Name: Investigación de las interacciones entre bacterias y hongos utilizando columnas de carreteras fúngicas en diversos entornos y sustratos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-01-24T12:40:00.000+00:00
Duration: 5 min 22 s
Description: Aprende a construir y utilizar columnas de carreteras fúngicas para enriquecer pares bacterianos-fúngicos de diversos sustratos ambientales. Este protocolo permite estudiar interacciones microbianas y dinámicas ecológicas.

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<ol><li>Or, D., Smets, B. F., Wraith, J. M., Dechesne, A., Friedman, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+constraints+affecting+bacterial+habitats+and+activity+in+unsaturated+porous+media+-+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Water+Resour%22%5BJournal%5D)">Physical constraints affecting bacterial habitats and activity in unsaturated porous media - A review.</a> Adv Water Resour. 30 (6), 1505-1527 (2007).</li>
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</ol>

<table><tbody><tr><td>Tubos de 50 ml</td><td>Greiner BIO-ONE</td><td>5622-7261</td><td>Tubos de 50 ml para realizar experimentos en columna en el laboratorio</td></tr><tr><td>Placas de Petri de 90 mm</td><td>Thermo Scientific Nunc</td><td>08-757-099</td><td>Placas de Petri para la preparación de agar y para el crecimiento microbiano</td></tr><tr><td>Impresora 3D de procesamiento de luz digital (DLP) Asiga Freeform Pico Plus 39</td><td>Asiga Alemania</td><td>Forma libre Pico Plus 39</td><td>Impresora 3D utilizada para generar lotes de las columnas; se pueden utilizar otras impresoras 3D</td></tr><tr><td>Autoclave</td><td>Fisher Scientific</td><td>LS40F20</td><td>Autoclave de sobremesa para esterilizar los componentes de la columna</td></tr><tr><td>Vaso</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB100600</td><td>Vaso de precipitados de 600 ml para diversos usos a lo largo del protocolo</td></tr><tr><td>Resina Dental LT Clear V2</td><td>Laboratorios de forma</td><td>RS-F2-DLCL-02</td><td>Resina alternativa para impresión 3D que fue probada</td></tr><tr><td>Resina para guía quirúrgica dental</td><td>Laboratorios de forma</td><td>RS-F2-SGAM-01</td><td>Se utilizó para generar las columnas discutidas en el manuscrito; Se pueden usar otras resinas fotosensibles en lugar de este material</td></tr><tr><td>Tubos de ADN de baja unión de 1,5 ml</td><td>Eppendorf</td><td>13-698-791</td><td>Tubos utilizados para diversas preparaciones, incluidas las extracciones de ácidos nucleicos</td></tr><tr><td>Conservante de escudo de ADN/ARN</td><td>Investigación Zymo</td><td>R1100-50</td><td>Conservante utilizado antes de las extracciones de ácidos nucleicos</td></tr><tr><td>Bioinformática EDGE</td><td>Código abierto; Desarrollado por el Laboratorio Nacional de Los Álamos (LANL)</td><td>N/A</td><td>Plataforma bioinformática para el procesamiento de datos de amplicones</td></tr><tr><td>Kit de centrifugado FastDNA para suelo</td><td>MP Biomedicals LLC</td><td>116560200-CF</td><td>Opción de kit de extracción de ADN para suelo</td></tr><tr><td>Fórceps</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-300</td><td>Fórceps esterilizables</td></tr><tr><td>Resina transparente BioMed de Formlabs</td><td>Laboratorios de forma</td><td>RS-F2-BMCL-01</td><td>Resina alternativa para impresión 3D que fue probada</td></tr><tr><td>Impresora 3D de estereolitografía (SLA) Form 3B+ de Formlabs</td><td>Laboratorios de forma</td><td>Formulario 3B+</td><td>Impresora 3D alternativa</td></tr><tr><td>Resina IBT de Formlabs</td><td>Laboratorios de forma</td><td>RS-F2-IBCL-01</td><td>Resina alternativa para impresión 3D que fue probada</td></tr><tr><td>Asas de inoculación</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-363-598</td><td>Se utiliza para aislar/transferir microbios</td></tr><tr><td>Agar de extracto de malta (MEA)</td><td>Criterio</td><td>89405-654</td><td>Un tipo de medio utilizado en columnas</td></tr><tr><td>Secuenciador MiSeq + kit de secuenciación MiSeq</td><td>Ilumina</td><td>SY-410-1003</td><td>Puede usar otros secuenciadores</td></tr><tr><td>Mortero y Pilón</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB961K; FB961A</td><td>Puede usar cualquier mortero común y Mortero que se puede esterilizar entre usos</td></tr><tr><td>Kit de preparación de bibliotecas de ADN NEBNext Ultra II para Illumina</td><td>Laboratorios biológicos de Nueva Inglaterra</td><td>E7805S</td><td>Kit de preparación de bibliotecas para secuenciación metagenómica</td></tr><tr><td>Kit de preparación de la biblioteca de ADN Nextera XT (24 muestras)</td><td>Ilumina</td><td>FC-131-1024</td><td>Kit de preparación de bibliotecas para secuenciación de amplicones</td></tr><tr><td>BORDE NMDC</td><td>Código abierto: Desarrollado por National Microbiome Data Collaborative (NMDC)</td><td>N/A</td><td>Plataforma bioinformática para el procesamiento de datos metagenómicos</td></tr><tr><td>Malla de nailon</td><td>Sefar</td><td>03-25/19</td><td>La malla utilizada como parte de la construcción de la columna</td></tr><tr><td>Puntas de pipeta</td><td>Rainin</td><td>30807966</td><td>Puede utilizar muchas puntas de pipeta esterilizadas diferentes para los pasos del protocolo</td></tr><tr><td>Agar de patata dextrosa</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-14200-28</td><td>Un tipo de medio utilizado en columnas</td></tr><tr><td>QIIME2</td><td>Código abierto</td><td>N/A</td><td>Software para procesar datos de amplicones</td></tr><tr><td>Kit de ensayo Qubit dsDNA HS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Pregunta 32851</td><td>Se utiliza para cuantificar el ADN después de extracciones</td></tr><tr><td>Fluorómetro Qubit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Pregunta 33238</td><td>Se utiliza para cuantificar el ADN después de extracciones</td></tr><tr><td>Kit de minipreparación de hongos/bacterias Quick-DNA</td><td>Investigación Zymo</td><td>D6005</td><td>Opción de kit de extracción de ADN que funciona tanto con bacterias como con hongos</td></tr><tr><td>Agar R2A</td><td>BD Difco</td><td>218263</td><td>Un tipo de medio utilizado en columnas (medios bacterianos)</td></tr><tr><td>Gradilla para tubos de 50 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-448-11</td><td>Gradilla para sujetar tubos de 50 ml en posición vertical</td></tr><tr><td>Tijeras</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-000-155</td><td>Tijeras finas de precisión esterilizables</td></tr><tr><td>Medio carboximetilcelulosa de sodio</td><td>Aldrich</td><td>419273-100G</td><td>Un tipo de medio utilizado en columnas</td></tr><tr><td>Software CAD de SolidWorks</td><td>SolidWorks</td><td>N/A</td><td>Software utilizado para diseñar las columnas</td></tr><tr><td>Cuchara de paleta</td><td>Fisher Scientific</td><td>S41701</td><td>Para hacer una depresión en el sustrato antes de agregar la columna</td></tr><tr><td>Agua destilada sin DNasa/RNasa UltraPure</td><td>Invitrogen: ThermoFisher Scientific</td><td>10977015</td><td>Agua para el baño de agua del ultrasonido</td></tr><tr><td>Ultrasonicador</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB-11201</td><td>Ultrasonidos para la limpieza de las columnas</td></tr></tbody></table>

investigación de las interacciones entre bacterias y hongos utilizando columnas de carreteras fúngicas en diversos entornos y sustratos

Investigating Bacterial-Fungal Interactions using Fungal Highway Columns in Diverse Environments and Substrates

La columna de la carretera fúngica completamente ensamblada tiene aproximadamente 5 cm de largo (Figura 1). La columna no debe romperse en ningún área, y las tapas y el anillo roscado deben encajar fácil y firmemente para crear microambientes dentro de la columna. La malla del filtro puede extenderse más allá del anillo roscado (como se muestra en la Figura 1 y la Figura 2), o se puede recortar con tijeras esterilizadas. Los tapones de agar deben encajar perfectamente en cada extremo de la columna. Cuando se coloca en el sustrato, la malla del filtro debe entrar en contacto con el sustrato y la columna no debe estar completamente enterrada.
Las columnas fueron previamente probadas en estiércol de caballo9. Las columnas también se colocaron en suelo a granel y de rizosfera en un sitio de campo de investigación, así como en pequeños volúmenes de suelo en tubos de 50 mL en el laboratorio (Figura 3). Después de que las columnas de la carretera fúngica se retiraron del sustrato y se desmontaron, el crecimiento microbiano fue visible tanto en el cebo como en los tapones de los medios objetivo (ejemplos mostrados en la Figura 4A). Las bacterias y los hongos se aislaron de los medios objetivo y de cebo mediante técnicas de subcultivo (Figura 4B), y los microbios presentes en los tapones de los medios se identificaron taxonómicamente mediante secuenciación de amplicones (Figura 4C, D). La Figura 4C, D muestra los resultados combinados de la secuenciación de amplicones a través de múltiples experimentos, mostrando qué microbios pudieron alcanzar el tapón de medios objetivo desde las columnas agregadas al estiércol de caballo9. Las visualizaciones de estos datos bacterianos y fúngicos se generaron como se describe en el paso 17. Los resultados también pueden mostrarse como abundancias relativas de taxones.
Se han obtenido resultados subóptimos en los casos en los que las columnas se añadieron a ambientes de humedad extremadamente baja, y los tapones de los medios se secaron por completo en cuestión de días, lo que provocó que no se recuperaran los microbios colonizados (Figura 5A). También hemos visto casos en los que los microbios simplemente no crecen a partir del conector de medios objetivo (Figura 5B), y casos en los que no recuperamos suficientes datos de secuenciación del conector de medios objetivo para realizar análisis significativos. Otros casos en los que los hongos crecen demasiado fuera de las columnas también han dado lugar a la necesidad de repetir los experimentos (Figura 5C).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66989/66989fig03.jpg"> 
Figura 3: Ejemplos de las columnas colocadas en muestras ambientales en laboratorio y campo. (A) Columna colocada dentro de un tubo de 50 mL con tierra humedecida en un entorno de laboratorio. También se muestra con una regla para la escala. (B) Columna colocada en el suelo en el campo. (C) Columna colocada en la red de raíces de una planta en el campo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66989/66989fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66989/66989fig04.jpg"> 
Figura 4: Resultados representativos de experimentos exitosos con columnas. (A) Ejemplos de tapones de medios colonizados extraídos de columnas. (B) Ejemplos de aislados de hongos subcultivados a partir de medios objetivo. El sustrato era tierra. Secuencia ITS superior Identidad de NCBI BLAST de izquierda a derecha: Rhizopus azygosporous, Aspergillus novofumigatus, Curvularia subpapendorfii y Phaeomycocentrospora cantuariensis. (C,D) Cladogramas circulares que muestran la diversidad filogenética de (C) secuencias de ITS fúngicos y (D) 16S bacterianas recuperadas de los medios objetivo después de múltiples experimentos de carreteras fúngicas utilizando estiércol de caballo. Las secciones están coloreadas y etiquetadas por filo, con nodos finales que representan géneros únicos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66989/66989fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66989/66989fig05.jpg"> 
Figura 5. Resultados subóptimos de experimentos en columna. (A) Un ejemplo de un tapón de medio desecado resultante de condiciones ambientales de baja humedad. (B) Ejemplo de ausencia de crecimiento microbiano a partir de un tapón de medios de columna. (C) Ejemplo de crecimiento excesivo del hongo a través de la parte superior (medio objetivo) de la columna. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66989/66989fig05large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Investigación de las interacciones entre bacterias y hongos utilizando columnas de carreteras fúngicas en diversos entornos y sustratos

Bacterial-fungal interactions (BFIs) play an integral role in shaping microbial community composition, biogeochemical functions, spatial dynamics, and ...

[Narrador] Este estudio se centra en las interacciones fúngicas bacterianas para comprender cómo estos microbios pueden influir en los comportamientos de los demás. Este trabajo investiga las bacterias que utilizan la hiphy fúngica para el transporte. Obtener información sobre estas interacciones permite el estudio de microbiomas complejos en entornos como el suelo. Los exámenes del transporte bacteriano a lo largo de las hifas se han realizado tradicionalmente en placas de Petri modificadas, pero los avances recientes en la tecnología de impresión 3D han permitido el diseño y la fabricación de dispositivos que pueden imitar mejor las condiciones nativas para que estos microbios interactúen. Estas columnas de carreteras fúngicas se han utilizado con éxito en suelos, rizosferas y herbívoros en entornos de dos continentes. Estos dispositivos también pueden servir como herramientas de enseñanza efectivas o ser aplicados por otros grupos de investigación para ampliar el conocimiento colectivo sobre las interacciones fúngicas bacterianas. Para comenzar, vierta medios esterilizados a base de barrena en placas de Petri de 90 milímetros hasta que la barrena esté cerca de la parte superior de los lados de las placas de Petri. A continuación, coloque un extremo de una columna de carretera de hongos en una de las placas de medios solidificados. Levante la columna del medio con un movimiento giratorio para que el sinfín permanezca dentro del extremo de la columna y cree un tapón de medio. Agregue la tapa pequeña sobre el extremo con el tapón de medios para mantener un microambiente estéril para los medios de destino. Dale la vuelta a la columna y crea un enchufe multimedia para el otro extremo. Con unas tijeras esterilizadas, corte una pieza circular de una malla de nailon en autoclave con un diámetro de dos centímetros. Coloque la malla sobre el extremo expuesto de la columna. Gire el anillo roscado en el extremo del medio de cebo de la columna mientras asegura la malla dentro de los hilos. Ahora, coloque una tapa grande en la parte inferior de la columna sobre la malla y el otro extremo del anillo roscado. Establecer un microcosmos de suelo de laboratorio. Retire la tapa grande de la parte inferior de la columna para exponer el anillo roscado y la malla. Agregue la columna al microcosmos del suelo de modo que toda la sección inferior esté dentro del suelo. Retire la columna después de que haya estado en contacto con el sustrato durante el tiempo deseado. Sacuda con cuidado cualquier exceso de sustrato y vuelva a colocar la tapa grande en la parte inferior de la columna debajo de la malla. Coloque la columna en un tubo de 50 mililitros para su transporte. Transfiera la columna a un entorno estéril, como un gabinete de seguridad biológica. Retire la tapa grande del medio de cebo, el anillo roscado y la malla. Luego retire la tapa pequeña del extremo de la columna que contiene el medio objetivo. Use fórceps esterilizados para extraer el tapón. Transfiera el tapón del medio de destino directamente al centro de una placa de Petri de 90 milímetros que contenga medio de barrena. Para extraer el ADN, primero congele todos los tapones de barrena o las piezas seleccionadas de las columnas en tubos de centrífuga de 1,5 mililitros a menos 20 grados centígrados. Alternativamente, sumerja las piezas del tapón en un conservante contenido en un tubo de centrífuga de 1,5 mililitros antes de la extracción. Talle una pieza de barrena de un centímetro que contenga el crecimiento microbiano del objetivo cultivado o del medio de cebo. Para extracciones de colonias bacterianas aisladas, use un asa de inoculación estéril para deslizar una colonia de la placa. Gire el bucle directamente en el tampón de extracción de ADN disponible comercialmente. Para extracciones de hongos aislados, use un mortero para moler las piezas de la barrena por separado en nitrógeno líquido. Transfiera las muestras molidas a tubos de extracción. Usando un kit de extracción de ADN comercial optimizado para bacterias y hongos, extrae el ADN. Luego use un fluorímetro para cuantificar el ADN resultante. El crecimiento microbiano fue visible tanto en el cebo como en los tapones del medio objetivo después de que las columnas de la carretera fúngica se retiraron del sustrato y se desmontaron. Las bacterias y los hongos se aislaron del medio objetivo y del cebo mediante técnicas de subcultivo. Los microbios presentes en los tapones de medios se identificaron taxonómicamente. No se encontró recuperación de microbios colonizados cuando las columnas se agregaron a ambientes de humedad extremadamente baja. En algunos casos, los microbios simplemente no crecieron desde el tapón del medio objetivo o se observó un crecimiento excesivo de hongos a través de la parte superior de la columna.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Fuente: Schlafer, S, y Frost Kristensen, M. Monitorización del pH extracelular en biofilms inter-reino mediante microscopía confocal. J. Vis. Exp. (2020)Este vídeo demuestra el cultivo de biopelículas cruzadas de Streptococcus mutans y Candida albicans bajo condiciones similares a las orales para modelar las interacciones bacteriana-fúngica, permitiendo el estudio de la sinergia microbiana, la adhesión mediada por glucano y la virulencia acidogénica en la patogénesis oral.

Establecimiento de biopelículas bacteriana-fúngica cruzadas para el estudio de la patogénesis oral

Fuente: Miquel Guennoc, C., et al. Nuevo método para el análisis cualitativo multiescala de biopelículas bacterianas en colonias fúngicas filamentosas utilizando microscopía confocal y electrónica. J. Vis. Exp. (2017)Este vídeo demuestra la preparación de un cultivo fúngico en membranas de celofán tratadas para apoyar la formación de colonias y el crecimiento radial. Luego muestra el cultivo y la preparación de células bacterianas del suelo para ensayos de interacción. Finalmente, ilustra cómo...

Establecimiento de una cocultura fúngico-bacteriana para la formación de biopelículas

Este video describe un método para cultivar y analizar cualitativamente biopelículas bacterianas en hifas fúngicas utilizando microscopía. Las biopelículas bacterianas se forman con frecuencia en las superficies fúngicas e involucran numerosos procesos de interacción bacteriano-fúngico, como la cooperación metabólica, la competencia o la depredación.

Un método para la preparación de muestras para visualizar bacterias formadoras de biopelículas en hifas fúngicas

Las bacterias producen compuestos secretados que tienen el potencial de afectar a la fisiología de sus vecinos microbianos. Aquí se describe una pantalla de co-cultivo que permite la detección de este tipo de interespecies mediadas químicamente interacciones mediante la mezcla de los microbios del suelo con cepas reportero transcripcional fluorescentes de Bacillus subtilis en medios sólidos.

Usando Coculture detectar químicamente mediadas por interacciones interespecíficas

Este protocolo describe un nuevo método para hacer crecer y cualitativamente analizar biopelículas bacterianas en hifas de los hongos por microscopía confocal y electrónica.

Un nuevo método para el análisis cualitativo multi-escala de biopelículas bacterianas en filamentosa fúngica Colonias Utilizando microscopía confocal y electrónica

Mayoría de las plantas dentro de las comunidades probablemente está interconectada por los hongos arbusculares micorrícicos (AM), pero la mediación de las interacciones de la planta por ellos ha sido investigada principalmente por cultivo de plantas con y sin micorrizas. Se presenta un método para manipular redes mycorrhizal comunes entre plantas micorrizadas para investigar sus consecuencias en las interacciones planta.

Investigación de las interacciones de la planta a través de redes de micorrizas comunes utilizando núcleos girados

Los ensayos de interacción de cocultura presentados en este protocolo son económicos, de alto rendimiento y simples. Estos ensayos se pueden utilizar para observar interacciones microbianas en el cocultivo, identificar patrones de interacción y caracterizar el potencial inhibitorio de una cepa microbiana de interés contra patógenos humanos y ambientales.

Ensayos de cocultura de alto rendimiento para la investigación de interacciones microbianas

Aquí, presentamos un protocolo para el cribado de la biodiversidad del suelo para buscar cepas de hongos involucradas en la degradación de materiales recalcitrantes. En primer lugar, se aíslan cepas fúngicas capaces de crecer con ácidos húmicos o lignocelulosa. Su actividad se prueba tanto en ensayos enzimáticos como en contaminantes como hidrocarburos y plásticos.

Aislamiento y cribado de la biodiversidad del suelo para hongos involucrados en la degradación de materiales recalcitrantes

Este protocolo tiene como objetivo proporcionar procedimientos detallados para recolectar, fijar y mantener muestras de plantas micoheterótrofas, aplicando diferentes técnicas de microscopía como microscopía electrónica de barrido y transmisión, microscopía de luz, confocal y fluorescencia para estudiar la colonización fúngica en tejidos vegetales y semillas germinadas con hongos micorrícicos.

Técnicas de microscopía para interpretar la colonización fúngica en tejidos de plantas micoheterótrofas y germinación simbiótica de semillas

Debido a la opacidad del suelo, las interacciones entre sus microbios constituyentes no se pueden visualizar fácilmente con resolución celular. Aquí, se presentan dos herramientas microfluídicas, que ofrecen nuevas oportunidades para investigar las interacciones fúngico-microbianas. Los dispositivos son versátiles y fáciles de usar, lo que permite un alto control espaciotemporal e imágenes de alta resolución a nivel celular.

Herramientas microfluídicas para sondear las interacciones fúngico-microbianas a nivel celular

Aprende a construir y utilizar columnas de carreteras fúngicas para enriquecer pares bacterianos-fúngicos de diversos sustratos ambientales. Este protocolo permite estudiar interacciones microbianas y dinámicas ecológicas.

Investigación de las interacciones entre bacterias y hongos utilizando columnas de carreteras fúngicas en diversos entornos y sustratos (Video) | JoVE Journal

Investigación de las interacciones entre bacterias y hongos utilizando columnas de carreteras fúngicas en diversos entornos y sustratos

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