultivo y separar la biopelícula de película.</td></tr><tr><td>Solución de NaClO al 2%</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.</td><td>L03336903</td><td>Se utiliza para esterilizar las semillas.</td></tr><tr><td>Placa de 24 pocillos</td><td>Merck &amp; Co., Inc.</td><td>PSRP010</td><td>Se utiliza para el cultivo micobiano y la separación de biopelículas películas.</td></tr><tr><td>Ácido 3-(N-morfolino) propano sulfónico (MOPS)</td><td>Bioolook Scientific Research Special</td><td>2360010</td><td>Se utiliza para preparar medios MSgg.</td></tr><tr><td>Tubo de centrífuga de 50 mL</td><td>Beijing Su-bio Biotech Co., Ltd.</td><td>62.547.254</td><td>Tubos de centrífuga del tamaño adecuado para nuestro protocolo.</td></tr><tr><td>Solución al 75% C2H5OH</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.</td><td>801769680</td><td>Se utiliza para esterilizar las semillas.</td></tr><tr><td>Acinetobacter baumannii XL-1</td><td>Universidad Agrícola de Nanjing</td><td>N/A</td><td>Cepas aisladas del suelo de la rizosfera.</td></tr><tr><td>Bacillus velezensis SQR9</td><td>Universidad Agrícola de Nanjing</td><td>N/A</td><td>Cepas aisladas del suelo de la rizosfera.</td></tr><tr><td>Kit de ADN de bacterias</td><td>Nanjing Dinsi Biotechnology Co., Ltd.</td><td>D3350020000K04U021</td><td>Se utiliza para extraer ADN bacteriano.</td></tr><tr><td>Tierra Negra I</td><td>Universidad Agrícola de Nanjing</td><td>N/A Tierra</td><td>negra de la provincia de Jilin.</td></tr><tr><td>Tierra Negra II</td><td>Universidad Agrícola de Nanjing</td><td>N/A Tierra</td><td>negra de la provincia de Heilongjiang.</td></tr><tr><td>Burkholderia cenocepacia XL-2</td><td>Universidad Agrícola de Nanjing</td><td>N/A</td><td>Cepas aisladas del suelo de la rizosfera.</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Xilong Scientific Co.,Ltd.</td><td>10035048</td><td>Se utiliza para preparar medios MSgg.</td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.</td><td>G508009-0001</td><td>Centrífuga de alta velocidad.</td></tr><tr><td>ChamQ SYBR qPCR Master Mix</td><td>Vazyme Biotech Co., Ltd.</td><td>Q311-02</td><td>Se utiliza para la amplificación de ADN en qPCR.</td></tr><tr><td>Banco limpio</td><td>Suzhou Antai Airtech Co., Ltd.</td><td>NB026143</td><td>Se utiliza para el funcionamiento aséptico.</td></tr><tr><td>Incubadora de temperatura constante</td><td>ShangHai CIMO Medical Instrument Co.,Ltd</td><td>GNP-9080BS-<img alt="Ecuación 1" src="/files/ftp_upload/66926/66926eq01.jpg" style="margin: auto; "></td><td>Se utiliza para el cultivo microbiano.</td></tr><tr><td>Tinte violeta de cristal</td><td>Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.</td><td>A600331</td><td>Se utiliza para la tinción y cuantificación de biopelículas de película.</td></tr><tr><td>Semilla de pepino</td><td>Universidad Agrícola de Nanjing</td><td>N/A</td> <td>Semilla de pepino "Jinchun I".</td></tr><tr><td>Culturome v 1.0</td><td>El Instituto de Genética y Biología del Desarrollo de la Academia China de Ciencias</td><td>N/A</td><td>Se utiliza para el cultivo e identificación de bacterias del suelo de rizosfera de alto rendimiento</td></tr><tr><td>FeCl3</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>10011918</td><td>Se utiliza para preparar medios MSgg.</td></tr><tr><td>Nevera</td><td>Hefei Midea Refrigerador Co., Ltd.</td><td>BCD-556WKPM(Q)</td><td>Se utiliza para la conservación de cepas.</td></tr><tr><td>Glutamato</td><td>Bioolook Scientific Research Special 2180020</td><td></td><td>Se utiliza para preparar medios MSgg.</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>10010618</td><td>utiliza para preparar medios MSgg.</td></tr><tr><td>Cesta de plantación hidropónica</td><td>Yulv Furniture Store 6526262626</td><td></td><td>utiliza para la hidroponía de pepino.</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Xilong Scientific Co., Ltd.</td><td>10017618</td><td>Se utiliza para preparar medios MSgg.</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Xilong Scientific Co., Ltd.</td><td>7791186</td><td>Se utiliza para preparar medios MSgg.</td></tr><tr><td>MnCl2</td><td>Xilong Scientific Co., Ltd.</td><td>10400101</td><td>Se utiliza para preparar medios MSgg.</td></tr><tr><td>Msgg Medio</td><td>Shanghai Bioesn Biotechnology Co., Ltd.</td><td>BES20791KB</td><td>Medio de cultivo de biofilm Pellicle.</td></tr><tr><td>Na2HPO4· 7H2O</td><td>Merck &amp; Co., Inc.</td><td>S9390-100G</td><td>Se utiliza para preparar medios TSB.</td></tr><tr><td>NaCI</td><td>Chinasun Specialty Products co., Ltd.</td><td>HS0416</td><td>Se utiliza para preparar medios TSB.</td></tr><tr><td>NaH2PO4· H2O</td><td>Merck &amp; Co., Inc.</td><td>S9638-25G</td><td>Se utiliza para preparar medios TSB.</td></tr><tr><td>PBS-S Buffer</td><td>Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.</td><td>E607008-0001</td><td>Tampón básico para tejidos vivos.</td></tr><tr><td>Fenilalanina</td><td>RYON</td><td>RT3486L005</td><td>utiliza para preparar medios MSgg.</td></tr><tr><td>Pipeta</td><td>Beijing Labgic Technology Co., Ltd.</td><td>BS-1000-T</td><td>Se utiliza para la inoculación de cepas.</td></tr><tr><td>PMD19T Plásmido Takara</td><td>Tecnología Biomédica (Pekín) Co., Ltd.</td><td>D102A</td><td>Se utiliza para generar curvas estándar de qPCR.</td></tr><tr><td>Maceta</td><td>Sinopharm Reactivo Químico Co., Ltd.</td><td>YHHWS2401</td><td>Se utiliza para el cultivo de tierra de pepino.</td></tr><tr><td>Imprimación para qPCR</td><td>Sangon Biotech (Shanghai) Co.,Ltd.</td><td>N/A</td><td>Se utiliza para la amplificación de ADN en qPCR.</td></tr><tr><td>Instrumento de PCR en tiempo real</td><td>Thermo Fisher Scientific (China) Co., Ltd.</td><td>4484073</td><td>Se utiliza para realizar qPCR en biofilm de película seleccionada.</td></tr><tr><td>Roary</td><td>The Wellcome Trust SangerInstitute</td><td>N/A</td><td>Se utiliza para diseñar cebadores de qPCR</td></tr><tr><td>Shaker</td><td>Shanghai Zhichu Instrument Co., Ltd</td><td>ZQTY-50S</td><td>Se utiliza para la mezcla de soluciones y el cultivo microbiano.</td></tr><tr><td>Silwet L-77</td><td>Cytiva Biotecnología (Hangzhou) Co., Ltd.</td><td>SL77080596</td><td>Se utiliza para preparar medios TSB.</td></tr><tr><td>Peptona</td><td>de soja Qingdao Hi-tech Industrial Park Hope Bio-technology Co., Ltd</td><td>HB8275</td><td>Se utiliza para preparar medios TSB.</td></tr><tr><td>Espectrofotómetro</td><td>Shanghai Yidian Analysis Instrument Co., Ltd.</td><td>76713100010</td><td>Se utiliza para la cuantificación de la biopelícula cristalina de la película.</td></tr><tr><td>Agua estéril</td><td>Sinopharm Reactivo químico Co., Ltd.</td><td>SW150302</td><td>Se utiliza para lavar el biofilm de la película.</td></tr><tr><td>Guantes de nitrilo esterilizados</td><td>Beijing Labgic Technology Co., Ltd.</td><td>223016852LLZA</td><td>Se utiliza para operaciones experimentales básicas.</td></tr><tr><td>Plantilla de ADN</td><td>Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.</td><td>N/A</td><td>Se utiliza para la amplificación de ADN en qPCR.</td></tr><tr><td>Thiamine</td><td>Bioolook Scientific Research Special</td><td>2180020</td><td>Se utiliza para preparar medios MSgg.</td></tr><tr><td>Triptona</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>LP0042B</td><td>Se utiliza para preparar medios TSB.</td></tr><tr><td>Triptófano</td><td>Bioolook Investigación Científica Especial</td><td>2190020</td><td>Se utiliza para preparar medios MSgg.</td></tr><tr><td>TSB Medio</td><td>Guangdong Huankai Microbial Sci. &amp; Tech. Co., Ltd.</td><td>024048</td><td>Medio bacteriano de amplio espectro.</td></tr><tr><td>TSB-Msgg Meidium</td><td>Nanjing Agricultural University</td><td>N/A</td><td>Medio mixto para el cultivo de biopelículas películas con una aplicabilidad más amplia.</td></tr><tr><td>ZnCl2</td><td>Nanjing Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>C0310520123</td><td>utiliza para preparar medios MSgg.</td></tr></tbody></table>

un enfoque para la construcción de comunidades de biopelículas multiespecies a partir del suelo de la rizosfera

An Approach to Constructing Multispecies Biofilm Communities from Rhizosphere Soil

La biopelícula multiespecie es un estilo de vida natural y dominante de las bacterias en la naturaleza, incluso en el suelo de la rizosfera, aunque su comprensión actual es limitada. Aquí, proporcionamos un enfoque para establecer rápidamente comunidades sinérgicas de biopelículas multiespecies. El primer paso es extraer células del suelo de la rizosfera utilizando el método de centrifugación diferencial. Posteriormente, estas células del suelo se inoculan en el medio de cultivo para formar una biopelícula películo. Después de 36 h de incubación, la composición bacteriana de la biopelícula y la solución subyacente se determinan utilizando el método de secuenciación de amplicones del gen ARNr 16S. Mientras tanto, el aislamiento bacteriano de alto rendimiento de la biopelícula de la película se lleva a cabo utilizando el método de dilución limitante. A continuación, se seleccionan los 5 taxones bacterianos principales con la mayor abundancia en los datos de secuenciación de amplicones del gen 16S rRNA (muestras de biopelícula películo) para su posterior uso en la construcción de comunidades de biopelículas multiespecie. Todas las combinaciones de los 5 taxones bacterianos se establecieron rápidamente utilizando una placa de 24 pocillos, seleccionadas por la mayor capacidad de formación de biopelículas mediante el ensayo de tinción de violeta cristalino y cuantificadas por qPCR. Finalmente, las comunidades de biopelículas bacterianas sintéticas multiespecie más robustas se obtuvieron a través de los métodos anteriores. Esta metodología proporciona orientación informativa para la realización de investigaciones sobre la biopelícula multiespecie de la rizosfera y la identificación de comunidades representativas para estudiar los principios que rigen las interacciones entre estas especies.

Siguiendo el procedimiento mencionado, se observan gradientes significativos en la capacidad de formación de biopelículas de la microbiota del suelo de la rizosfera del pepino (Figura 1). La secuenciación del amplicón del biofilm confirmó la presencia de la especie en la película (Figura 2). Sobre la base del mapa de calor de los datos de secuenciación, se seleccionaron las cinco especies bacterianas principales cuya abundancia en la película es mayor que la de la solución restante (Figura 3). Aquí, se tomó como ejemplo un grupo típico de comunidades sintéticas. La tinción con violeta cristalino y la PCR cuantitativa visualizan directamente las diferencias en la biomasa de la película y la abundancia relativa de cada especie en las comunidades. El aumento de la biomasa de cocultivo indica el éxito de la construcción de comunidades sinérgicas de biopelículas multiespecie a partir del suelo de la rizosfera (Figura 4 y Figura 5).
Los resultados muestran que Bacillus velezensis SQR9, Acinetobacter baumannii XL-1 y Burkholderia cenocepacia XL-2 pueden formar consorcios sinérgicos prominentes, con la comunidad más robusta formada por las tres especies. Se predice que exhiben una fuerte sinergia en la formación de biopelículas. También es digno de mención que XL-1 sirve como un 'dedicador'. Promueve la formación de biopelículas de XL-2 y SQR9, a pesar de su pobre crecimiento y mínima abundancia en los consorcios (Figura 5). Si bien varias biopelículas de cocultivo multiespecie representan un fenotipo sinérgico, algunas especies, como Chryseobacterium sp., siempre se relacionan negativamente con otras cepas al reducir la biomasa de la biopelícula sintética (Figura 2). Aunque este fenómeno no está relacionado con el objetivo de este protocolo, podría valer la pena seguir investigando en el futuro.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66926/66926fig01.jpg"> Figura 1: Formación de biopelículas de diferentes comunidades sintéticas (SynComs). Aquí, las muestras están en placas estándar de 24 pocillos. Las fotografías se capturan sin ningún aumento. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66926/66926fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66926/66926fig02.jpg"> Figura 2: Composición bacteriana en película y solución. Los gráficos se basan en los datos de secuenciación del amplicón del gen ARNr 16S, mencionados en el paso 2.3 del protocolo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66926/66926fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66926/66926fig03.jpg"> Figura 3: Mapa de calor de la capacidad formadora de biopelículas en película y solución. El rojo representa la abundancia en la biopelícula, que es mayor que la solución, y el azul representa lo contrario. Los géneros no mostraron diferencias. Las especies de las 5 especies de mayor abundancia están marcadas a la izquierda. BB: biopelícula negra; BS: Solución negra. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66926/66926fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66926/66926fig04v2.jpg"> Figura 4: Cuantificación de la biomasa de las comunidades sintéticas en la Figura 1. Los datos provienen de la cuantificación en violeta cristalino con OD = 590 nm. Los datos presentados son la media ± DE, n = 5. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66926/66926fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66926/66926fig05.jpg"> Figura 5: Número de células y abundancia relativa de especies de comunidades sintéticas en la Figura 1. Los datos provienen de PCR cuantitativa. Los datos presentados son la media ± DE, n = 6. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66926/66926fig05large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Aquí se presenta un procedimiento rápido y estandarizado para establecer comunidades sinérgicas de biopelículas multiespecie de varios suelos de rizosfera. Se trata de un protocolo único diseñado para sondear y simular la compleja rizosfera de la microbiota del suelo.

Un enfoque para la construcción de comunidades de biopelículas multiespecies a partir del suelo de la rizosfera

The multispecies biofilm is a naturally occurring and dominant lifestyle of bacteria in nature, including in rhizosphere soil, although the current ...

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

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