Ingeniería de proteínas por visualización de superficie de levadura

En mi laboratorio, estamos diseñando terapias celulares de próxima generación combinando la ingeniería de proteínas con la ingeniería celular. Por lo tanto, diseñamos componentes de proteínas para obtener nuevas funciones o mejorar las existentes, y luego incorporamos estas proteínas nulas en la terapéutica celular. Hemos desarrollado aún más la visualización de superficie de uso para aplicaciones especializadas, incluida la ingeniería de estabilidad de proteínas, la ingeniería de interruptores de proteínas regulados por moléculas pequeñas y la orientación específica de confirmaciones de receptores activados asociados con el cáncer.

La ventaja de la visualización de la superficie de la levadura en comparación con otras tecnologías de visualización, como la visualización de fagos o ribosomas, es la visualización citométrica de flujo de la biblioteca durante el proceso de clasificación y el control preciso de las condiciones de selección, como la concentración de antígenos y la rigurosidad de la puerta de clasificación. Para comenzar, prepare las cuentas para la primera selección de cuentas resuspendiendo 10 microlitros de perlas magnéticas de aglutinante de biotina en 990 microlitros de PBSA. Para lavar, coloque el tubo en una rejilla magnética durante dos minutos con la tapa abierta.

A continuación, retire con cuidado el sobrenadante. Resuspender las perlas lavadas en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros en un mililitro de PBSA con 6,7 a 33 picomoles de antígeno biotinilado. Después de la incubación, coloque el tubo en una rejilla magnética durante dos minutos con la tapa abierta, retire el sobrenadante y lave las perlas cargadas de antígeno con un mililitro de PBSA.

Una vez que las cuentas se asienten, retire el PBSA. A continuación, vuelva a suspender las perlas cargadas de antígeno en 50 microlitros de PBSA. Prepare las células, las perlas de antígeno y una solución de perlas de oso para las selecciones negativas.

Después del lavado, vuelva a suspender las perlas de antígeno en 50 microlitros de PBSA y vuelva a suspender las perlas de oso en 150 microlitros de PBSA. Para la primera selección negativa, agregue 50 microlitros de perlas desnudas lavadas a 950 microlitros de células lavadas en PBSA e incube la mezcla durante 1,5 horas a cuatro grados centígrados. Después de la incubación, coloque los tubos que contienen las suspensiones de células de cuentas de oso en una rejilla magnética con la tapa abierta.

Pipetea cualquier líquido de la tapa en el tubo y espera dos minutos. A continuación, transfiera las células libres a un tubo de microcentrífuga nuevo y añada 50 microlitros de cuentas de oso lavadas. Después de tres rondas de selección negativa, agregue 50 microlitros de solución de perlas cargada de antígeno a las células.

Incubar durante dos horas a cuatro grados centígrados. Ahora coloque las células que contienen las perlas cargadas de antígeno en una rejilla magnética con la tapa abierta. Pipetee cualquier líquido que esté en la tapa en el tubo.

Espere dos minutos antes de desechar las celdas no unidas. Realice todos los pasos restantes como se describe para la primera selección de perlas de antígeno. Después de tres selecciones negativas y una positiva, resuspenda rápidamente las células en un mililitro de SDCAA y transfiéralas a un matraz agitador que contenga un volumen mayor de SDCAA.

Después de la inducción durante la noche de la expresión superficial de proteínas en SGCAA en bibliotecas de levaduras, se granulan suficientes células para cubrir 10 veces la diversidad y se desecha el sobrenadante. Vuelva a suspender el pellet en PBSA y transfiéralo a tubos de microcentrífuga. Utilice 30 millones de células para la tinción en cada tubo.

Prepare tantos tubos como sea necesario en función de la diversidad, incluido un tubo de control sin el antígeno. A continuación, centrifugar los tubos a 2000 x g durante cinco minutos a temperatura ambiente. Vuelva a suspender el pellet en 200 microlitros de PBSA que contenga el antígeno e incube durante una hora a cuatro grados centígrados.

Después de realizar la centrifugación una vez más, retire el PBSA del pellet. A continuación, vuelva a suspender las células en 100 microlitros de PBSA frío que contenga anticuerpos para la tinción de la pantalla y la detección de antígenos. Incubar durante 30 minutos a cuatro grados centígrados.

Después de la incubación, centrifugar las células a 2000 x g durante cinco minutos a cuatro grados centígrados. Agregue un mililitro de PBSA al pellet y repita la centrifugación. Luego retire la mayor parte del sobrenadante, dejando solo de 20 a 30 microlitros para evitar que el pellet se seque.

Vuelva a suspender el pellet en PBSA frío justo antes de clasificar. Ahora clasifique las celdas directamente en SDCAA, un medio. Después de la clasificación, transfiera las células a un matraz agitador que contenga un mayor volumen de medio SDCAA e incube a 30 grados centígrados con agitación a 180 RPM.