Preparación de suspensión unicelular de células epiteliales tímicas de ratón y tinción de moléculas intracelulares para análisis citométrico de flujo
26 de julio de 2024
Describimos protocolos para la preparación de suspensión unicelular de células epiteliales tímicas de ratón y la tinción de moléculas intracelulares para el análisis de citometría de flujo.
Las células T son células inmunitarias que protegen nuestro cuerpo de las enfermedades infecciosas y el cáncer. El timo es un órgano que produce células T y selecciona las células T en desarrollo de acuerdo con los componentes propios del cuerpo. Estamos interesados en cómo el timo produce y selecciona células T que son protectoras para nuestro cuerpo y, sin embargo, tolerantes para el cuerpo.
Nuestro laboratorio ha contribuido al análisis de las células epiteliales tímicas, que tienen un papel clave en la producción y selección de células T en el timo. El análisis a nivel de célula única de las células epiteliales tímicas nos ha ayudado a comprender mejor el mecanismo molecular del desarrollo y la selección de las células T. Las células epiteliales tímicas son muy diversas con estructuras complejas, lo que dificulta su aislamiento.
La tecnología actual para aislar suspensiones unicelulares es limitada y necesita mejoras. Aun así, el aislamiento unicelular de las células epiteliales tímicas mejora nuestra comprensión de la maquinaria molecular involucrada en su desarrollo y función. Esperamos que nuestro estudio contribuya a la comprensión de la generación y regeneración de células inmunitarias.
Creemos que servirá como una piedra angular importante para el avance de la salud humana. Después de recolectar el timo del ratón, colóquelo en cinco mililitros de RPMI 1640 que contienen 10 milimolares HEPES en un plato de plástico de 60 milímetros con hielo. Bajo un microscopio de disección, use pinzas curvas de punta fina para eliminar la sangre, el timo y los tejidos grasos.
Corta el timo en trozos pequeños con unas tijeras de disección. Transfiera los trozos de timo a un tubo de 15 mililitros que contenga tres mililitros de un miligramo por mililitro de colagenasa y dispasa, y una unidad por mililitro de DNasa en RPMI 1640 que contenga 2% de FBS. Incubar el tubo en un baño de agua a 37 grados centígrados durante 20 minutos.
A continuación, mezcle la suspensión con una pipeta de transferencia de plástico de tres mililitros y continúe incubando durante aproximadamente 30 minutos o hasta que no se vean los fragmentos de tejido. Agregue cinco mililitros de EDTA cinco milimolares en HBSS que contengan 1% de FBS. Filtre la suspensión celular a través de una malla de nailon de 60 micras en un nuevo tubo de 50 mililitros.
Centrifugar la suspensión a 350 g durante cinco minutos a cuatro grados centígrados y volver a suspender el pellet en 10 mililitros de tampón FACS. Almacene las celdas en hielo y determine el número de celdas usando un contador de celdas. Después de recolectar el timo de un ratón neonatal, use pinzas curvas de punta fina para eliminar la sangre, el timo no timo y los tejidos grasos.
Transfiera el timo a un tubo de 1,5 mililitros que contenga 0,2 mililitros de RPMI 1640 que contenga 10 milimolares de HEPES. Con una pipeta de 200 microlitros, deseche el medio, luego agregue 0,5 mililitros de 0,5 miligramos por mililitro de colagenasa y dispasa y una unidad por mililitro de Dnasa en RPMI 1640 que contiene 2% de FBS. Incubar el tubo en un bloque de calor a 37 grados centígrados.
Durante la incubación, mezcle suavemente con una pipeta de un mililitro. Después de 10 minutos, agregue 0,5 mililitros de EDTA cinco milimolares en HBSS que contenga 1% de FBS. Filtre la suspensión celular a través de una malla de nailon de 60 micras en un nuevo tubo cónico de 15 mililitros.
Agregue nueve mililitros de RPMI 1640 que contiene 10 milimolares HEPES al tubo. Centrifugar la suspensión celular a 350 g durante cinco minutos a cuatro grados centígrados y resuspender el pellet en uno a tres mililitros de tampón FACS. Almacene las celdas en hielo y determine el número de celdas usando un contador de celdas.
Para empezar, agregue 16 veces 10 a la potencia de 6 células de timo de ratón neonatales o postnatales en un tubo de poliestireno de fondo redondo de cinco mililitros. Centrifugar la suspensión celular a 350 G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados y desechar el sobrenadante. Vuelva a suspender el pellet celular en 10 microlitros de concentración de trabajo de anticuerpo monoclonal anti-receptor FC en tampón FACS.
Incubar el tubo a cuatro grados centígrados durante cinco minutos. Agregue 40 microlitros de cada uno de los anticuerpos monoclonales anti-CD45, anticuerpo monoclonal anti-EpCAM, anticuerpo monoclonal anti-Ly-51 y UEA-1 en tampón FACS. Mezclar el contenido de un tubo e incubar a cuatro grados centígrados durante 45 minutos.
Después de la incubación, agregue dos mililitros de tampón FACS. Centrifugar la suspensión celular a 350 G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados y volver a suspender el pellet en un microlitro de solución violeta 510 de Ghost Dye. Mezclar el contenido de un tubo e incubar a cuatro grados centígrados durante 30 minutos.
Ahora agregue dos mililitros de tampón FACS y centrifugue la suspensión celular antes de fijar las celdas con un mililitro de aldehído paraformado al 2% durante 10 minutos a temperatura ambiente. Agregue 3,5 mililitros de PBS al tubo. Centrifugar la suspensión celular a 700G durante ocho minutos a cuatro grados centígrados y permeabilizar las células con un mililitro de tampón de fijación intracelular y permeabilización.
Mezclar el contenido de un tubo e incubar a cuatro grados centígrados durante 20 minutos. Después de la incubación, centrifugar la suspensión celular y agregar un mililitro de tampón de permeabilización. Nuevamente, centrifugue la suspensión, antes de agregar 100 microlitros de cada una de las concentraciones de trabajo del anticuerpo anti-beta5t o del anticuerpo anti-CCL21.
Incubar durante 60 minutos a temperatura ambiente. Añadir un mililitro de tampón de permeabilización y centrifugar la suspensión celular a 700G durante ocho minutos a cuatro grados centígrados. Ahora agregue 100 microlitros de concentraciones de trabajo de IgG anti-conejo e incube durante 30 minutos a temperatura ambiente.
Después de agregar el tampón de permeabilización, centrifugar la suspensión celular. Vuelva a suspender el pellet celular en 200 microlitros de tampón FACS y mezcle bien. Filtre la suspensión celular a través de una malla de nailon de 60 micras antes del análisis de citometría de flujo.
Los perfiles de citometría de flujo de células de timo digeridas por colagenasa y dispasa de ratones de cero días y ratones de dos semanas demostraron que más del 90% de las señales de partículas representaban células viables. Las señales fluorescentes de las células viables fueron representadas por CD45 y EpCAM. Durante las etapas neonatales, los cTEC fueron más frecuentes que los mTEC, pero después del nacimiento, los mTEC dominaron debido a la baja eficiencia de liberación de cTEC.
La fijación y permeabilización de las células permite la detección de moléculas intracelulares dentro de las TEC. La expresión de Beta5t se detectó en la mayoría de los cTEC, pero no en los mTEC. CCL21 se detectó en una fracción de mTEC, pero no en cTEC.
En comparación, el aire se expresó en una subpoblación de mTEC.
Descripción general
Este artículo describe los protocolos para preparar suspensiones de células individuales de células epiteliales tímicas de ratón y su posterior análisis mediante citometría de flujo. Comprender estas células es fundamental para obtener conocimientos sobre el desarrollo y la selección de linfocitos T.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Inmunología
- Biología Celular
- Citometría de Flujo
Antecedentes
- Los linfocitos T son células inmunitarias esenciales que protegen contra enfermedades.
- El timo es responsable de la producción y selección de linfocitos T.
- Las células epiteliales tímicas desempeñan un papel clave en el desarrollo de los linfocitos T.
- El análisis a nivel de una sola célula ayuda a comprender los mecanismos de selección de linfocitos T.
Objetivo del estudio
- Analizar las células epiteliales tímicas a nivel de célula individual.
- Comprender los mecanismos moleculares implicados en el desarrollo de linfocitos T.
- Mejorar las técnicas de aislamiento para diversas células epiteliales tímicas.
Métodos Utilizados
- Preparación de suspensiones de células individuales a partir de células epiteliales tímicas de ratón.
- Tinción de moléculas intracelulares.
- Análisis citométrico de flujo para un examen detallado.
- Uso de técnicas avanzadas de aislamiento.
Resultados principales
- Aislamiento exitoso de diversas células epiteliales tímicas.
- Mejor comprensión de los mecanismos de desarrollo de linfocitos T.
- La citometría de flujo proporcionó información sobre la expresión de moléculas intracelulares.
- Se establecieron protocolos para investigaciones futuras en biología de linfocitos T.
Conclusiones
- El estudio contribuye a la comprensión de las funciones de las células epiteliales tímicas.
- Los protocolos pueden aplicarse a investigaciones adicionales en inmunología.
- Los conocimientos obtenidos podrían conducir a avances en las terapias con linfocitos T.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La preparación de suspensiones de células individuales y la tinción intracelular de células epiteliales tímicas (TEC) de ratón permiten una interrogación precisa de los mecanismos del desarrollo de linfocitos T a nivel celular. Este flujo de trabajo apoya la desactivación de riesgos mecanicistas y la validación de dianas para programas de descubrimiento centrados en inmunología, especialmente en aquellos casos en los que la selección y la tolerancia impulsadas por TEC son fundamentales. Un análisis citométrico por flujo fiable de subpoblaciones de TEC orienta las decisiones iniciales de cartera y la continuidad traslacional en estrategias de modulación inmunitaria.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite la validación funcional de moléculas expresadas por las CTE implicadas en la selección y tolerancia de linfocitos T.
- Apoya la reducción de riesgos mecanicistas al distinguir las contribuciones de las CTE corticales y medulares en la conformación del repertorio inmune.
- Proporciona datos cuantitativos para orientar la priorización de objetivos y las evaluaciones de plausibilidad biológica.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Establece suspensiones estandarizadas de células individuales para ensayos reproducibles de citometría de flujo.
- Facilita la detección robusta de marcadores intracelulares como beta5t y CCL21 en subpoblaciones definidas de células epiteliales tímicas.
- Permite la escalabilidad del ensayo y la comparabilidad entre estudios para plataformas de perfilado de células inmunitarias.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Se alinea con modelos relevantes para la enfermedad al caracterizar los mecanismos impulsados por las CTE subyacentes a la tolerancia inmune.
- Apoya la continuidad desde el descubrimiento hasta la validación preclínica de dianas de modulación inmune.
- Proporciona una base para el desarrollo de biomarcadores vinculados a la función de las CTE y a la selección de linfocitos T.
Integración de la Línea de Producción y Flujo de Trabajo
Este método se integra en el continuo de descubrimiento a preclínico al permitir el análisis de alta resolución de subpoblaciones de CTE y sus firmas moleculares.
- Biología del Descubrimiento: Avanza en la comprobación de hipótesis sobre los mecanismos de selección y tolerancia de linfocitos T mediados por TEC.
- Selección: Proporciona resultados cuantitativos reproductibles mediante citometría de flujo para la expresión de marcadores en TEC.
- Análisis: Ofrece datos con resolución a nivel de célula individual para el análisis comparativo de subpoblaciones de TEC y la prevalencia de marcadores.
- Investigación Traducional: Conecta los conocimientos mecanicistas con modelos preclínicos de modulación inmunitaria y tolerancia.
- Reutilización Empresarial: Ofrece un protocolo reutilizable para el aislamiento y análisis de TEC en diversos programas de I+D en inmunología.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva en la validación de dianas inmunitarias y reduce la ambigüedad mecanicista en las vías de selección de linfocitos T.
- Valor operativo: Estandariza el aislamiento de células epiteliales tímicas y la tinción intracelular para flujos de trabajo reproducibles y escalables mediante citometría de flujo.
- Valor estratégico: Orienta las decisiones de continuar o descartar proyectos al proporcionar datos sólidos sobre mecanismos inmunitarios impulsados por células epiteliales tímicas.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de dianas de modulación inmunitaria basada en mecanismos celulares validados.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en disociación de tejidos, citometría de flujo y protocolos de tinción intracelular.
- Exige acceso a instrumentación avanzada de citometría de flujo y software analítico.
- Necesita estandarización entre equipos de los procedimientos de preparación y tinción celular para garantizar la comparabilidad de los datos.
- Puede requerir adaptaciones según la edad de los ratones o las frecuencias de subpoblaciones de CTE.
- Las tasas limitadas de recuperación de CTE (1% CTEc, 10% CTEm) pueden restringir el rendimiento y el tamaño de la muestra.
