Name: Ingeniería de proteínas por visualización de superficie de levadura (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-29T13:40:00.000+00:00
Duration: 5 min 49 s
Description: Aprende ingeniería de proteínas mediante visualización de superficie de levadura para desarrollar terapias celulares de próxima generación. Este método permite el control preciso de condiciones de selección y citometría de flujo.

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<meta charset="utf8"></head><body>Optimización de las funciones de las proteínas a través de técnicas de visualización de la superficie de la levadura

La visualización de la superficie de la levadura es una de las tecnologías clave en el campo de la ingeniería de proteínas. Permite la selección de variantes de proteínas con propiedades deseadas, como una mejor afinidad o estabilidad. Introducida por primera vez en 19971, es una de las tecnologías de visualización más utilizadas junto con la visualización de fagos 2,3, la visualización de ribosomas4 y la visualización de células de mamíferos 5,6,7. La proteína de interés (POI) se muestra en la superficie de las células de levadura fusionándola para anclar proteínas. Dispone de una gama de diferentes proteínas de anclaje y, lo más común, el POI se fusiona con el extremo C-terminal de la proteína de apareamiento aglutinina de levadura Aga2p 1,8. Además, el POI suele estar flanqueado por dos etiquetas, como una etiqueta de hemaglutinina (HA-tag) y una etiqueta c-myc, que permite la detección del nivel de visualización mediante el uso de anticuerpos marcados con fluorescencia y citometría de flujo (Figura 1A). Las campañas típicas de selección de levadura implican una combinación de selecciones de perlas magnéticas y clasificación por citometría de flujo. Las selecciones de perlas permiten el manejo de grandes cantidades de células y el enriquecimiento de variantes proteicas que se unen al antígeno diana también con bajas afinidades, ya que las interacciones polivalentes con las perlas cargadas de antígeno conducen a efectos de avidez y, por lo tanto, evitan la pérdida de variantes de baja afinidad (Figura 1B). El análisis y la selección de citometría de flujo ofrecen la ventaja de visualizar la unión de las variantes de POI mostradas al antígeno marcado. En consecuencia, las poblaciones de unión se pueden clasificar y cultivar, lo que conduce al enriquecimiento de variantes de proteínas con las características deseadas a lo largo de varias rondas de clasificación. Además, se pueden realizar rondas adicionales de mutagénesis aleatoria para aumentar aún más la diversidad y, por lo tanto, la probabilidad de encontrar mutaciones adicionales que contribuyan a la afinidad y/o estabilidad de la proteína.
La visualización de la superficie de la levadura presenta ciertas ventajas, como (a) la maquinaria de expresión eucariota, que permite el plegamiento oxidativo de proteínas, así como modificaciones eucariotas postraduccionales (como la N-glicosilación), (b) la normalización de la expresión debido a la detección de las dos etiquetas peptídicas que flanquean la proteína, (c) la inspección visual del progreso de la selección mediante citometría de flujo (por ejemplo, porcentaje de células de unión e intensidad de unión) y (d) la posibilidad de analizar mutantes de proteínas individuales en levadura (por ejemplo, analizando la termoestabilidad y la afinidad), presentando una alternativa que ahorra tiempo a la laboriosa expresión y purificación de proteínas9. De hecho, tanto las afinidades (valores de KD) como las estabilidades (valores de T50) de las proteínas mostradas en la superficie de la levadura han mostrado buenas correlaciones con los datos obtenidos mediante métodos biofísicos y proteínas solubles 9,10,11,12. La visualización de la superficie de la levadura se ha empleado para la ingeniería de una variedad de proteínas, por ejemplo, fragmentos de anticuerpos 13,14,15,16, el 10º dominio de fibronectina tipo III17,18, rcSso7d19,20 o nudos21. Del mismo modo, se han llevado a cabo numerosas investigaciones para optimizar los diseños de las bibliotecas de levaduras mediante la alteración de las posiciones aleatorias, así como el uso de codones de aminoácidos 17,22,23. Se ha demostrado que la visualización de la superficie de la levadura es exitosa para la ingeniería de la estabilidad 14,15,24,25, la afinidad 18,26,27, la actividad enzimática 28,29,30,31 y la expresión de proteínas 32. Además, se lograron aplicaciones más sofisticadas, como la unión condicional en presencia o ausencia de una molécula pequeña, utilizando la visualización de la superficie de levadura20.
En este protocolo, describimos todos los pasos esenciales para una campaña de selección con visualización de la superficie de la levadura con el ejemplo de la biblioteca G4 (basada en el10º dominio de fibronectina tipo III, Fn3) seleccionada contra el antígeno proteína 4 de unión al retinol humano (hRBP4) en presencia de la pequeña molécula A112020. Esta selección se llevó a cabo para producir una interacción proteína-proteína que depende de una pequeña molécula que se puede utilizar como interruptor molecular. Cabe destacar que, si bien son posibles enfoques alternativos con la visualización de la superficie de la levadura, las selecciones típicas de levadura generalmente apuntan a unirse a un antígeno objetivo sin ninguna afinidad de unión previa. Cubrimos todos los pasos de una campaña de selección de levaduras, que implica el cultivo de una biblioteca de levaduras, la selección de perlas, la clasificación por citometría de flujo y la maduración por afinidad mediante PCR propensa a errores (epPCR). Por lo tanto, este protocolo complementa los protocolos anteriores de visualización de la superficie de la levadura33,34 y puede utilizarse como base para las selecciones de visualización de la superficie de la levadura (Figura 1) con cualquier biblioteca de levadura dada y antígeno objetivo de elección.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66994/66994fig1v5.jpg"> 
Figura 1: Principio de visualización de la superficie de la levadura y un flujo de trabajo típico para las selecciones de visualización de la superficie de la levadura. (A) El POI se clona en un vector de visualización de la superficie de levadura y, por lo general, está flanqueado por una etiqueta HA- N-terminal y una etiqueta c-myc C-terminal. La construcción se fusiona con la proteína de apareamiento de la levadura Aga2p para su visualización en la superficie. La proteína representada es el aglutinante diseñado "RS3" de PDB ID: 6QBA20. (B) Diagrama de flujo que ilustra un flujo de trabajo típico para campañas de selección de exhibición de superficie de levadura, que combinan el enriquecimiento de variantes de proteínas con las propiedades deseadas mediante selecciones de perlas y clasificación por citometría de flujo, así como epPCR para la maduración por afinidad. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66994/66994fig1largev5.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

<table><tbody><tr><td>10-beta electrocompetente E. coli&nbsp;</td><td>NEB</td><td>C3020K</td><td></td></tr><tr><td>Agar-Agar, Kobe</td><td>I Carl Roth</td><td>5210.5</td><td></td></tr><tr><td>Sal sódica ampicilina</td><td>Carl Roth</td><td>K029.2</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-c-myc, clon 9E10, AF488</td><td>Invitrogen</td><td>MA1-980-A488 (Thermo Fisher)</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-c-myc, clon 9E10, AF647</td><td>Invitrogen</td><td>MA1-980-A647 (Thermo Fisher)</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-HA, clon 16B12, AF488 BioLegend</td><td></td><td>901509 (Biozym)</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-HA, clon 16B12, AF647</td><td>BioLegend</td><td>682404 (Biozym)</td><td></td></tr><tr><td>BamHI-HF</td><td>NEB</td><td>R3136S</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina, fracción de etanol frío</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4503</td><td></td></tr><tr><td>Ácido cítrico monohidratado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1909</td><td></td></tr><tr><td>D-galactosa</td><td>Carl Roth</td><td>4987.2</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>Difco base de nitrógeno de levadura</td><td>Becton Dickinson (BD)&nbsp;</td><td>291940</td><td></td></tr><tr><td>Hidrogenofosfato disódico heptahidratado</td><td>Carl Roth</td><td>X987.3</td><td></td></tr><tr><td>DL-Ditiothreitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>D-Sorbitol</td><td>Carl Roth</td><td>6213.1</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' Solución salina tamponada con fosfato (10x)</td><td>Thermo Scientific</td><td>14190169</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Aglutinante de biotina</td><td>Invitrogen</td><td>11047 (Fisher Scientific)</td><td></td></tr><tr><td>DynaMag-2</td><td>Magnet Thermo Fisher</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>EBY100</td><td>ATCC</td><td>MYA-4941</td><td></td></tr><tr><td>Cubeta de electroporación 1 mm (para E.coli)</td><td>VWR</td><td>732-1135</td><td></td></tr><tr><td>Cubeta de electroporación 2 mm (para levadura)</td><td>VWR</td><td>732-1136</td><td></td></tr><tr><td>Absoluto de etanol</td><td>MERCK</td><td>1070172511</td><td></td></tr><tr><td>GeneMorph II Kit de mutagénesis aleatoria</td><td>Agilent Technologies</td><td>200550</td><td></td></tr><tr><td>Gibco Bacto Casamino Ácidos</td><td>Becton Dickinson (BD)</td><td>223120</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>AppliChem</td><td>131339.1211</td><td></td></tr><tr><td>LE agarose& nbsp;</td><td>Biozym</td><td>840004</td><td></td></tr><tr><td>Acetato de litio dihidratado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4158</td><td></td></tr><tr><td>Kit de extracción de gel de ADN Monarch</td><td>NEB</td><td>T1020S</td><td></td></tr><tr><td>Monarch PCR & Kit de limpieza de ADN</td><td>NEB</td><td>T1030S</td><td></td></tr><tr><td>Multifuge 1S-R</td><td>Heraeus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NheI-HF</td><td>NEB</td><td>R3131S</td><td></td></tr><tr><td>Medio de crecimiento</td><td>NEB</td><td>B9035S</td><td></td></tr><tr><td>pCTCON2</td><td>Addgene</td><td>#41843</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina G sal sódica</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3032</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo Penta-His, AF488</td><td>Qiagen</td><td>35310</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo Penta-His, AF647</td><td>Qiagen</td><td>35370</td><td></td></tr><tr><td>Peptona ex caseína digerida trípticamente</td><td>Carl Roth</td><td>8986.3</td><td></td></tr><tr><td>Q5 ADN polimerasa de alta fidelidad&nbsp;</td><td>NEB</td><td>M0491S</td><td></td></tr><tr><td>SaII-HF</td><td>NEB</td><td>R3138S</td><td></td></tr><tr><td>Acetato de sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8750-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de sodio</td><td>Carl Roth</td><td>3957.2</td><td></td></tr><tr><td>Dihidrógeno fosfato de sodio monohidratado</td><td>Carl Roth</td><td>K300.2</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de tapa de botella roscado Steritop</td><td>MERCK</td><td>S2GPT01RE</td><td></td></tr><tr><td>Estreptavidina, AF488</td><td>Invitrogen</td><td>S32354 (Thermo Fisher)</td><td></td></tr><tr><td>Estreptavidina, AF647</td><td>Invitrogen</td><td>S32357 (Thermo Fisher)</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de estreptomicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6501</td><td></td></tr><tr><td>Citrato trisódico dihidratado</td><td>Carl Roth</td><td>4088.1</td><td></td></tr><tr><td>Espectrofotómetro UV-Vis</td><td>Agilent</td><td>8453</td><td></td></tr><tr><td>Extracto de levadura, microgranulado</td><td>Carl Roth</td><td>2904.4</td><td></td></tr><tr><td>Zymoprep Levadura Plásmido Miniprep II</td><td>Zymo Research</td><td>D2004&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

ingeniería de proteínas por visualización de superficie de levadura

Protein Engineering by Yeast Surface Display

La biblioteca G4 se seleccionó frente al antígeno hRBP4 unido al fármaco de molécula pequeña A1120. La tinción de las bibliotecas para la clasificación por citometría de flujo se realizó como se describe en el Método 6, y la estrategia de compuerta aplicada se muestra en la Figura 2A. Una puerta inicial incluyó todas las células en función de la morfología de la célula, y la segunda puerta (histograma de FSC-Width) mostró una estrategia de compuerta estricta que se aplicó para seleccionar células individuales y eliminar los agregados de células. La tercera y última puerta mostró la visualización de variantes proteicas (eje x) frente a la unión de antígenos (eje y). Se clasificaron las células de levadura que mostraban señales de visualización y unión. Es importante destacar que la puerta de clasificación se configuró de manera estricta para enriquecer los dominios de enlace con alta señal de enlace y, por lo tanto, alta afinidad. Esta selección rigurosa produjo un enriquecimiento de las células de levadura que se unen específicamente al antígeno objetivo a lo largo de la campaña de selección (Figura 2B). En rondas de clasificación por citometría de flujo posteriores, la concentración de antígeno disminuyó 10 veces (de 100 nM a 10 nM). Por lo tanto, la señal de unión general se redujo, y solo los aglutinantes con una alta afinidad seguían siendo detectables y clasificados (Figura 2C).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66994/66994fig2v5.jpg"> 
Figura 2: Resultados representativos de una selección de visualización de la superficie de levadura de la biblioteca G4 basada en Fn3 para unirse al antígeno (hRBP4 en presencia de A1120). (A) La estrategia general de compuerta para la clasificación de bibliotecas de levadura. La primera puerta (FSC vs. SSC) es seleccionar todas las células de levadura y excluir los eventos de dispersión; la segunda puerta (histograma de FSC-W) tiene como objetivo eliminar los agregados celulares y seleccionar solo células de levadura individuales. La tercera puerta traza el nivel de visualización de la superficie (detección de la etiqueta HA- o c-myc) frente a la unión al antígeno (aquí hRBP4 en presencia de 5 μM A1120, detectado por el anticuerpo anti-His). Además, la biblioteca se tiñó solo con anticuerpos secundarios (sin antígeno), donde no se espera unión al antígeno. Las celdas ordenadas se resaltan en azul. (B) Evolución de la biblioteca G4 a lo largo de 3 rondas de clasificación por citometría de flujo. Se puede observar un enriquecimiento de la población vinculante con cada ronda de selección. (C) El uso de concentraciones de antígeno más bajas permite la selección de variantes de proteínas con una mayor afinidad hacia el antígeno objetivo. Al reducir la concentración de antígeno (en este caso hRBP4) 10 veces, aparecen diferentes diagonales, lo que indica la presencia de clones con mayor afinidad (células ordenadas, azul) o menor. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66994/66994fig2largev5.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Ingeniería de proteínas por visualización de superficie de levadura

Protein engineering enables the improvement of existing functions of a given protein or the generation of novel functions. One of the most widely used and ...

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