Name: Inmunotinción de montaje completo y recuento automático de células ganglionares de la retina de ratón (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 52 s
Description: Aprende a realizar inmunotinción de montaje completo en retina de ratón y cuantificación automatizada de células ganglionares con software de inteligencia artificial. Este método acelera la investigación del glaucoma.

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<meta charset="utf8"></head><body>Inmunotinción y recuento basado en IA de RGC en retina de montaje completo de ratón

<ol><li>Quigley, H. A., Broman, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+number+of+people+with+glaucoma+worldwide+in+2010+and+2020%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">The number of people with glaucoma worldwide in 2010 and 2020.</a> Br J Ophthalmol. 90 (3), 262-267 (2006).</li>
<li>Gallo Afflitto, G., Swaminathan, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Racial-ethnic+disparities+in+concurrent+rates+of+peripapillary+%26+macular+OCT+parameters+among+a+large+glaucomatous+clinical+population%5BTitle%5D)+AND+%22Eye%22%5BJournal%5D)">Racial-ethnic disparities in concurrent rates of peripapillary & macular OCT parameters among a large glaucomatous clinical population.</a> Eye. , (2024).</li>
<li>Atkinson, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+measure+of+patient+satisfaction+with+ocular+hypotensive+medications%3A+the+Treatment+Satisfaction+Survey+for+Intraocular+Pressure+%28TSS-IOP%29%5BTitle%5D)+AND+%22Health+Qual+Life+Outcomes%22%5BJournal%5D)">A new measure of patient satisfaction with ocular hypotensive medications: the Treatment Satisfaction Survey for Intraocular Pressure (TSS-IOP).</a> Health Qual Life Outcomes. 1, 67(2003).</li>
<li>Guo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+mouse-fixation+device+for+IOP+measurement+in+awake+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Vision+Res%22%5BJournal%5D)">A new mouse-fixation device for IOP measurement in awake mice.</a> Vision Res. 219, 108397(2024).</li>
<li>Almasieh, M., Wilson, A. M., Morquette, B., Cueva Vargas, J. L., Di Polo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+basis+of+retinal+ganglion+cell+death+in+glaucoma%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Retin+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">The molecular basis of retinal ganglion cell death in glaucoma.</a> Prog Retin Eye Res. 31 (2), 152-181 (2012).</li>
<li>Jeon, C. J., Strettoi, E., Masland, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+major+cell+populations+of+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The major cell populations of the mouse retina.</a> J Neurosci. 18 (21), 8936-8946 (1998).</li>
<li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automatic+counting+of+retinal+ganglion+cells+in+the+entire+mouse+retina+based+on+improved+YOLOv5%5BTitle%5D)+AND+%22Zool+Res%22%5BJournal%5D)">Automatic counting of retinal ganglion cells in the entire mouse retina based on improved YOLOv5.</a> Zool Res. 43 (5), 738-749 (2022).</li>
<li>Al-Khindi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcription+factor+Tbx5+regulates+direction-selective+retinal+ganglion+cell+development+and+image+stabilization%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">The transcription factor Tbx5 regulates direction-selective retinal ganglion cell development and image stabilization.</a> Curr Biol. 32 (19), 4286-4298 (2022).</li>
<li>Claes, M., Moons, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+ganglion+cells%3A+Global+number%2C+density+and+vulnerability+to+glaucomatous+injury+in+common+laboratory+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Retinal ganglion cells: Global number, density and vulnerability to glaucomatous injury in common laboratory mice.</a> Cells. 11 (17), 2689(2022).</li>
<li>Zhang, N., Wang, Z., Lin, P., Xing, Y., Yang, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methanol-based+whole-mount+preparation+for+the+investigation+of+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Methanol-based whole-mount preparation for the investigation of retinal ganglion cells.</a> J Vis Exp. (194), e65222(2023).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>1&veces; PBS</td><td>Servicebio</td><td>G4202</td><td></td></tr><tr><td>Alexa594-conjugado Cabra Anti-Conejo IgG&nbsp; (H+L)</td><td>ThermoFisher</td><td>A-11012</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-BRN3A [EPR23257-285]</td><td>Abcam</td><td>ab245230</td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td> AutoCount <td>https://github.com/MOEMIL/Intelligent-quantifying-RGCs</td></tr><tr><td>Disco en la nube</td><td>Enlace de unidad</td><td></td> de Google <td>https://drive.google.com/file/d/1yOEsBvil6KEdZFa5ENQxB6&nbsp;</td></tr><tr><td>Disco en la nube</td><td>Enlace Baidu</td><td>Código de extracción: g44k</td><td>https://pan.baidu.com/s/1lccg1OVbeudsp2VtnqxWZg&nbsp;</td></tr><tr><td>Rotulador</td><td>Sharpie</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Normal Donkey Serum</td><td>Biosharp, Labgic</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehído</td><td>Macklin</td><td>P804536</td><td></td></tr><tr><td>ProClean 300</td><td>Beyotime</td><td>ST853</td><td></td></tr><tr><td>Sacarosa</td><td>BBI, Sangon</td><td>A610498</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>BioFroxx, neoFroxx</td><td>1139ML100</td><td></td></tr></tbody></table>

inmunotinción de montaje completo y recuento automático de células ganglionares de la retina de ratón

Whole-Mount Immunostaining and Automatic Counting of Mouse Retinal Ganglion Cells

Este protocolo detalla la metodología para la inmunotinción de montaje completo de retinas de ratón, lo que garantiza una preparación meticulosa del tejido, una incubación precisa de anticuerpos y un recuento celular automatizado fiable. El procedimiento facilita el etiquetado y la cuantificación robustos de las células ganglionares de la retina (RGC), lo que permite una evaluación precisa de las poblaciones celulares en diversos contextos experimentales. El método se utilizó para contar las CGR en ratones de tipo salvaje y modelados con glaucoma, obteniendo resultados consistentes. Un resultado representativo muestra que el número de RGC en un ratón adulto normal a los 2 meses de edad es de aproximadamente 45.000 (Figura 6).
Para evaluar si el software de IA puede cuantificar con precisión las RGC marcadas con BRN3a en modelos normales y de enfermedad, generamos un modelo de ratón de glaucoma inducido por N-metil-D-aspartato (NMDA)7. La retina de montaje completo de este modelo se inmunotiñó con anti-BRN3A, y las RGC se cuantificaron utilizando el software de recuento automático. El resultado indicó una tinción de fondo relativamente alta (Figura 7). No obstante, el software fue capaz de identificar con precisión casi todos los RGC. Se identificaron un total de 15.231 RGC en esta retina, en comparación con aproximadamente 45.000-50.000 RGC en una retina normal de ratón, lo que indica una degeneración grave. Por lo tanto, el software de IA también se puede utilizar de manera efectiva para contar RGC en retinas con una calidad de tinción menos óptima.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66991/66991fig01.jpg"> Figura 1: Diagrama esquemático para la preparación de RGC. (A) Se retira el globo ocular y se coloca en 1x PBS. (B) El globo ocular se fija en PFA al 4% sobre hielo durante 3 h. (C) Extracción de la córnea. (D) Extracción de la lente. (E) El ocular se divide en 4 solapas con unas tijeras. (F) La esclerótica se despega y los residuos se eliminan suavemente de la superficie de la retina con un cepillo suave. (G) La retina está inmunomarcada con anti-BRN3A. (H) Las señales fluorescentes se visualizan utilizando un microscopio confocal. (I) Conteo automático de RGCs. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66991/66991fig01large.jpg" target="_blank">Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta cifra.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66991/66991fig02v3.jpg"> Figura 2: Aislamiento de la retina entera del ratón. (A) El ratón es sacrificado por dislocación cervical. (B) El ratón se coloca sobre una superficie plana. (C) El globo ocular se extrae cuidadosamente con unas tijeras. (D) El globo ocular se coloca suavemente en 1x PBS. (E) El globo ocular se fija con pinzas en el borde de la córnea. (F) Se hace una pequeña incisión en el borde de la córnea con una aguja. (G) La estructura en forma de cuenco se retira después de extraer la córnea. (H) La lente se retira cuidadosamente con pinzas. (I) Se realiza una pequeña incisión a lo largo del borde de la córnea hacia el nervio óptico en la esclerótica, evitando dañar la retina. (J) La esclerótica se abre a lo largo de la incisión con fórceps. (K) La retina se aplana y se limpia con un pincel. (L) La retina se aplana y se fija rápidamente con metanol helado. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66991/66991fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66991/66991fig03.jpg"> Figura 3: Inmunotinción de la retina de ratón de montaje completo. (A) Después de lavar con 1x PBS, la retina se bloquea con un tampón de bloqueo. (B) La retina se incuba con un anticuerpo primario a 4 °C durante la noche. (C) La retina se lava con 1x PBS tres veces. (D) La retina se incuba con un anticuerpo secundario durante 2 h a temperatura ambiente. (E) La retina está montada en un portaobjetos de vidrio con los RGC hacia arriba. (F) Las imágenes se adquieren utilizando un microscopio confocal láser. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66991/66991fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66991/66991fig04.jpg"> Figura 4: Instalación del software de conteo automático. (A) El paso 1 implica actualizar la ruta del archivo al directorio "yolov5_cpu". (B) Se inicia la interfaz gráfica. (C) Verificación de la presencia del archivo del modelo en el directorio raíz de la unidad C. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66991/66991fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66991/66991fig05.jpg"> Figura 5: Funcionamiento del software de conteo automatizado RGC. (A) Se abre el software de conteo. (B) Se hace clic en el botón ABRIR IMAGEN para importar la imagen. (C) Se hace clic en el botón EJECUTAR para iniciar el conteo automático. (D) Las celdas contadas están marcadas con un cuadro cuadrado rojo y el número de celda se muestra en la esquina superior derecha. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66991/66991fig05large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66991/66991fig06.jpg"> Figura 6: Recuento automatizado de RGC de ratón. El panel superior (izquierda) muestra los resultados representativos de la retina de montaje plano inmunoteñida con anti-BRN3A; el panel superior (derecha) muestra el conteo automatizado de RGC con software desarrollado previamente. Barra de escala: 100 μm. Las inserciones de los paneles superiores se amplían y se muestran en el panel inferior, respectivamente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66991/66991fig06large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66991/66991fig07.jpg"> Figura 7: Recuento de RGC en un modelo de ratón de glaucoma inducido por NMDA. Panel izquierdo: Vista general de la retina de montaje completo, que muestra los RGC reconocidos por el software de IA. Panel derecho: Vista ampliada de un área parcial de la retina. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66991/66991fig07large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Inmunotinción de montaje completo y recuento automático de células ganglionares de la retina de ratón

Glaucoma is a leading cause of blindness globally, characterized by a complex pathogenic mechanism that makes vision restoration challenging. Mice serve ...

whole-mount-immunostaining-automatic-counting-mouse-retinal-ganglion

Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

Este video muestra el procedimiento para aislar células ganglionares primarias de la retina (RGCs) murinas mediante citometría de flujo. Este método permite el estudio futuro de las RGCs, con el objetivo de comprender mejor la importante disminución de la agudeza visual que resulta de la pérdida de RGCs funcionales en las enfermedades neurodegenerativas.

Aislamiento de células ganglionares de la retina murinas mediante clasificación celular activada por fluorescencia

Fuente: Lani-Louzada, R., et al. Cauterización de círculo completo del plexo vascular limbal para el glaucoma inducido quirúrgicamente en roedores. J. Vis. Exp. (2022). Este video demuestra la cuantificación de células ganglionares de la retina de retinas de rata fijadas químicamente y sometidas a la cauterización de círculo completo del plexo vascular limbal. El proceso incluye permeabilización, tinción de anticuerpos y contratinción nuclear, seguida de la visualización bajo un microscopio de...

Cuantificación de los somas de células ganglionares de la retina después de la hipertensión ocular inducida por cauterización 

Fuente: Wang, Z., et al. Transpupillary Two-Photon In Vivo Imaging of the Mouse Retina. J. Vis. Exp. (2021).Este video muestra una técnica para obtener imágenes de la retina in vivo utilizando microscopía de dos fotones. Los ratones anestesiados se preparan para la obtención de imágenes asegurando sus cabezas, aplicando lubricante ocular y colocando un cubreobjetos sobre el ojo. Las células ganglionares de la retina (CGR) que expresan proteínas fluorescentes se visualizan primero mediante...

Imágenes in vivo de dos fotones de la retina del ratón

Fuente: Laboissonniere, et. al. Secuenciación de ARN unicelular de subconjuntos definidos de células ganglionares de la retina. J. Vis. Exp. (2017).  Este video muestra una técnica de trazado fluorescente para identificar subtipos de células ganglionares de la retina (RGC) en la retina de un ratón transgénico. El proceso consiste en asegurar la retina aislada en una cámara de registro, mantener la viabilidad celular con perfusión oxigenada y dirigirse a las RGC marcadas con fluorescencia...

Identificación de subtipos de células ganglionares de la retina de ratón mediante trazado fluorescente

La retina murino neonatal proporciona un modelo bien caracterizado fisiológica de la angiogénesis, que permite que las investigaciones de las funciones de los diferentes genes o fármacos que modulan la angiogénesis en...

Todo el montaje de la tinción de inmunofluorescencia del Neonatal ratón Retina de investigar Angiogénesis<em&gt; En vivo</em

Protocolos de inmunohistoquímica se utilizan para estudiar la localización de una proteína específica en la retina. Se emplean técnicas de imagen de calcio para estudiar la dinámica del calcio en las células ganglionares de la retina y sus axones.

Inmunohistoquímicos y métodos de imagen de calcio en Wholemount Rata Retina

Millones de personas sufren de enfermedades degenerativas retinianas que resultan en ceguera irreversible. Un elemento común de muchas de estas enfermedades es la pérdida de células ganglionares de la retina (RGCs). Este protocolo detallado describe el aislamiento de los RGC murinos primarios mediante selección positiva y negativa con citometría de flujo.

Aislamiento de células primarias de ganglio retiniano murino (RGC) por citometría de flujo

Este artículo describe un ensayo de tinción de lectina bien establecido y reproducible para las preparaciones retinianas de montaje completo y los protocolos necesarios para la medición cuantitativa de los parámetros vasculares frecuentemente alterados en las retinopatías proliferativas y no proliferativas.

Cuantificación de parámetros vasculares en retinas de monte entero de ratones con retinopatías no proliferativas y proliferativas

Este manuscrito presenta un protocolo para la preparación histológica de láminas a partir de globos oculares de roedores. Con el método propuesto, la retina interna puede visualizarse y evaluarse fácilmente bajo un microscopio óptico. El procedimiento se presenta para los globos oculares de ratones y ratas.

Preparación y análisis de láminas histológicas de globos oculares de rata y ratón para evaluar la retina

La retina exhibe una organización espacial compleja a través de su estructura laminar. La transcriptómica espacial moderna y las técnicas de secuenciación requieren secciones de tejido &lt; 20 μm de grosor, lo que limita su aplicabilidad en la investigación de la retina. Este método de criosección recién congelada produce secciones delgadas en la cara de la retina del ratón al tiempo que preserva las relaciones espaciales planas, lo que permite un mapeo molecular completo a través de las...

En la cara Crioseccionamiento de retina de ratón para análisis molecular espacial de alta dimensión

Aprende a realizar inmunotinción de montaje completo en retina de ratón y cuantificación automatizada de células ganglionares con software de inteligencia artificial. Este método acelera la investigación del glaucoma.

Inmunotinción de montaje completo y recuento automático de células ganglionares de la retina de ratón

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