Name: Un modelo modificado de preparación para la reperfusión de oclusión de la arteria cerebral media (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-05-31T15:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 18 s
Description: Aprenda a preparar la oclusión y reperfusión de la arteria cerebral media mediante la arteria carótida común en ratas. Este protocolo simplificado facilita el estudio de la isquemia cerebral y el descubrimiento de fármacos neuroprotectores.

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Este trabajo contó con el apoyo de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (82173781 y 82373835), el proyecto de investigación postdoctoral (BKS212055), el Proyecto de Innovación Científica y Tecnológica de la Oficina de Ciencia y Tecnología de Foshan (2320001007331), la Fundación de Investigación Básica y Básica Aplicada de Guangdong (2019A1515010806), los Proyectos de Campo Clave (Fabricación Inteligente) de las Universidades Generales de la Provincia de Guangdong (2020ZDZX2057) y los Proyectos de Investigación Científica (Innovación Característica) de General Universidades en la provincia de Guangdong (2019KTSCX195).

El protocolo experimental se llevó a cabo de acuerdo con las directrices del Comité de Uso de Animales de Laboratorio y del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Medicina Tradicional China de Chengdu (Número de registro: 2019-DL-002). Todos los datos de investigación con animales se han documentado siguiendo las directrices ARRIVE (Animal Research: Reporting In Vivo Experiments). Para este estudio se utilizaron ratas macho Sprague Dawley (SD) con un peso de 250 g ± 20 g y con edades comprendidas entre 6 y 8 semanas. Los detalles sobre los animales, los reactivos y el equipo empleado se enumeran en la Tabla de Materiales.
1. Preparación animal
<ol><li>Inducir y mantener la anestesia profunda en ratas utilizando Zoletil 50 (50 mg/kg, IM) y clorhidrato de xilacina (40 mg/kg, IP). Asegúrese de que la temperatura corporal se mantenga entre 37 ± 0,5 °C utilizando una sonda rectal conectada a una almohadilla térmica durante todo el procedimiento quirúrgico. Aplica ungüento veterinario en los ojos de la rata para evitar que se sequen.</li>
	<li>Afeita el pelo de la cabeza y el cuello de las ratas. Use crema depilatoria para eliminar el pelo de la cabeza y el cuello, luego lave la crema con solución salina normal. Desinfecte la piel en el sitio quirúrgico aplicando etanol y povidona yodada tres veces con bolas de algodón estériles.</li>
	<li>Haz una incisión de 2 cm en el centro de la cabeza de la rata a lo largo de la dirección de la sutura sagital con un bisturí y retira con cuidado los músculos que cubren el cráneo.</li>
	<li>Adelgace el cráneo del lado isquémico de la rata con un taladro de cráneo. Use solución salina normal para enfriar y eliminar los desechos durante el proceso de molienda. Registre el flujo sanguíneo basal de las ratas mediante imágenes de contraste de moteado láser (LSCI).</li>
	<li>Aplique etanol y povidona yodada tres veces sobre la piel del cuello con bolas de algodón estériles. Haga una incisión de 2 cm a lo largo de la línea media del cuello con una cuchilla quirúrgica. Use retractores para retraer lateralmente la piel y las glándulas salivales, exponiendo los músculos esternocleidomastoideos y cervicales.</li>
	<li>Separe los músculos esternocleidomastoideo y cervical para exponer el territorio carotídeo. Identificar la anatomía vascular de la arteria carótida común (ACC), la arteria carótida interna (ACI) y la arteria carótida externa (ECA). Con base en la anatomía vascular, separar el CCA, así como el ECA derivado del CCA y el ICA15. NOTA: La estructura anatómica de la rata indica que la región del CCA está cubierta principalmente por músculos esternocleidomastoideos y cervicales, con el ICA y el ECA derivados del CCA. Después de que la separación expone el CCA, se puede ver una bifurcación en forma de Y a lo largo del CCA, que representa el ICA y el ECA. Tenga cuidado de no dañar el nervio vago, que corre paralelo al CCA.</li>
</ol>2. Oclusión del MCA
<ol><li>Haz un nudo fácil de desenredar sobre la arteria carótida externa (ECA) y la arteria carótida común (CCA) usando un hilo de seda 3-0 para bloquear temporalmente el flujo sanguíneo. Coloque un clip de recipiente en el CCA aproximadamente a 0,5 cm del primer nudo.<ol><li>Tiñe la aguja de una jeringa de 5 ml de negro. Crea una pequeña punción en el CCA con la aguja teñida de negro y marca los agujeros de alfiler en negro.</li>
	</ol></li>
	<li>Inserte la sutura de nailon monofilamento en el CCA a través de la marca negra. Abra el clip vascular y guíe el alambre de nailon hacia la arteria carótida interna (ICA) hasta que se detenga con una ligera resistencia. Apriete firmemente el segundo nudo para mantener la sutura de nailon monofilamento en su lugar dentro de la arteria, evitando el desplazamiento de la posición de bloqueo.</li>
	<li>Anote el tiempo de isquemia en este punto y mida el valor del flujo sanguíneo en el lado isquémico usando LSCI. Administrar gotas de bupivacaína en la herida del cuello para analgesia y cierre de la herida. Retire la máscara de anestesia y permita que la rata se recupere. NOTA: Si la sutura de nailon monofilamento tiene dificultades para entrar en el ICA, retírela ligeramente e intente la inserción de nuevo.</li>
</ol>3. Reperfusión de MCAO
<ol><li>Después de 90 min de isquemia, reanestesiar a las ratas con isoflurano. Mida el flujo sanguíneo cerebral desde el lado isquémico utilizando LSCI y asegúrese de que la sutura de nailon monofilamento no se haya desplazado.</li>
	<li>Desata los nudos de la arteria carótida externa (ECA) para permitir la reperfusión sanguínea. Suelte el nudo en la arteria carótida común (CCA), asegure la sutura del monofilamento y retire la sutura. Aplique una pinza vascular antes de la sutura fija de monofilamento para evitar el sangrado.</li>
	<li>Reemplace el primer nudo CCA con un clip vascular. Use pinzas para rotar la incisión del vaso hacia los lados (Figura 1). Pinza la incisión con pinzas y lítala con hilo 6-0 para reparar la incisión. Retire el clip vascular, verifique si hay fugas y confirme la reperfusión completa (Video 1). NOTA: Realice la ligadura para reparar la incisión y evitar un pinzamiento excesivo de los vasos, lo que podría provocar estenosis de la CCA.</li>
	<li>Registre los valores de flujo sanguíneo cortical cerebral utilizando LSCI después de la ligadura de incisión para confirmar la reperfusión exitosa. Cerrar la incisión del cuello con suturas y administrar 1.00.000 unidades de penicilina y 2 mL de suero fisiológico para prevenir la infección y la deshidratación.</li>
	<li>Mantenga el calor hasta que las ratas recuperen la conciencia. Ofrecer alimentos blandos después de la cirugía y controlar los signos vitales de los animales.</li>
</ol>4. Evaluación de la función nerviosa y de la lesión isquémica cerebral
<ol><li>Una vez que las ratas se hayan despertado por completo, su función neuronal será evaluada por investigadores que desconocen el agrupamiento de animales. Utilice la escala de puntuación de Longa (Tabla 1) y la escala de puntuación de gravedad neurológica modificada (mNSS) (Tabla 2) para evaluar la función neurológica de todas las ratas.</li>
	<li>Después de 24 h después de la cirugía, sacrificar a las ratas bajo anestesia inducida por isoflurano (4% de isoflurano a 4 L/min de oxígeno) a través de la luxación cervical16 (siguiendo los protocolos aprobados institucionalmente). Enjuague el cerebro con agua helada para eliminar cualquier resto de sangre.</li>
	<li>Divida el tejido cerebral en 5 secciones y tíñalas con TTC. Capture imágenes de ambos lados de los cortes de tejido cerebral, mida el área isquémica de los lados frontal y posterior utilizando el software Image J y calcule la tasa de infarto utilizando la siguiente fórmula: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/67060/67060eq01.jpg" style="margin: auto;"> NOTA: S1 y S2 representan el área del infarto del prosencéfalo proximal y los lados del tronco encefálico proximal de los cortes de cerebro, respectivamente. El área del infarto de cada corte de cerebro se corrige utilizando la fórmula de Swanson, donde h representa el grosor del corte de cerebro. Esta fórmula, previamente esbozada por el autor en una investigación previa17, permite un cálculo más preciso del tamaño de la lesión del infarto.</li>
	<li>Analice los datos utilizando software estadístico y gráfico para evaluar la tasa de éxito y la estabilidad del modelo.</li>
	<li>Emplear el método de inmunofluorescencia para marcar las neuronas corticales en ratas, validando aún más el daño neuronal causado por este método. Después de 24 h de isquemia-reperfusión en ratas, se realizó perfusión cardíaca utilizando PBS preenfriado para obtener tejido cerebral.</li>
	<li>Incrusta y congela el tejido cerebral en secciones. Utilice anticuerpos neuronales como el marcador neuronal inmaduro Doublecortin (DCX)18, el marcador del núcleo neuronal Neuronal Nuclei (NeuN)18 y el marcador dendrítico neuronal Proteína-2 asociada a microtúbulos (MAP-2)19. Observar la expresión de las neuronas isquémicas mediante microscopía confocal láser.</li>
</ol>

Modelo MCAO/R modificado con ECA preservado para mejorar la reperfusión y la estabilidad

<ol><li>Paul, S., Candelario-Jalil, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+neuroprotective+strategies+for+the+treatment+of+ischemic+stroke%3A+An+overview+of+clinical+and+preclinical+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Emerging neuroprotective strategies for the treatment of ischemic stroke: An overview of clinical and preclinical studies.</a> Exp Neurol. 335, 113518(2021).</li>
<li>Feigin, V. L., Owolabi, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pragmatic+solutions+to+reduce+the+global+burden+of+stroke%3A+a+World+Stroke+Organization-Lancet+Neurology+Commission%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Neurol%22%5BJournal%5D)">Pragmatic solutions to reduce the global burden of stroke: a World Stroke Organization-Lancet Neurology Commission.</a> Lancet Neurol. 22 (12), 1160-1206 (2023).</li>
<li>Putaala, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ischemic+Stroke+in+Young+Adults%5BTitle%5D)+AND+%22Continuum+%28Minneapolis%2C+Minn%29%22%5BJournal%5D)">Ischemic Stroke in Young Adults.</a> Continuum (Minneapolis, Minn). 26 (2), 386-414 (2020).</li>
<li>Girotra, T., Lekoubou, A., Bishu, K. G., Ovbiagele, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+contemporary+and+comprehensive+analysis+of+the+costs+of+stroke+in+the+United+States%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurol+Sci%22%5BJournal%5D)">A contemporary and comprehensive analysis of the costs of stroke in the United States.</a> J Neurol Sci. 410, 116643(2020).</li>
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<li>O'Collins, V. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((1%2C026+experimental+treatments+in+acute+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Neurol%22%5BJournal%5D)">1,026 experimental treatments in acute stroke.</a> Ann Neurol. 59 (3), 467-477 (2006).</li>
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<li>Justić, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redefining+the+Koizumi+model+of+mouse+cerebral+ischemia%3A+A+comparative+longitudinal+study+of+cerebral+and+retinal+ischemia+in+the+Koizumi+and+Longa+middle+cerebral+artery+occlusion+models%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Redefining the Koizumi model of mouse cerebral ischemia: A comparative longitudinal study of cerebral and retinal ischemia in the Koizumi and Longa middle cerebral artery occlusion models.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 42 (11), 2080-2094 (2022).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+cerebral+microcirculation+perfusion+in+rat+models+of+middle+cerebral+artery+occlusion+prepared+through+common+carotid+artery+insertion+and+external+carotid+artery+insertion%5BTitle%5D)+AND+%22CJTER%22%5BJournal%5D)">Comparison of cerebral microcirculation perfusion in rat models of middle cerebral artery occlusion prepared through common carotid artery insertion and external carotid artery insertion.</a> CJTER. 27 (11), 1683-1691 (2023).</li>
<li>Dittmar, M., Spruss, T., Schuierer, G., Horn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((External+carotid+artery+territory+ischemia+impairs+outcome+in+the+endovascular+filament+model+of+middle+cerebral+artery+occlusion+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">External carotid artery territory ischemia impairs outcome in the endovascular filament model of middle cerebral artery occlusion in rats.</a> Stroke. 34 (9), 2252-2257 (2003).</li>
<li>Trueman, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critical+re-examination+of+the+intraluminal+filament+MCAO+model%3A+impact+of+external+carotid+artery+transection%5BTitle%5D)+AND+%22Transl+Stroke+Res%22%5BJournal%5D)">A critical re-examination of the intraluminal filament MCAO model: impact of external carotid artery transection.</a> Transl Stroke Res. 2 (4), 651-661 (2011).</li>
<li>Ziegler, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+sympathetic+denervation+attenuates+myocardial+inflammation+and+improves+cardiac+function+after+myocardial+infarction+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Res%22%5BJournal%5D)">Local sympathetic denervation attenuates myocardial inflammation and improves cardiac function after myocardial infarction in mice.</a> Cardiovasc Res. 114 (2), 291-299 (2018).</li>
<li>Pitoulis, F. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remodelling+of+adult+cardiac+tissue+subjected+to+physiological+and+pathological+mechanical+load+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Res%22%5BJournal%5D)">Remodelling of adult cardiac tissue subjected to physiological and pathological mechanical load in vitro.</a> Cardiovasc Res. 118 (3), 814-827 (2022).</li>
<li>Ma, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+cerebral+ischemia%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Pharmacother%22%5BJournal%5D)">Animal models of cerebral ischemia: A review.</a> Biomed Pharmacother. 131, 110686(2020).</li>
<li>Belayev, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Docosanoids+promote+neurogenesis+and+angiogenesis%2C+blood-brain+barrier+integrity%2C+penumbra+protection%2C+and+neurobehavioral+recovery+after+experimental+ischemic+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Docosanoids promote neurogenesis and angiogenesis, blood-brain barrier integrity, penumbra protection, and neurobehavioral recovery after experimental ischemic stroke.</a> Mol Neurobiol. 55 (8), 7090-7106 (2018).</li>
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<li>Henninger, N., Fisher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extending+the+time+window+for+endovascular+and+pharmacological+reperfusion%5BTitle%5D)+AND+%22Transl+Stroke+Res%22%5BJournal%5D)">Extending the time window for endovascular and pharmacological reperfusion.</a> Transl Stroke Res. 7 (4), 284-293 (2016).</li>
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</ol>

El modelo de oclusión de la arteria cerebral media (MCAO) inducida por una sutura de nailon monofilamento es el método más común utilizado para preparar modelos de MCAO. Este enfoque es ampliamente adoptado en estudios preclínicos y ha ganado el reconocimiento de muchos profesionales debido a su simplicidad, falta de necesidad de craneotomía, trauma quirúrgico mínimo y capacidad para lograr la reperfusión.
Existen dos técnicas quirúrgicas clásicas para el filamento intraluminal MCAO: el método de Koizumi8 y el método de Longa9. La principal diferencia entre estos métodos radica en cómo se introduce la sutura para ocluir el ACM. En el método Koizumi, la sutura se inserta a través de la incisión de la arteria carótida común (CCA) en la arteria carótida interna (ACI). El extremo frontal de la sutura está recubierto con silicona para bloquear el punto de inicio del MCA. Por el contrario, en el método Longa, la sutura se inserta en la ACI a través de la arteria carótida externa (ECA) cortada. El extremo frontal de la sutura se expande en forma esférica para bloquear el punto de inicio del MCA (Figura 5). Durante la reperfusión, la sutura se retira suavemente para restaurar el flujo sanguíneo.
El método Longa consiste en introducir la sutura en la arteria carótida interna (ACI) a través de la arteria carótida externa (ECA) cortada. Este proceso requiere la separación y desconexión del ECA, así como la separación y extracción de pequeñas ramas, que luego se cortan con una pluma de electrocoagulación para evitar el sangrado. En consecuencia, este método exige un funcionamiento cuidadoso y preciso. Además, el corto extremo residual del ECA cortado puede facilitar que la sutura se deslice durante la inserción, lo que aumenta aún más la complejidad del procedimiento. Este desafío es particularmente pronunciado cuando se prepara un modelo de isquemia cerebral en ratones, ya que a menudo requiere el uso de un microscopio para garantizar la precisión, lo que aumenta la complejidad general de la operación.
La principal preocupación con el método de Koizumi radica en la ligadura de la arteria carótida común (CCA), que resulta en la reperfusión compensatoria del tejido cerebral en el lado isquémico únicamente a través del Círculo de Willis. El CCA es una rama crucial del arco aórtico desde el corazón y sirve como la arteria principal que suministra la perfusión del flujo sanguíneo cerebral. Por lo tanto, el modelo de isquemia-reperfusión cerebral creado por el método de Koizumi a menudo experimenta un estado de hipoperfusión. Esta hipoperfusión no se limita a la región de la arteria cerebral media, sino que se extiende a todo el hemisferio isquémico del mismo lado. Incluso después de 35 días de modelado, el valor del flujo sanguíneo no vuelve a la línea de base, lo que sugiere que el método de Koizumi debe considerarse como un modelo isquémico con hipoperfusión crónica en lugar de un modelo de isquemia-reperfusión10.
Por el contrario, el método Longa puede alcanzar un valor de flujo sanguíneo del 100% en animales MCAO/R. Sin embargo, es crucial tener en cuenta que lograr una recanalización completa no significa necesariamente que se deba abandonar el método Koizumi. Al considerar la traslación clínica, el método de Koizumi puede ser más adecuado para pacientes con recanalización lenta espontánea después de la oclusión de arterias. Sin embargo, este fenómeno es relativamente raro en la práctica clínica. Solo un pequeño porcentaje de pacientes con accidente cerebrovascular isquémico cumple con los criterios de trombólisis y reciben un tratamiento efectivo dentro de la ventana de tiempo de tratamiento20,21. Además, algunos pacientes no logran una revascularización completa incluso después de la terapia trombolítica22. Por lo tanto, el método Koizumi se puede utilizar para simular las condiciones de dichos pacientes.
Por otro lado, el método de Longa permite que los vasos se recanalicen rápidamente después de la oclusión, por lo que es más adecuado para simular pacientes que reciben una terapia trombolítica o trombectomía efectiva en la práctica clínica. Para simular pacientes que no han sido sometidos a tratamiento trombolítico, el modelo de isquemia cerebral permanente preparado por el método de Koizumi puede ofrecer una oclusión más completa y un procedimiento quirúrgico más sencillo.
El método de Longa para inducir la oclusión/reperfusión de la arteria cerebral media (MCAO/R) puede conducir a una lesión de reperfusión más significativa al preservar la recanalización vascular derivada de la arteria carótida común (CCA)23,24. Sin embargo, es importante tener en cuenta que la arteria carótida externa (ECA) debe cortarse y ligarse permanentemente durante el método Longa, lo que interrumpe la estructura completa del flujo sanguíneo del cerebro y no es consistente con los pacientes clínicos. Además, las arterias lingual, maxilar y occipital son ramas del ECA13. Por lo tanto, el corte o ligado permanente del ECA puede causar trastornos de la alimentación y la bebida, lo que resulta en la pérdida de peso25. Estudios previos han indicado que las muertes de ratones siguiendo el modelo de MCAO se deben principalmente a una ingesta inadecuada de alimentos o agua más que a una lesión isquémica cerebral14,26. Además, la ligadura del ECA puede reducir el flujo sanguíneo de la retina e inducir daño en la retina en forma de muerte celular27.
Además, el indicador más importante para la investigación del ictus es el volumen del infarto; Sin embargo, se ha demostrado que el volumen de infartos inducidos por el método de sutura tiene una desviación estándar significativa, incluso siguiendo estrictos protocolos quirúrgicos y de recopilación de datos. En reportes previos, el volumen del infarto se asoció con el grado de reperfusión28, y la reperfusión del modelo de accidente cerebrovascular preparado por el método de Koizumi depende de la circulación de Willis 29,30,31. Sin embargo, se ha demostrado que el ciclo de Willis tiene una alta variabilidad anatómica, especialmente en ratones C57Bl/6, donde el 90% de los animales pueden carecer de una o dos arterias comunicantes posteriores32, que es el determinante clave de la alta variabilidad en la lesión isquémica33. Por lo tanto, preservar la perfusión de CCA puede reducir la variabilidad del volumen del infarto34. Se informó que el coeficiente promedio de variación en el tamaño del infarto en los ensayos de accidente cerebrovascular fue del 29,5%31, lo que contribuyó al bajo poder estadístico de los ensayos de accidente cerebrovascular. También plantea un gran desafío para el descubrimiento potencial de fármacos. Esto, sin duda, aumenta el coste del desarrollo y la traslación clínica y puede llevar a los investigadores a perder fármacos potencialmente eficaces. También aumenta el número de animales que se incluirán en el análisis estadístico del experimento, lo que viola aún más el principio de las 3R de la ética animal.
Por lo tanto, en este estudio, se modificaron los métodos de modelado para garantizar la integridad de la estructura del flujo sanguíneo del tejido cerebral y una reperfusión suficiente después de la isquemia cerebral. Las principales modificaciones incluyen dos pasos: (1) insertar la sutura en el CCA utilizando una aguja de jeringa de 5 ml en lugar de hacer una pequeña incisión; este paso reduce la incisión de la CCA y es más propicio para ligar la incisión; (2) retirar la sutura y utilizar hilos de seda más finos para ligar la abertura de la aguja del CCA, sin afectar la perfusión del flujo sanguíneo del CCA. Por supuesto, esto también requiere una operación quirúrgica cuidadosa, pero es diferente de la introducción de la sutura a través de ECA; este método preserva la integridad de la estructura del flujo sanguíneo cerebral al tiempo que permite que el flujo sanguíneo se reperfunda completamente a través de CCA, lo que simplifica el procedimiento quirúrgico y reduce la variabilidad del volumen del infarto. Algunos investigadores han utilizado métodos de investigación similares para reparar incisiones con pegamento tisular, pero esto tiene el potencial de trombosis, que traerá efectos incontrolables. Y se tarda más en estabilizar la incisión25.
En conclusión, este estudio proporciona un enfoque modificado para la preparación del modelo de isquemia-reperfusión cerebral que permite una perfusión sanguínea adecuada después de la retirada del filamento y puede resultar en volúmenes de infarto significativamente reproducibles y daño neurológico. Todos los resultados anteriores demuestran que el método modificado es factible y reproducible y puede proporcionar una referencia para que los profesionales preparen modelos que faciliten la traducción clínica efectiva de los fármacos isquémicos cerebrales.

Según la Organización Mundial de la Salud, el ictus se ha mantenido como la segunda causa de muerte en todo el mundo durante la última década, con una alta tasa de incidencia, alta mortalidad y alta tasa de discapacidad 1,2. A medida que la población mundial envejece, se espera que la incidencia de accidentes cerebrovasculares aumente en los países en desarrollo, lo que podría convertirse en la principal causa de muerte prematura y discapacidad en adultos. Además, existe una tendencia a que los accidentes cerebrovasculares ocurran a una edad más temprana de3 años. La pérdida de la fuerza de trabajo después de un accidente cerebrovascular también supone una pesada carga para las familias y la sociedad4. Por lo tanto, el desarrollo de tratamientos seguros y eficaces plantea un gran reto en la investigación del ictus.
Los modelos animales sirven como herramientas cruciales para estudiar la prevención y el tratamiento de las enfermedades humanas. El éxito de la traslación de las estrategias de tratamiento del ictus se basa en la reproducibilidad y fiabilidad de los modelos animales de ictus 5,6. La arteria cerebral media (ACM) es un sitio común para el accidente cerebrovascular clínico, lo que convierte al modelo MCAO en el modelo más cercano al accidente cerebrovascular isquémico humano. El modelo MCAO, elaborado mediante el método de sutura, ha sido favorecido por los investigadores debido a ventajas como la ausencia de craneotomía y el fácil control del tiempo de isquemia. Se ha utilizado en más del 40% de los experimentos neuroprotectores7. Sin embargo, a pesar de sus numerosas ventajas, los detalles operativos de este modelo siguen siendo un tema controvertido para muchos investigadores.
Para el modelo de oclusión de la arteria cerebral media inducida por sutura (MCAO), la reperfusión se produce mediante la retirada de la sutura. Actualmente, se utilizan dos métodos principales para la inserción de suturas: el método8 de Koizumi y el método9 de Longa. En el método de Koizumi, la sutura entra en la arteria carótida interna (ACI) principalmente a través de la incisión de la arteria carótida común (ACC), mientras que en el método de Longa, pasa a través de la arteria carótida externa (ECA) cortada a la ACI. Durante la reperfusión, el método de Koizumi requiere un ligado permanente de la incisión de la CCA y se basa en el círculo de Willis para la reperfusión10. Sin embargo, algunos estudios sugieren que la reperfusión efectiva no se puede lograr únicamente a través del suministro compensatorio del círculo de Willis después de perder el suministro de CCA. Además, el círculo de Willis exhibe una alta variabilidad anatómica, especialmente en ratones C57Bl/6, lo que aumenta la variabilidad del infarto y reduce la fiabilidad de los datos experimentales. En consecuencia, este método ha sido cada vez más cuestionado por los investigadores11.
El método de Longa consiste en insertar una sutura a través de la ECA cortada y luego ligar permanentemente la arteria carótida interna (ICA) una vez que se retira la sutura. Esto preserva la permeabilidad del CCA, lo que permite una perfusión sanguínea de hasta el 100% de los valores basales. Sin embargo, este método requiere separar la arteria carótida externa y las pequeñas ramas arteriales, cortarlas o electrocoagularlas, lo que dificulta el procedimiento. También altera la estructura completa del flujo sanguíneo del cerebro, que difiere del estado del paciente clínico12. Es importante destacar que los estudios indican que el corte o ligado del ECA puede causar lesiones isquémicas en los músculos que controlan la masticación y la deglución, afectando la dieta de los animales y provocando la muerte postoperatoria de los animales y graves daños sensoriales y motores en ratas13,14.
Por lo tanto, se necesita urgentemente un método modificado de preparación de modelos para abordar estos problemas. Este estudio presenta un método de modelado MCAO modificado que repara la incisión de inserción de CCA y logra una reperfusión efectiva. El procedimiento es simple, práctico y factible, e induce un daño neurológico significativo y lesiones de infarto replicables y proporciona una valiosa orientación para los investigadores de accidentes cerebrovasculares.

<table><tbody><tr><td>Sistema de anestesia animal</td><td>Rayward Life Technology Co., Ltd</td><td>R500IE</td><td></td></tr><tr><td>Mantenedor de temperatura animal</td><td>Rayward Life Technology Co., Ltd</td><td>69020</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo secundario Cy3</td><td>Wuhan Saiweier Biotechnology Co., Ltd</td><td>GB21303</td><td></td></tr><tr><td>anticuerpo DAP1</td><td>Wuhan Saiweier Biotechnology Co., Ltd</td><td>G1012</td><td></td></tr><tr><td>DCX anticuerpo</td><td>Wuhan Saiweier Biotechnology Co., Ltd</td><td>GB13434</td><td></td></tr><tr><td>Suero de cabra</td><td>Beyotime Biotechnology Co., Ltd</td><td>C0265</td><td></td></tr><tr><td>Prisma GraphPad</td><td>Software</td><td>GraphPad Prisma 8.0</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ Institutos</td><td>Nacionales de Salud</td><td>Software ImageJ</td><td></td></tr><tr><td>Isofluran</td><td>Rayward Life Technology Co., Ltd</td><td>R510-22</td><td></td></tr><tr><td>Sangre moteada por láser sistema de imagen de flujo</td><td>Rayward Life Technology Co., Ltd</td><td>PeriCam PSI NR</td><td></td></tr><tr><td>MAP-2 anticuerpo</td><td>Wuhan Saiweier Biotechnology Co., Ltd</td><td>GB11128</td><td></td></tr><tr><td>Taladro de cráneo de mano en miniatura</td><td>Rayward Life Technology Co., Ltd</td><td>87001</td><td></td></tr><tr><td>sutura de monofilamento</td><td>Rayward Life Technology Co., Ltd</td><td>250-280g</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo NeuN</td><td>Wuhan Saiweier Biotechnology Co., Ltd</td><td>GB11138</td><td></td></tr><tr><td>Agente de inclusión OCT</td><td>BIOSHARP</td><td>BL557A</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina sódica</td><td>Chengdu Kelong Chemical Co., Ltd.</td><td>17121709-2</td><td></td></tr><tr><td>Solución rápida de recuperación de antígenos para secciones congeladas</td><td>Beyotime Biotechnology Co., Ltd</td><td>P0090</td><td></td></tr><tr><td>SD ratas</td><td>SPF ( Beijing ) Biotechnology Co., Ltd.</td><td>250-280g</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Beyotime Biotechnology Co., LTD</td><td>ST795</td><td></td></tr><tr><td>TTC</td><td>Chengdu Kelong Chemical Co., Ltd.</td><td></td><td></td>2019030101</tr></tbody></table>

un modelo modificado de preparación para la reperfusión de oclusión de la arteria cerebral media

A Modified Model Preparation for Middle Cerebral Artery Occlusion Reperfusion

El modelo de reperfusión de oclusión de la arteria cerebral media (MCAO/R) es crucial para comprender los mecanismos patológicos del accidente cerebrovascular y para el desarrollo de fármacos. Sin embargo, entre los métodos de modelado comúnmente utilizados, el método de Koizumi a menudo se enfrenta a un escrutinio debido a su ligadura de la arteria carótida común (CCA) y su incapacidad para lograr una reperfusión adecuada. Del mismo modo, el método Longa ha sido criticado por desconectar y ligar la arteria carótida externa (ECA). Este estudio tiene como objetivo introducir un método de preparación de modelos modificado que preserve la integridad del ACE, implica la inserción de una sutura de nailon monofilamento a través del CCA, la reparación de la incisión del CCA ligada y el mantenimiento de la reperfusión del CCA. La reperfusión del flujo sanguíneo se confirmó mediante imágenes de flujo de moteado láser. Los métodos de evaluación, como la escala de Longa, la puntuación de gravedad neurológica modificada, la tinción con cloruro de trifeniltetrazolio (TTC) y el marcaje con inmunofluorescencia de las neuronas, demostraron que este enfoque podría inducir daño estable del nervio isquémico. Este protocolo modelo MCAO/R modificado es simple y estable, y proporciona una valiosa orientación para los profesionales en el campo de la isquemia cerebral.

Las imágenes de flujo de moteado láser demostraron que antes de la oclusión de la sutura de nailon monofilamento, había abundante flujo sanguíneo en el área de la arteria cerebral media (MCA), y se registraron los valores basales de flujo sanguíneo de las ratas. Después de la oclusión del MCA, el valor del flujo sanguíneo en el lado isquémico del cerebro disminuyó rápidamente. Antes de retirar la sutura, se volvieron a comprobar los valores de flujo sanguíneo en el lado isquémico para confirmar si la sutura estaba ocluyendo el ACM. Los resultados indicaron solo un ligero cambio en el flujo sanguíneo. Al retirar la sutura, la perfusión del flujo sanguíneo se recuperó rápidamente (Figura 2). El video 1 también muestra el robusto pulso de llenado de la arteria carótida común, lo que sugiere que este método puede lograr una perfusión de flujo sanguíneo suficiente después de la isquemia cerebral.
Los resultados de las puntuaciones de la función neurológica (Figura 3) revelaron que, en comparación con el grupo de cirugía simulada, la puntuación de Longa del grupo modelo fue de 1,80 ± 0,27 (p &lt; 0,05) y la puntuación de mNSS fue de 7,4 ± 0,89 (p &lt; 0,05). Estas puntuaciones indican que el modelo de oclusión/reperfusión de la arteria cerebral media (MCAO/R) preparado con este método condujo a un daño neurológico significativo. El video 2 muestra el comportamiento característico de las ratas del grupo modelo que giran mientras se arrastran, un sello distintivo de las lesiones inducidas por accidentes cerebrovasculares, lo que confirma aún más la validez de este método.
La tinción con TTC demostró que la tasa de infarto en las ratas del grupo modelo fue de 5,58 ± 1,79 (p &lt; 0,05), con el área del infarto afectando principalmente el cuerpo estriado y la corteza, y el tamaño del infarto se mantuvo relativamente estable. La tinción con inmunofluorescencia ilustró la pérdida de neuronas corticales después de la isquemia-reperfusión (Figura 4). Estos hallazgos indican colectivamente que este método puede establecer un modelo MCAO/R estable adecuado para evaluar la eficacia preclínica de los fármacos.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67060/67060fig01v5.jpg"> Figura 1: Diagrama esquemático de la ligadura del conector de CCA. El círculo amarillo indica el punto de inserción y el sitio de ligadura del tapón del alambre, mientras que la posición de ligadura (flecha amarilla) indica dónde se ligó la arteria carótida común (CCA) con el alambre. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67060/67060fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67060/67060fig02v5.jpg"> Figura 2: Imágenes de flujo sanguíneo con manchas láser en ratas en el lado isquémico antes, después de la oclusión y antes y después de la reperfusión. (A) Imágenes de flujo sanguíneo cerebral de ratas, donde las áreas azules indican valores bajos de flujo sanguíneo y las áreas rojas indican valores altos de flujo sanguíneo. Barra de escala: 200 mm. (B) Cambios en la isquemia-reperfusión cerebral en ratas, presentados como media ± desviación estándar, con un tamaño de muestra de n = 5. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67060/67060fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67060/67060fig03v5.jpg"> Figura 3: Resultados de las puntuaciones de área de infarto y función neurológica en el grupo simulado y el grupo modelo. (A) La tinción con TTC representó las áreas infartadas de tejido cerebral tanto en el grupo simulado como en el grupo modelo, con áreas blancas que indican tejido infartado y áreas rojas que indican tejido normal. (B) Se presentan los resultados cuantitativos de las puntuaciones de Longa y mNSS, así como la tasa de infarto. La significación estadística en comparación con el grupo simulado se denota por *p &lt; 0,05, con un tamaño de muestra de n = 5. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67060/67060fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67060/67060fig04v5.jpg"> Figura 4: Resultados de la lesión de la neurona cortical en el grupo simulado y el grupo modelo. Expresión de NeuN (A), DCX (B) y MAP-2 (C) en neuronas corticales. Barras de escala: 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67060/67060fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67060/67060fig05v5.jpg"> Figura 5: Diagrama de la oclusión y reperfusión de MCA por Koizumi, Longa y el método modificado. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67060/67060fig05large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Pruebas motoras/fuerte&gt;</td>
			<td>Puntos</td>
		</tr><tr><td>Criar a la rata por la cola</td>
			<td>3</td>
		</tr><tr><td colspan="2">1 Flexión de la extremidad anterior</td>
		</tr><tr><td colspan="2">1 Flexión de la extremidad posterior</td>
		</tr><tr><td colspan="2">1 cabezal movido &gt; 10° al eje vertical en 30 s</td>
		</tr><tr><td>Colocar ratas en el suelo</td>
			<td>3</td>
		</tr><tr><td colspan="2">0 Marcha normal</td>
		</tr><tr><td colspan="2">1 Incapacidad para caminar derecho</td>
		</tr><tr><td colspan="2">2 Dando vueltas hacia el lado parético</td>
		</tr><tr><td colspan="2">3 Cae al lado parético</td>
		</tr><tr><td>Pruebas sensoriales</td>
			<td>2</td>
		</tr><tr><td colspan="2">1 Prueba de colocación (prueba visual y táctil)</td>
		</tr><tr><td colspan="2">2 Test propioceptivo (sensación profunda, empujar la pata contra el borde de la mesa para</td>
		</tr><tr><td colspan="2">estimular los músculos de las extremidades)</td>
		</tr><tr><td>Pruebas de equilibrio de viga</td>
			<td>6</td>
		</tr><tr><td colspan="2">0 Equilibrios con postura estable</td>
		</tr><tr><td colspan="2">1 Agarra el lado de la viga</td>
		</tr><tr><td colspan="2">2 Abraza la viga y una extremidad cae de la viga</td>
		</tr><tr><td colspan="2">3 Abraza la viga y dos extremidades caen de la viga, o gira sobre la viga (&gt;60 s)</td>
		</tr><tr><td colspan="2">4 Intenta mantener el equilibrio en la viga pero se cae (&gt;40 s)</td>
		</tr><tr><td colspan="2">5 Intenta mantener el equilibrio en la viga pero se cae (&gt;20 s)</td>
		</tr><tr><td colspan="2">6 Caídas: No hay intento de mantener el equilibrio o agarrarse a la viga (&lt;20 s)</td>
		</tr><tr><td>Reflejos ausentes y movimientos anormales</td>
			<td>4</td>
		</tr><tr><td colspan="2">1 reflejo del pabellón auricular (sacudida de la cabeza al tocar el meato auditivo)</td>
		</tr><tr><td colspan="2">1 Reflejo corneal (parpadear al tocar ligeramente la córnea con algodón)</td>
		</tr><tr><td colspan="2">1 Reflejo de sobresalto (respuesta motora a un breve ruido al romper un papel de portapapeles)</td>
		</tr><tr><td colspan="2">1 Convulsiones, mioclonías, miodistonía</td>
		</tr><tr><td>Puntos máximos</td>
			<td>18</td>
		</tr></tbody></table>Tabla 1: Puntuación de gravedad neurológica modificada.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="2">Goles de Zea-Longa</td>
		</tr><tr><td>Puntuación</td>
			<td>Síntoma</td>
		</tr><tr><td>0 puntos</td>
			<td>Sin déficits neurológicos</td>
		</tr><tr><td>1 punto</td>
			<td>Leve: incapaz de extender completamente la pata delantera derecha cuando se levanta la cola</td>
		</tr><tr><td>2 puntos</td>
			<td>Moderado: círculos a la derecha/izquierda al caminar</td>
		</tr><tr><td>3 puntos</td>
			<td>Grave: se tambalea hacia la derecha/izquierda al caminar</td>
		</tr><tr><td>4 puntos</td>
			<td>Incapacidad para caminar espontáneamente con pérdida del conocimiento</td>
		</tr></tbody></table>Tabla 2: Puntuaciones de Zea-Longa.
Video 1: Pasos clave para la reparación de la ligadura de la incisión de CCA durante la reperfusión en ratas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67060/video%201.zip" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este video.</a>
Video 2: Videos de comportamiento de ratas sometidas a MCAO/R. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67060/video%202.zip" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este video.</a>

Este protocolo describe el proceso de preparación para la reperfusión de la oclusión de la arteria cerebral media a través de la arteria carótida común.

Un modelo modificado de preparación para la reperfusión de oclusión de la arteria cerebral media

The middle cerebral artery occlusion reperfusion (MCAO/R) model is crucial for understanding the pathological mechanisms of stroke and for drug ...

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Research

Investigación

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Oclusión filamentosa de la arteria cerebral media es un modelo común para el estudio de ACV isquémico en los ratones.

Modelado de accidente cerebrovascular en ratones - Oclusión arteria cerebral media con el modelo de filamento

Aquí se presenta un protocolo para producir una oclusión distal medio permanente de la arteria cerebral en ratas hembras de edad avanzada con la oclusión simultánea de las arterias carótidas para generar grandes infartos corticales y los déficits sostenidos. Mostramos la confirmación del tamaño de la lesión mediante resonancia magnética estructural a las 24 horas y 8 semanas después del accidente cerebrovascular.

Realización Permanente distal cerebral media carótida común con oclusión de la arteria en ratas de edad avanzada para el Estudio de la isquemia cortical con sostenida de la discapacidad

Con el fin de entender la fisiopatología del accidente cerebrovascular, es importante utilizar modelos fiables. En este trabajo se va a describir uno de los modelos de accidente cerebrovascular de uso más frecuente en los ratones, llamado el medio modelo de oclusión de la arteria cerebral (MCAO) (también llamado el filamento de sutura intraluminal o modelo) con reperfusión.

Técnica quirúrgica para la oclusión de la arteria cerebral media y la reperfusión del movimiento inducidos en ratones

Describimos un modelo de ratón de accidente cerebrovascular inducido por la oclusión de la arteria cerebral media utilizando una sutura recubierta de silicona. El protocolo se puede aplicar para inducir una oclusión permanente o una isquemia temporal, seguida de reperfusión.

La inducción de ictus isquémico y la isquemia-reperfusión en ratones con la técnica de oclusión de la arteria Medio y Visualización de un infarto Área

El accidente cerebrovascular neonatal es una causa significativa de lesión cerebral temprana que requiere un modelo traslacional con patrones de lesión focal consistentes y alta reproducibilidad para permitir el estudio. Este estudio describe el procedimiento quirúrgico detallado para crear una lesión focal no hemorrágica, unilateral por isquemia-reperfusión en roedores equivalentes a término.

Transitoria de la arteria cerebral media oclusión Modelo de accidente cerebrovascular neonatal en ratas P10

Obstrucción de filamento intraluminal de la arteria cerebral media es el modelo más frecuentemente utilizado en vivo del movimiento experimental en roedores. Una alternativa quirúrgica para permitir la reparación de la arteria carótida común se realiza aquí, lo que permite la reperfusión de la arteria carótida común y una reperfusión completa para el territorio de la arteria cerebral media.

Oclusión de la arteria Cerebral Media permitiendo la reperfusión mediante la reparación de la arteria carótida común en ratones

Un modelo murino de isquemia-reperfusión cerebral es establecido para investigar la patofisiología del accidente cerebrovascular. Distal, ligar la arteria cerebral media derecha y la arteria carótida común derecha y restablecer el flujo sanguíneo después de 10 o 40 min de isquemia.

Oclusión de los vasos dos ratón modelo de isquemia-reperfusión Cerebral

Este protocolo demuestra un modelo único de brazada de ratón con un infarto de tamaño medio y una excelente tasa de supervivencia. Este modelo permite a los investigadores preclínicos de accidentes cerebrovasculares extender la duración de la isquemia, utilizar ratones de edad avanzada y evaluar los resultados funcionales a largo plazo.

Un modelo de oclusión transcraneal modificado de la arteria cerebral media para estudiar los resultados del accidente cerebrovascular en ratones ancianos

Este protocolo describe el modelo de isquemia cerebral focal transitoria en ratones a través de la oclusión intraluminal de la arteria cerebral media. Además, se muestran ejemplos de evaluación de resultados mediante resonancia magnética y pruebas de comportamiento.

Modelo de oclusión transitoria de la arteria cerebral media de accidente cerebrovascular

El protocolo actual describe un modelo de rata de oclusión/reperfusión de la arteria cerebral media que preserva la estructura anatómica de los vasos cerebrales sin causar daño.

Un modelo en ratas de oclusión/reperfusión de la arteria cerebral media sin dañar la estructura anatómica de los vasos cerebrales

Este protocolo presenta una guía paso a paso para que los investigadores realicen el procedimiento de oclusión de la arteria cerebral media en ratones utilizando el método modificado de la arteria carótida externa de Longa. Las modificaciones presentadas en este artículo tienen como objetivo aumentar la precisión de la oclusión de la arteria cerebral media y asegurar una reperfusión completa.

Optimización del método de oclusión de la arteria cerebral media de Longa para la reperfusión completa

Aprenda a preparar la oclusión y reperfusión de la arteria cerebral media mediante la arteria carótida común en ratas. Este protocolo simplificado facilita el estudio de la isquemia cerebral y el descubrimiento de fármacos neuroprotectores.

Un modelo modificado de preparación para la reperfusión de oclusión de la arteria cerebral media

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