Name: Liberación consistente de virus adenoasociados a través de la inyección lateral de la vena de la cola en ratones adultos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-08-23T13:10:00.000+00:00
Duration: 5 min 3 s
Description: Aprende a realizar inyecciones en la vena lateral de la cola en ratones adultos para administrar virus adenoasociados (AAV) en terapia génica. Este protocolo optimizado mejora la reproducibilidad y eficiencia de la transducción en tejidos como hígado y cuádriceps.

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Los autores desean agradecer al personal del centro de cuidado animal del NINDS por su apoyo. Este trabajo fue apoyado por la División de Investigación Intramuros de los NIH, NINDS (Informe Anual Número 1ZIANS003129). El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente las opiniones oficiales de los Institutos Nacionales de Salud.

Terapias basadas en AAV mediante inyección intravenosa en modelos preclínicos de ratón

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Los autores no tienen ninguna divulgación que sea relevante para el trabajo publicado en este artículo.

Las terapias basadas en AAV tienen un gran potencial para los trastornos monogénicos debido a la versatilidad de la AAV como vector de terapia génica, lo que permite personalizar los AAV para satisfacer las diversas necesidades de administración de diferentes trastornos 4,5,7,9. Los AAV se administran comúnmente a través de inyección intravenosa en modelos preclínicos de ratón para probar la seguridad y eficacia de posibles terapias16. Dado que las diferentes dosis inyectadas de AAV pueden dar lugar a marcadas diferencias en los resultados experimentales, es fundamental que los experimentadores puedan inyectar sistemáticamente la dosis prevista de AAV para garantizar la validez y la solidez de los datos in vivo generados28. Las inyecciones intravenosas son ampliamente utilizadas, pero son técnicamente desafiantes y requieren una amplia capacitación y práctica continua para desarrollar y mantener un nivel de habilidad que garantice el éxito constante de las inyecciones 16,17,18,19. Además de inyectar correctamente el AAV, generalmente se desea utilizar ensayos para evaluar la biodistribución y la eficiencia de entrega del AAV inyectado a los tejidos o células diana29,30.
Este protocolo tiene como objetivo ayudar a los experimentadores a realizar fácilmente inyecciones intravenosas con éxito y de manera consistente mediante la descripción detallada de los detalles de un protocolo optimizado de inyección intravenosa para administrar AAV en ratones sin sedar de 7 a 9 semanas de edad. Es importante tener en cuenta que los ratones que son marcadamente más pequeños o más grandes que los ratones de tipo salvaje en el rango de edad utilizado aquí pueden presentar un mayor desafío debido a una visibilidad reducida de las venas o incompatibilidad con los retenedores utilizados en este método. Se ha informado previamente que las inyecciones intravenosas de cola no son apropiadas para administrar reactivos por vía intravenosa en ratones menores de 6 semanas de edad debido al pequeño tamaño del vaso31. Aunque es posible, puede ser difícil inyectar consistentemente ratones que pesan menos de 22,0 g. con éxito. Es posible que los investigadores que utilizan ratones de tamaño atípico deban hacer adaptaciones al procedimiento. Este protocolo también describe varios ensayos que se pueden utilizar para evaluar la biodistribución de AAV y la eficiencia de la transducción.
Hay que tener en cuenta algunos puntos críticos al seguir este protocolo. Durante la inyección, las agujas de 29 G proporcionan una mayor resistencia si la aguja no está dentro de la vena. Esto reduce el volumen perdido por la inyección perivascular accidental de la solución durante los intentos fallidos de inyección. Las jeringas de insulina tienen volúmenes muertos más pequeños que las jeringas normales. Si se utiliza una jeringa y/o aguja diferente a las enumeradas aquí, es posible que sea necesario preparar un volumen de inyección adicional en los pasos del protocolo 1.1.3.3 para tener en cuenta el mayor volumen de espacio muerto (por ejemplo, agregue 30 μL a la dosis prevista en lugar de 15 μL).
Si se forman burbujas de aire finas causadas por la aspiración en los lados de la jeringa mientras se aspira la dosis de AAV en la jeringa, tire lentamente de la inyección más arriba de la jeringa. Esto eliminará la mayoría de las burbujas de aire pequeñas. Cargue al menos 10-15 μL adicionales de AAV hasta el volumen previsto para inyectar. Este volumen adicional es para tener en cuenta cualquier volumen que pueda perderse durante la expulsión de burbujas de aire o posibles intentos fallidos de inyección. (por ejemplo, si el volumen objetivo a inyectar es de 150 μL, cargue 165 μL en la jeringa (a medio camino entre las marcas de 160 μL y 170 μL en la escala de la jeringa). Si la aguja está correctamente colocada dentro de la vena y el volumen de la jeringa es de 165 μL inmediatamente antes del intento de inyección exitoso, administre el reactivo hasta que queden 15 μL en la jeringa (a medio camino entre las marcas de 10 μL y 20 μL), administrando así 150 μL (165 μL - 150 μL = 15 μL)). La alineación del lumen biselado (bisel hacia arriba) con la escala de la jeringa permite realizar un seguimiento del volumen suministrado durante la inyección.
Algunos experimentadores pueden preferir colocar al ratón de lado de modo que una de sus venas sea recta y fácilmente accesible en comparación con un ratón en sus pies. Sin embargo, la cola de un ratón de lado estará inclinada en diferentes ángulos dependiendo del tamaño del ratón, lo que requerirá un ajuste del ángulo de inyección cuando se inyecten ratones de diferentes tamaños. Esto podría afectar negativamente la consistencia del éxito del procedimiento. Durante los intentos iniciales de práctica, los experimentadores pueden probar ambas orientaciones de restricción del ratón para determinar su enfoque preferido. Tener el ratón de pie permite un acceso rápido y fácil a ambas venas laterales de la cola. Esto reduce el tiempo de restricción cuando es necesario acceder a ambas venas en el caso de múltiples intentos fallidos de inyección.
Si inyecta la vena lateral cerca de la base de la cola (más cerca del cuerpo del ratón) (especialmente para ratones que pesan >30 g.), ajuste el ángulo de inyección de paralelo a la vena a 5°-10° a la vena, ya que la vena en la base de la cola es ligeramente más profunda que distalmente.
Los protocolos de digestión de ARNasa y control de contaminación por ARN enumerados aquí se verificaron en muestras de ADN aisladas de tejidos hepáticos recién congelados que contenían un total de 175-700 ng de ácidos nucleicos en 20 μL. El protocolo de digestión de ARNasa también se probó en muestras de ADN aisladas de tejidos hepáticos frescos congelados y células clasificadas por FACS para confirmar la presencia del genoma del vector y el genoma del ratón después de la digestión de la ARNasa. Los resultados se visualizaron mediante electroforesis en gel de agarosa de la amplificación por PCR de punto final de los amplicones diana.
Seguir la metodología descrita puede reducir el entrenamiento y el tiempo de práctica necesarios para dominar las inyecciones intravenosas y dar como resultado una mayor tasa de inyección exitosa, lo que ahorraría reactivos. Este protocolo utiliza herramientas simples y de uso común sin la necesidad de equipos avanzados o configuraciones que podrían no estar fácilmente disponibles. Además, los pasos de inyección intravenosa enumerados aquí se pueden aplicar a una amplia gama de inyectos que deben administrarse por vía intravenosa, como los oligonucleótidos antisentido (ASO), con las modificaciones adecuadas en los pasos de preparación de la inyección según la inyección.

Los trastornos monogénicos constituyen el 80% de las enfermedades raras, que afectan colectivamente a 300 millones de personas en todo el mundo 1,2. Actualmente no existen terapias curativas aprobadas para la mayoría de estos trastornos raros muy debilitantes 1,2,3. Sin embargo, los trastornos monogénicos son candidatos ideales para terapias génicas que pueden reemplazar, complementar, corregir o silenciar genes disfuncionales 4,5. En la actualidad, se están desarrollando y utilizando múltiples vectores para administrar terapias génicas a tipos específicos de células 4,6. Uno de esos vectores es el virus adenoasociado (AAV). El AAV es un parvovirus no patógeno que se utiliza cada vez más como vector de terapia génica7. En comparación con otros vectores virales, el AAV tiene menor inmunogenicidad, menor potencial para integrarse en el genoma del huésped y la capacidad de transducir eficientemente células en división y no división en varios tejidos 7,8. Además, se han desarrollado múltiples enfoques para diseñar e identificar AAVs con características deseables como el tropismo tisular específico o una inmunogenicidad aún más reducida, lo que mejora en gran medida la versatilidad de AAV como vector viral para diferentes indicaciones9. Estos factores han convertido al AAV en un vector de terapia génica ampliamente investigado y han llevado al desarrollo de múltiples terapias génicas basadas en AAV aprobadas por la FDA10.
Los modelos de ratón se utilizan habitualmente para probar posibles terapias génicas in vivo y comprender mejor los mecanismos patológicos de los trastornos monogénicos. Esto se debe a la recapitulación de las patologías de diferentes condiciones en los modelos de ratón, a la similitud de su genoma con el genoma humano y a la relativa facilidad de manejo, mantenimiento y generación de ratones 11,12,13. Las pruebas in vivo son particularmente importantes cuando se estudian trastornos que afectan a múltiples sistemas o regiones del cuerpo, como las distrofias musculares. Para estos trastornos, las pruebas in vitro podrían no ser suficientes para evaluar de manera integral la seguridad, la eficacia, la farmacocinética y la farmacodinámica de las terapias destinadas a llegar a diferentes regiones del cuerpo después de la administración sistémica14.
Se pueden utilizar varias vías de administración sistémica para administrar fármacos. Cada ruta tiene sus ventajas, inconvenientes y grado de compatibilidad con el modelo animal y el fármaco que se investiga15. La inyección intravenosa (IV) en la vena lateral de la cola es una vía comúnmente utilizada para la administración sistémica de AAV en ratones16. Las inyecciones laterales en las venas de la cola permiten la administración rápida y directa del inyectado en el torrente sanguíneo del ratón, lo que garantiza una alta biodisponibilidad del fármaco en la circulación sistémica17. También requieren herramientas relativamente simples y comúnmente disponibles para ser realizados. Sin embargo, debido principalmente al pequeño diámetro de la vena de cola y a la dificultad de localización de la vena, las inyecciones laterales de la vena de cola son técnicamente desafiantes y requieren un alto grado de habilidad y práctica constante para evitar intentos fallidos de inyección o una administración incompleta de la dosis 16,17,18,19. Esto puede resultar en la pérdida de reactivos costosos o resultados inexactos, especialmente si la inyección incompleta no se reconoce mientras se realiza la inyección. Nuestra experiencia resumida aquí se basa en protocolos informados en artículos bien documentados que hemos adaptado para nuestro uso, optimizando varios pasos del procedimiento de inyección de la vena lateral de la cola para garantizar inyecciones consistentemente exitosas 20,21,22,23,24,25,26,27.
Aquí, describimos este protocolo detallado y optimizado de inyección de venas laterales de cola para administrar AAV en ratones no sedados de 7 a 9 semanas de edad utilizando herramientas simples y comúnmente disponibles. Además, proporcionamos los protocolos de los métodos utilizados para evaluar la entrega y biodistribución de AAV. Estos protocolos cubren la recolección de tejido posterior a la inyección, la fijación de tejidos, la extracción de ADN y la cuantificación del genoma vectorial de la reacción en cadena de la polimerasa digital (dPCR) por genoma diploide (vg/dg). El protocolo de inyección intravenosa y los indicadores proporcionados aquí tienen como objetivo mejorar la facilidad de realizar con éxito las inyecciones de las venas laterales de la cola. Esto potencialmente ayudará a reducir el tiempo necesario para dominar las habilidades de inyección y, al mismo tiempo, mejorará la precisión y la consistencia de las inyecciones.

<table><tbody><tr><td>0,22 y micro; filtro de jeringa</td><td>Millipore</td><td>SLGVM33RS</td><td></td></tr><tr><td>jeringas de insulina de 0,3 mL con aguja de 29G</td><td>BD Biosciences</td><td>324702</td><td></td></tr><tr><td>tubo de microcentrífuga de 1,7 mL</td><td>Crystalgen</td><td>23-2051</td><td></td></tr><tr><td>Jeringa de 10 mL</td><td>BD Biosciences</td><td></td> 302995 <td></td></tr><tr><td>100% EtOH</td><td>The Warner Graham Company</td><td>201096</td><td></td></tr><tr><td>10x tamponado con fosfato solución salina (PBS)</td><td>Corning</td><td>46-013-CM</td><td>Se utiliza para preparar 1x PBS para la fijación de tejidos</td></tr><tr><td>Tubo cónico de 15 mL</td><td>Corning</td><td>430766</td><td></td></tr><tr><td>soporte para tubo cónico de 15 mL</td><td>Múltiples fuentes</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Alcohol etílico de 190 grados</td><td>The Warner Graham Company</td><td>6810-01-113-7320</td><td>Se utiliza para preparar etanol al 70%</td></tr><tr><td>1x PBS estéril</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de almacenamiento de tejidos de microcentrífuga de 2 mL</td><td>Eppendorf</td><td>022363344</td><td></td></tr><tr><td>paraformaldehído (PFA)</td><td>Ciencias de la microscopía</td> electrónica <td>157-4</td><td></td></tr><tr><td>Virus adenoasociado (AAV)</td><td>Charles River</td><td>N/A</td><td>ADN monocatenario (ssDNA) El AAV se empaquetó para administrar Cre recombinasa como transgén impulsado por el promotor del CMV</td></tr><tr><td>Hisopo con alcohol</td> BD <td>Biosciences</td><td>326895</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de lisis de perlas</td><td>Next Advance</td><td>GREENE5</td><td></td></tr><tr><td>enzima de restricción BsuRI (HaeIII)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ER0151&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Batidora de balas</td><td>Next Advance</td><td>BBX24B</td><td></td></tr><tr><td>Ratones derivados de Ai14 de la cepa JAX 007914 (antecedentes genéticos: C57BL/6J)</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Se compraron ratones que contenían el alelo Ai14 Cre-reporter de JAX (número de catálogo: 007914)</td></tr><tr><td>Almohadillas absorbentes desechables</td><td></td><td></td> Pinzas de disección Fisherbrand 1420662 <td></td></tr><tr><td></td><td>Fine Science Tools (F.S.T)</td><td>11251-35</td><td></td></tr><tr><td>tijeras de disección</td><td>Fine Science Tools (FST)</td><td>14085-08</td><td></td></tr><tr><td>reactivo de degradación de ADN (DNAZap)</td><td>Invitrogen</td><td>AM9890</td><td></td></tr><tr><td>Extracción de ADN RNasa A</td><td>Qiagen</td><td>19101</td><td>Para la digestión de ARN durante la extracción de ácidos nucleicos</td></tr><tr><td>ARNasa libre de ADNasa para la limpieza de ADN</td><td>&nbsp;F. Hoffmann-La Roche</td><td>11119915001</td><td>Para la digestión de ARN después de un ácido nucleico extracción</td></tr><tr><td>dPCR Probe PCR Kit</td><td>Qiagen</td><td>250102</td><td></td></tr><tr><td>software dPCR&nbsp;</td><td>Qiagen&nbsp;</td><td>N/A&nbsp;</td><td>Paquete de software QIAcuity&nbsp;</td></tr><tr><td>Plataforma elevada</td><td>Múltiples fuentes</td><td>N/A</td><td>Se utilizó una caja vacía de puntas de pipeta para elevar el sujetador del ratón durante el calentamiento de la cola</td></tr><tr><td>Microscopio de fluorescencia</td><td>Múltiples fuentes</td><td>N/A</td><td>Modelo utilizado aquí: Nikon Eclipse Ti</td></tr><tr><td>Software de microscopio de fluorescencia&nbsp;</td><td>Múltiples fuentes&nbsp;</td><td>N/A&nbsp;</td><td>Software utilizado aquí: NIS-Elements&nbsp;</td></tr><tr><td>Gasa</td><td>Covidien</td><td>9022</td><td></td></tr><tr><td>Bloque de calor</td><td>Eppendorf</td><td>Thermomixer 5350</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga de alta velocidad</td><td>Eppendorf</td><td>22620689</td><td></td></tr><tr><td>Contenedor metálico</td><td>Vollrath</td><td>80125</td><td></td></tr><tr><td>Metilbutano</td><td>J.T.</td><td>Baker Q223-08</td><td></td></tr><tr><td>Calidad del agua de grado molecular</td><td>Biológico 351-029-131</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sujetador de tubo de ratón</td><td>Braintree Scientific</td><td>TV-RED-150-STD</td><td></td></tr><tr><td>Mini centrífuga Myfuge</td><td>Benchmark Scientific</td><td>C1012</td><td></td></tr><tr><td>Termociclador de reacción en cadena de la polimerasa</td><td>Bio-Rad Laboratories 1851148</td><td></td><td>Modelo: C1000</td></tr><tr><td>Toallitas táctiles de precisión</td><td>Kimberly-Clark Professional</td><td>7552</td><td></td></tr><tr><td>Proteinasa K</td><td>Qiagen</td><td>19131</td><td></td></tr><tr><td>QIAcuity dPCR Nanoplate 26k 24 pocillos</td><td>Qiagen</td><td>250001</td><td></td></tr><tr><td>QIAcuity One sistema de dPCR</td><td>Qiagen</td><td>911020</td><td></td></tr><tr><td>Qiagen DNeasy Blood & Kit de tejidos</td><td>Qiagen</td><td>69504</td><td>Se utiliza para la extracción de ADN de los tejidos</td></tr><tr><td>Qiagen QIAamp DNA Micro Kit</td><td>Qiagen</td><td>56304</td><td>Se utiliza para la limpieza del ADN genómico y el aislamiento del ADN de pequeños volúmenes de sangre El prtocotol se utilizó para la extracción de ADN de células clasificadas por FACS</td></tr><tr><td>Cono de restricción de roedores</td><td>Braintree Scientific</td><td>MDC-200</td><td></td></tr><tr><td>Scale</td><td>Ohaus</td><td>72212663</td><td></td></tr><tr><td>Caja de espuma de poliestireno</td><td>Múltiples fuentes</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Sacarosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9378-1kg</td><td></td></tr><tr><td>Limpiador y desinfectante de superficies</td><td>Peroxigard</td><td>29101&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Temporizador</td><td>Múltiples fuentes</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas de transferencia</td><td>Fine Science Tools (F.S.T)</td><td>91113-10</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>Daigger & Empresa</td><td>22220A</td><td>Modelo: Daigger Vortex Genie 2</td></tr></tbody></table>

liberación consistente de virus adenoasociados a través de la inyección lateral de la vena de la cola en ratones adultos

Consistent Delivery of Adeno-Associated Virus via Lateral Tail-Vein Injection in Adult Mice

Muchos trastornos afectan a múltiples órganos o involucran a diferentes regiones del cuerpo, por lo que es fundamental administrar terapias sistémicas para dirigirse a las células afectadas ubicadas en diferentes sitios. La inyección intravenosa es una vía de administración sistémica ampliamente utilizada en estudios preclínicos que evalúan tratamientos destinados a la administración en todo el cuerpo. En ratones adultos, implica la administración intravenosa del agente terapéutico en las venas laterales de la cola del ratón. Cuando se dominan, las inyecciones en las venas de cola son seguras y rápidas, y solo requieren herramientas simples y comúnmente disponibles. Sin embargo, las inyecciones en las venas de cola son técnicamente desafiantes y requieren una amplia capacitación y práctica continua para garantizar la administración precisa de la dosis prevista.
Aquí describimos un protocolo de inyección lateral de venas de cola detallado y optimizado que hemos desarrollado en base a nuestra experiencia y a las recomendaciones que habían sido reportadas previamente por otros grupos. Aparte de los retenedores para ratones y las jeringas de insulina, este protocolo solo requiere reactivos y equipos que están disponibles en la mayoría de los laboratorios. Descubrimos que seguir este protocolo da como resultado una administración intravenosa consistentemente exitosa del virus adenoasociado (AAV) en las venas de la cola de ratones no sedados de 7 a 9 semanas de edad. Además, describimos los protocolos optimizados para la detección histológica de proteínas indicadoras fluorescentes y la cuantificación del genoma vectorial por genoma diploide (vg/dg) utilizados para evaluar la transducción y biodistribución de AAV. El objetivo de este protocolo es ayudar a los experimentadores a realizar fácilmente inyecciones en las venas de cola con éxito y de manera consistente, lo que puede reducir el tiempo de práctica necesario para dominar la técnica.

Ratones machos de siete a nueve semanas de edad fueron inyectados con AAV a través de una inyección lateral en la vena de la cola a 1,5 × 1012 vg/ratón administrados en 150-200 μL de volumen de inyectado. El AAV de ssDNA utilizado aquí liberó el transgén recombinasa Cre impulsado por el promotor del CMV. Los ratones inyectados fueron homocigotos para el alelo Ai14 reportero de Cre. Cuando se exponen a la recombinasa Cre, las células que contienen alelos Ai14 expresan la proteína fluorescente tdTomato. Dado que la expresión de tdTomato es causada por la recombinación genómica inducida por Cre, las células que expresan tdTomato indican células que fueron transducidas directamente por el AAV o eran células de progenie de células transducidas. Los datos que se muestran aquí son de ratones inyectados con AAV9-CMV-Cre a 1,5 × 1012 vg/ratón administrados en 160 μL (5,8-5,9 × 1013 vg/kg). Los ratones se sacrificaron 28 días después de la inyección y los tejidos se recolectaron como se describió anteriormente. Se digierieron algunos músculos esqueléticos y lóbulos hepáticos, y sus células se recolectaron mediante FACS. Algunos lóbulos hepáticos se congelaron inmediatamente utilizando metilbutano preenfriado para la extracción de ácido nucleico. Algunos músculos esqueléticos y lóbulos hepáticos se fijaron y congelaron para obtener imágenes histológicas de tdTomato fluorescente. El tomate tdTomato se expresó de forma difusa en todo el hígado (Figura 2A) y en el cuádriceps (Figura 2C), lo que indica que AAV9 alcanzó y transdució ampliamente diferentes regiones de ambos tejidos.
El ADN extraído del hígado fresco congelado y las células clasificadas por FACS se utilizaron para cuantificar vg/dg mediante dPCR. La cuantificación de Vg/dg se puede utilizar para evaluar la consistencia de la inyección y la eficiencia de transducción de AAV en la muestra analizada. Se utilizaron los diagramas de dispersión de gotas 1D de la muestra de tejido hepático fresco congelado y las células clasificadas por FACS para garantizar la validez del ensayo (Figura 3A,C). El diagrama de dispersión mostró la presencia de particiones positivas y negativas, una separación clara entre las particiones positivas y negativas que permite una determinación precisa del umbral de detección y la presencia de gotas entre las particiones positivas y negativas, lo que puede reducir la precisión del ensayo de dPCR. El cumplimiento de todos estos criterios indicaba que los resultados del ensayo de dPCR eran válidos. Se cuantificó el número de copias del gen Polr2a en cada muestra para determinar el número de genomas diploides de ratón (2 copias del gen Polr2a/genoma diploide de ratón), y se utilizaron cebadores/sonda contra la secuencia del transgén recombinasa Cre para cuantificar el genoma viral (1 copia de transgén/genoma viral, Tabla 1). El valor de vg/dg se cuantificó para la muestra de tejido hepático fresco congelado y las células clasificadas por FACS y mostró la presencia de 187,7 vg/dg y 4,7 vg/dg en cada muestra, respectivamente (Figura 3B,D). Se utilizaron muestras de ratones inyectados con PBS y controles no molde que no contenían ácidos nucleicos como controles negativos.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66934/66934fig01.jpg"> Figura 1: Descripción general de la estación de inyección intravenosa. (A) Herramientas necesarias para realizar la inyección intravenosa. Aquí se muestra el (1) temporizador, (2) el retenedor del tubo del ratón, (3) los conos del restriccionador de plástico sin cortar y (4) cortados, (5) el hisopo con alcohol, (6) la caja vacía de puntas de pipeta utilizada como plataforma para elevar el retenedor del tubo del ratón, (7) las almohadillas absorbentes desechables, (8) el tubo cónico de 15 mL con agua tibia, (9) el soporte del tubo de 15 mL, (10) la gasa y (11) la jeringa de insulina. (B) El ratón se coloca primero dentro del sistema de retención del tubo. A continuación, se inserta el cono de restricción cortado para crear un manguito de sujeción alrededor del ratón, si el ratón es demasiado pequeño para ser restringido solo por el tubo de sujeción. Asegúrese de que la respiración del ratón no esté obstruida por los sujetadores. El retenedor de tubo se coloca en la parte superior de la plataforma elevada para permitir la colocación de la cola de ratón en agua tibia. (C) Posición de la cola del ratón y ángulo de sujeción de la aguja inmediatamente antes de realizar la inyección. Tire hacia atrás de la cola para que la cola se estire y el sitio de inyección quede completamente horizontal. La aguja es paralela a la cola y a la vena, y el bisel está hacia arriba. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66934/66934fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66934/66934fig02.jpg"> Figura 2: Detección de la proteína reportera fluorescente después de la inyección intravenosa. Ratones machos de siete a nueve semanas de edad que albergaban el alelo Ai14 reportero de Cre fueron inyectados por vía intravenosa con AAV9-CMV-Cre a 1,5 ×10 12 vg/ratón, administrados en 160 μL (5,8-5,9 × 10,13 vg/kg) o PBS. Imágenes de fluorescencia representativas de secciones de hígado (A) o cuádriceps (C) de ratón después de la administración de la inyección de Cre IV por AAV9. (B) Se tomaron imágenes de secciones de hígado o (D) cuádriceps de ratones inyectados con PBS para que sirvieran como controles negativos. Los tejidos se recolectaron y se congelaron fijamente 28 días después de la inyección intravenosa. Después de la exposición a Cre, la proteína fluorescente tdTomato se expresa en células transducidas y células de progenie de células transducidas. Se obtuvieron imágenes de secciones de 10 μm de espesor con un aumento de 10x. Barras de escala = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66934/66934fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66934/66934fig03.jpg"> Figura 3: Cuantificación del genoma vectorial por genoma diploide (vg/dg). Diagrama de dispersión 1D de la cuantificación de genomas vectoriales de dPCR en (A) tejido hepático o (C) células clasificadas por FACS recogidas de ratones inyectados con AAV9-CMV-Cre o PBS. Los diagramas de dispersión muestran las particiones de dPCR positivas y negativas, así como el umbral de detección indicado por la línea horizontal a través de las muestras. (B,D) Cuantificación de vg/dg después de cuantificar los genomas diploides de ratón y los genomas de vectores en (B) tejido hepático o (D) muestras de células clasificadas por FACS. Los resultados que se muestran aquí son de un solo mouse inyectado en AAV9 y un solo mouse inyectado en PBS con un duplicado técnico de dPCR para cada mouse. Las barras de error indican el intervalo de confianza del 95% para cada muestra. Abreviaturas: NTC= Control sin plantilla; dPCR = PCR digital; FACS = clasificación celular activada por fluorescencia. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66934/66934fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Cebador</td>
			<td>Secuencia</td>
		</tr><tr><td>Imprimación Cre forward</td>
			<td>CTGACGGTGGGAGAATGTTAAT</td>
		</tr><tr><td>Imprimación inversa Cre </td>
			<td>CATCGCTCGACCAGTTTAGTT</td>
		</tr><tr><td>Sonda Cre </td>
			<td>/56-FAM/CGCAGGTGT/ZEN/AGAGAAGGCACTTAGC/3IABkFQ/</td>
		</tr><tr><td>Imprimación delantera Polr2a </td>
			<td>GACTCCTTCACTCACTGTCTTC</td>
		</tr><tr><td>Imprimación inversa Polr2a </td>
			<td>TCTTGCTAGGCAGTCCATTATC</td>
		</tr><tr><td>Sonda Polr2a </td>
			<td>/5HEX/ACGAGATGC/ZEN/TGAAAGAGCCAAGGT/3IABkFQ/</td>
		</tr></tbody></table>Tabla 1: Secuencias de cebadores y sondas utilizadas para la cuantificación de vg/dg. Se utilizaron cebadores y sonda de Cre para cuantificar el genoma del vector. Se utilizaron cebadores y sonda Polr2a para cuantificar el genoma diploide del ratón.

Aquí detallamos un protocolo optimizado para la inyección de venas laterales de cola en ratones para administrar sistémicamente virus adenoasociados (AAV) en ratones adultos. Además, describimos los protocolos de los ensayos comúnmente utilizados para evaluar la transducción de AAV.

Liberación consistente de virus adenoasociados a través de la inyección lateral de la vena de la cola en ratones adultos

Many disorders affect multiple organs or involve different regions of the body, so it is critical to deliver therapeutics systemically to target the ...

consistent-delivery-adeno-associated-virus-via-lateral-tail-vein

Research

Investigación

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Fuente: Li, D., et al. Inyección intratecal directa de virus adenoasociados recombinantes en ratones adultos. J. Vis. Exp. (2019)Este video muestra el procedimiento para la inyección intratecal de virus adenoasociados (AAV) en el líquido cefalorraquídeo (LCR) de un ratón despierto, que cubre la preparación de la jeringa, la alineación de la columna vertebral y la inserción precisa de la aguja. Este método valida la administración de genes dirigidos, lo que respalda su potencial para las...

Administración intratecal de virus en un modelo de ratón para el tratamiento de enfermedades del sistema nervioso central

Fuente:Pourshafie, N., et al. Administración sistémica de microARN utilizando virus adenoasociados recombinantes serotipo 9 para tratar enfermedades neuromusculares en roedores. J. Vis. Exp. (2018).En este video, un ratón afectado por atrofia muscular espinal y bulbar o SBMA se somete a una inyección en la vena de la cola de vectores AAV (vectores adenoasociados) recombinantes que llevan un plásmido que codifica microARN terapéutico. El vector produce microARN que se une al AR-ARN mutante...

Inyección de vectores adenoasociados recombinantes en un modelo de ratón con atrofia muscular espinal y bulbar

Fuente: Grames, M. S., et al. Métodos y consejos para la administración intravenosa de virus adenoasociados a ratas y evaluación de la transducción del sistema nervioso central. J. Vis. Exp. (2017)Este video demuestra la inyección en la vena de la cola del virus adenoasociado recombinante (AAV) en ratas. Después de la inyección en la vena lateral de la cola, el virus ingresa al torrente sanguíneo, circula por el corazón y llega al cerebro, donde ingresa a las neuronas y facilita la producción...

 Administración intravenosa de vectores de virus adenoasociados recombinantes en un modelo de rata 

Aquí describimos la entrega de microRNA usando un serotipo de virus adeno-asociado recombinante 9 en un modelo de ratón de una enfermedad neuromuscular. Una sola administración periférica en ratones dio lugar a la sobreexpresión de miRNA sostenida en el músculo y neuronas del motor, proporcionando una oportunidad de estudio miRNA función y potencial terapéutico en vivo.

Entrega sistémica de microARN mediante Virus Adeno-asociado recombinante serotipo 9 para tratar enfermedades neuromusculares en roedores

El objetivo del presente estudio fue desarrollar y validar la potencia y la seguridad de la entrega del gen mediado por el virus adeno-asociado al virus espinal 9 (AAV9) mediante el uso de una nueva técnica de administración génica subpial en ratones adultos.

Adenovirus Subagonal Asociado 9 (AAV9) Vector Entrega en Ratones Adultos

Se cubren métodos para una entrega de genes de gran escala del sistema nervioso central en la rata. En este ejemplo, el propósito es imitar una enfermedad que afecta a la médula espinal entera. La transducción generalizada se puede utilizar para proporcionar una proteína terapéutica al SNC de una administración periférica, una sola vez.

Métodos y consejos para la administración intravenosa del Virus Adeno-asociado a las ratas y la evaluación de la transducción de señales del sistema nervioso Central

Aquí presentamos una técnica de inyección directa intratecal con clorhidrato de lidocaína 1% en una solución viral para asegurar la entrega eficiente de virus adeno-asociado a pequeños animales y establecer un sistema de puntuación para predecir la eficiencia de la transducción de señales en la central sistema nervioso según el grado de debilidad transitoria inducida por la lidocaína.

Directa de la inyección intratecal de virus Adeno-asociado recombinantes en ratones adultos

En este manuscrito, la inyección subconjuntival se demuestra como un método válido de administración de vectores para tejidos oculares en ratones utilizando un sistema de inyección que consiste en una bomba de jeringa de infusión/extracción y una jeringa extraíble hermética al gas acoplada con agujas de microinyección. Este sistema de inyección también es adaptable para otras vías de administración intraocular.

Administración subconjuntival de vectores de virus adenoasociados en modelos de animales pequeños

Se describe un procedimiento quirúrgico para realizar inyecciones en la cisterna lumbar de la rata juvenil. Este enfoque se ha utilizado para la administración intratecal de vectores de terapia génica, pero se prevé que este enfoque se pueda utilizar para una variedad de terapias, incluidas las células y los fármacos.

Administración intratecal de vectores en ratas juveniles mediante inyección en cisterna lumbar

Este manuscrito describe un protocolo detallado para la generación y purificación de vectores virales adenoasociados utilizando un método optimizado de cromatografía de afinidad basado en heparina. Presenta un enfoque simple, escalable y rentable, que elimina la necesidad de ultracentrifugación. Los vectores resultantes exhiben una alta pureza y actividad biológica, lo que demuestra su valor en estudios preclínicos.

Aislamiento de vectores virales adenoasociados mediante un protocolo de cromatografía de afinidad con heparina semiautomatizado y de un solo paso

Aprende a realizar inyecciones en la vena lateral de la cola en ratones adultos para administrar virus adenoasociados (AAV) en terapia génica. Este protocolo optimizado mejora la reproducibilidad y eficiencia de la transducción en tejidos como hígado y cuádriceps.

Liberación consistente de virus adenoasociados a través de la inyección lateral de la vena de la cola en ratones adultos

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