Name: Evaluación de la citotoxicidad mediada por células dependientes de anticuerpos en células cancerosas mediante el bioensayo reportero de citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-13T14:20:00.000+00:00
Duration: 5 min 21 s
Description: Aprende a evaluar la citotoxicidad mediada por células dependientes de anticuerpos en células cancerosas mediante un bioensayo reportero rápido y preciso. Este método permite obtener resultados en un día para investigación en inmunoterapia oncológica.

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<meta charset="utf8"></head><body>Células de cáncer de tiroides como efectores en un bioensayo ADCC para la inmunoterapia contra el cáncer

<ol><li>Zahavi, D., AlDeghaither, D., O'Connell, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancing+antibody-dependent+cell-mediated+cytotoxicity%3A+a+strategy+for+improving+antibody-based+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Antib+Ther%22%5BJournal%5D)">Enhancing antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity: a strategy for improving antibody-based immunotherapy.</a> Antib Ther. 1 (1), 7-12 (2018).</li>
<li>Fenis, A., Demaria, O., Gauthier, L., Vivier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+immune+cell+engagers+for+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">New immune cell engagers for cancer immunotherapy.</a> Nat Rev Immunol. 24 (7), 471-486 (2024).</li>
<li>Pinto, S., Pahl, J., Schottelius, A., Carter, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reimagining+antibody-dependent+cellular+cytotoxicity+in+cancer%3A+the+potential+of+natural+killer+cell+engagers%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">Reimagining antibody-dependent cellular cytotoxicity in cancer: the potential of natural killer cell engagers.</a> Trends Immunol. 43 (11), 932-946 (2022).</li>
<li>Ochoa, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody-dependent+cell+cytotoxicity%3A+immunotherapy+strategies+enhancing+effector+NK+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Antibody-dependent cell cytotoxicity: immunotherapy strategies enhancing effector NK cells.</a> Immunol Cell Biol. 95 (4), 347-355 (2017).</li>
<li>Wang, W., Erbe, A. K., Hank, J. A., Morris, Z. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NK+cell-mediated+antibody-dependent+cellular+cytotoxicity+in+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">NK cell-mediated antibody-dependent cellular cytotoxicity in cancer immunotherapy.</a> Front Immunol. 6, 368(2015).</li>
<li>Chung, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+in+vitro+antibody-dependent+cell-mediated+cytotoxicity+activity+of+therapeutic+antibodies+-+impact+of+effector+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Characterization of in vitro antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity activity of therapeutic antibodies - impact of effector cells.</a> J Immunol Methods. 407, 63-75 (2014).</li>
<li>Shimasaki, N., Jain, A., Campana, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NK+cells+for+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">NK cells for cancer immunotherapy.</a> Nat Rev Drug Discov. 19 (3), 200-218 (2020).</li>
<li>Cheng, Z. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+robust+reporter-based+ADCC+assay+with+frozen%2C+thaw-and-use+cells+to+measure+Fc+effector+function+of+therapeutic+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Development of a robust reporter-based ADCC assay with frozen, thaw-and-use cells to measure Fc effector function of therapeutic antibodies.</a> J Immunol Methods. 414, 69-81 (2014).</li>
<li>Parekh, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+validation+of+an+antibody-dependent+cell-mediated+cytotoxicity-reporter+gene+assay%5BTitle%5D)+AND+%22MAbs%22%5BJournal%5D)">Development and validation of an antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity-reporter gene assay.</a> MAbs. 4 (3), 310-318 (2012).</li>
<li>Hogarth, P. M., Pietersz, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fc+receptor-targeted+therapies+for+the+treatment+of+inflammation%2C+cancer+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Fc receptor-targeted therapies for the treatment of inflammation, cancer and beyond.</a> Nat Rev Drug Discov. 11 (4), 311-331 (2012).</li>
<li>Chung, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+evaluation+of+fucose+reducing+effects+in+a+humanized+antibody+on+Fcgamma+receptor+binding+and+antibody-dependent+cell-mediated+cytotoxicity+activities%5BTitle%5D)+AND+%22MAbs%22%5BJournal%5D)">Quantitative evaluation of fucose reducing effects in a humanized antibody on Fcgamma receptor binding and antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity activities.</a> MAbs. 4 (3), 326-340 (2012).</li>
<li>Promega. ADCC Reporter Bioassay Core Kit Technical Manual. , 
 <a target="_blank" href="https://www.promega.sg/-/media/files/resources/protocols/technical-manuals/101/adcc-reporter-bioassay-core-kit-protocol.pdf?rev=bec36264c0b6470591ded081377d207d&sc_lang=en">https://www.promega.sg/-/media/files/resources/protocols/technical-manuals/101/adcc-reporter-bioassay-core-kit-protocol.pdf?rev=bec36264c0b6470591ded081377d207d&sc_lang=en</a> (2023).</li>
<li>Miller, A. S., Tejada, M. L., Gazzano-Santoro, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+measuring+antibody-dependent+cell-mediated+cytotoxicity+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Methods for measuring antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity in vitro.</a> Methods Mol Biol. 1134, 59-65 (2014).</li>
<li>Lo Nigro, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NK-mediated+antibody-dependent+cell-mediated+cytotoxicity+in+solid+tumors%3A+biological+evidence+and+clinical+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">NK-mediated antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity in solid tumors: biological evidence and clinical perspectives.</a> Ann Transl Med. 7 (5), 105(2019).</li>
<li>Gómez Román, V. R., Murray, J. C., Weiner, L. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aG%C3%B3mez+Rom%C3%A1n%2C+VR+%22Antibody+Fc%22">Antibody Fc</a>. Ackerman, M. E., Nimmerjahn, F. , Academic Press. 1-27 (2014).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>0.5% Tripsina-EDTA</td><td>Gibco</td><td>15400-054</td><td>Diluir 10x en PBS para hacer 0.05% Tripsina</td></tr><tr><td>1x Tris Buffer Solución Salina (TBS)</td><td>1st BASE</td><td>BUF-3030-1X1L</td><td>Para el lavado de membranas en Western blot</td></tr><tr><td>1.5 M Tris Buffer, pH 8.8</td><td>1st BASE</td><td>BUF-1419-1L-pH8.8</td><td>Para la preparación de gel SDS</td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M7522-100ML</td><td>Para la preparación de muestras de Western blot</td></tr><tr><td>30% Solución de acrilamida/Bis</td><td>Bio-Rad</td><td>#1610158</td><td>Para la preparación de gel SDS</td></tr><tr><td>4x Laemmli Buffer</td><td>Bio-Rad</td><td>#1610747</td><td>Para la preparación de muestras de Western blot</td></tr><tr><td>Microplaca de poliestireno blanco de 96 pocillos con fondo plano transparente</td><td>Corning Incorporated</td><td>3610</td><td>Para ensayo</td></tr><tr><td>ADCC Bioensayo ADCC Células efectoras (0,65 mL)</td><td>Promega</td><td>G7011</td><td>Incluye en el kit de núcleo de bioensayo indicador ADCC (Promega G7010), 1 x 1 vial</td></tr><tr><td>Kit de núcleo de bioensayo reportero ADCC</td><td>Promega</td><td>G7010</td><td>Mencionado como kit de bioensayo ADCC para el ensayo ADCC en este experimento</td></tr><tr><td>Persulfato de amonio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A3678-25G</td><td>Para la preparación de gel SDS</td></tr><tr><td>Bevacizumab (anticuerpo anti VEGF humanizado)</td><td>MVASI-Uso</td><td></td> <td>como anticuerpo de control negativo en el ensayo</td></tr> <tr><td>de montaje ADCCBHT-101</td><td>Instituto Leibniz DSMZ</td><td>ACC279</td><td>Línea celular de cáncer de tiroides papilar anaplásico humano&nbsp;</td></tr><tr><td>Tampón de ensayo de luciferasa Bio-Glo</td><td>Promega</td><td>G7941</td><td>Incluye en el kit central de bioensayo reportero ADCC (Promega G7010), 1 x 10 mL</td></tr><tr><td>Sustrato de ensayo de luciferasa Bio-Glo (liofilizado)</td><td>Promega</td><td>G7941</td><td>Incluye en el kit de núcleo de bioensayo reportero ADCC (Promega G7010), 1 x 1 vial</td></tr><tr><td>Raspador de células</td><td>GenFollower</td><td>GD00235</td><td>Para extraer células del matraz de cultivo</td></tr><tr><td>Cetuximab (anticuerpo quimérico anti-EGFR)</td><td>ERBITUX-Uso</td><td></td> <td>como anticuerpo terapéutico en el ensayo ADCC</td></tr><tr><td>Sustrato HRP quimioluminiscente</td><td>Merck Millipore</td><td>WBKLS0500</td><td>Para la detección de proteínas en Western blot</td></tr><tr><td>Agua destilada</td><td>Gibco</td><td>15230-162</td><td>Para la preparación de gel SDS</td></tr><tr><td>Suero fetal bovino (FBS)</td><td>Gibco</td><td>10270-106 Suplemento de medios de</td><td>cultivo</td></tr><tr><td>Sistema de imagen</td> <td>iBright CL1500Thermo Scientific</td><td>2462621100038</td><td>Para la detección de proteínas en Western blot</td></tr><tr><td>L-glutamina, 200 mM</td><td>Gibco</td><td>25030-081 Suplemento de</td><td>medios de cultivo</td></tr><tr><td>Suero bajo en IgG</td><td>Promega</td><td>G7110</td><td>Incluye en el kit de núcleo de bioensayo indicador ADCC (Promega G7010), 1 x 4 mL</td></tr><tr><td>Megafuge 8R</td><td>Thermo Scientific</td><td>42876589</td><td>Centrífuga</td></tr><tr><td>Anticuerpos monoclonales anti-EGFR de ratón</td><td>BD Biosciences</td><td>610016</td><td>Anticuerpo primario en el western blot</td></tr><tr><td>Anticuerpos monoclonales anti-VEGFR</td><td>en ratones BD Biosciences</td><td>571194</td><td>Anticuerpo primario en el western blot</td></tr><tr><td>tampón de disociación celular no enzimática</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C5789-100ML</td><td>Para la recolección de células del matraz T75</td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina</td><td>PAN Biotech</td><td>P06-07100</td><td>Antibacteriano para medios de cultivo</td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato (PBS), pH 7,2, Filtrado estéril</td><td>1ª BASE</td><td>CUS-2048-1x1L</td><td>Uso como solución de lavado para células</td></tr><tr><td>Kit de ensayo Pierce BCA</td><td>Thermo Scientific</td><td>23225</td><td>Para medir la concentración de proteínas</td></tr><tr><td>Inhibidor de proteasa y fosfatasa</td><td>Thermo Scientific</td><td>A32959</td><td>Para la digestión de proteínas en la preparación de muestras para el Western blot</td></tr><tr><td>PVDF membrana (Immobilin-P)</td><td>Merck Millipore</td><td>IPVH00010</td><td>Para la transferencia de proteínas en Western blot</td></tr><tr><td>Conejo anti-ratón IgG, Fc&gamma; Anticuerpo secundario conjugado con HRP</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>315-035-046</td><td>Anticuerpo secundario en western blot</td></tr> Medio del <tr><td>Roswell Park Memorial Institute (RPMI)</td><td>Capricornio Científico</td><td>RPMI-XA</td><td>Medios de cultivo celular</td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Promega</td><td>G7080</td><td>Incluye en el kit de núcleo de bioensayo indicador ADCC (Promega G7010), 1 x 36 mL</td></tr><tr><td>de leche desnatada en polvo</td><td>Merck Millipore</td><td>70166-500G</td><td>Para el bloqueo de membranas en Western blot</td></tr><tr><td>Dodecil Sulfato de Sodio</td><td>1º BASE</td><td>BIO-2050-500g</td><td>Para la preparación de gel</td></tr><tr><td>SDS SW-1736</td><td>Cytion</td><td>300453</td><td>Tiroides humana Cáncer de células escamosas Línea celular</td></tr><tr><td>Matraces de cultivo T75</td><td>SPL Lifesciences</td><td>70075</td><td>Matraz de cultivo celular</td></tr><tr><td>Tecan Lector multimodo modelo Spark 10M</td><td>Tecan</td><td>1607000294</td><td>para cuantificación de luminicidad</td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Bio-Rad</td><td>#1610801</td><td>Para la preparación de gel SDS</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Promega</td><td>H5151</td><td>Para el lavado de membranas en Western blot</td></tr><tr><td>Analizador de viabilidad celular Vi-cell XR</td><td>Beckman Coulter</td><td>AL15072</td><td>Contador de células</td></tr></tbody></table>

evaluación de la citotoxicidad mediada por células dependientes de anticuerpos en células cancerosas mediante el bioensayo reportero de citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos

Assessing Antibody-dependent, Cell-mediated Cytotoxicity in Cancer Cells using Antibody-Dependent Cell-Mediated Cytotoxicity Reporter Bioassay

La expresión de EGFR y VEGFR en las células diana BHT-101 y SW-1736 se detectó mediante Western blot. Se detectó la expresión de EGFR en las células BHT-101 y SW-1736, pero no la expresión de VEGFR (Figura 3).
Utilizando el kit de bioensayo ADCC, detectamos la reacción ADCC del anticuerpo anti-EGFR, cetuximab, utilizando líneas celulares positivas para EGFR, BHT-101 y SW-1736, como células diana. El bevacizumab, un inactivador del VEGF, se utilizó como anticuerpo de control negativo. Se incubaron diferentes concentraciones de anticuerpos y células efectoras con las células diana. La señal de luminiscencia se detectó utilizando un lector de placas (Figura 2). Se encontró un mayor pliegue de inducción de actividad de ADCC en los grupos de Cetuximab (anticuerpo anti-EGFR), pero no se observó actividad de ADCC en Bevacizumab (antagonista de VEGF) para ambas líneas celulares. Esto demostró el efecto ADCC dirigido a los antígenos de membrana extracelular de EGFR para ambas líneas celulares. Mediante el uso de este método, se validó la reacción ADCC en presencia de Cetuximab en dos líneas celulares anaplásicas de cáncer de tiroides (BHT101 y SW1736) (Figura 4).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67077/67077fig01.jpg"> 
Figura 1: Diagrama esquemático que muestra la reacción de ADCC con el kit de bioensayo ADCC. Los sitios de unión a antígenos en el anticuerpo terapéutico se unen a los antígenos de superficie en las células diana. Esta unión conduce a la unión de la porción Fc del anticuerpo a los receptores FcƳRIIIa de las células efectoras, que han sido modificados genéticamente con NFAT-RE luc, produciendo una señal de luminiscencia en las células efectoras. Esta cifra fue modificada del manual del kit ADCC Reporter Bioassay Core con permiso12. Abreviaturas: ADCC = citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos; Fc = Región cristalizable del fragmento; NFAT = Factor Nuclear de la Célula T Activada; RE = Elemento de respuesta; luc = Luciferasa. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67077/67077fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67077/67077fig02.jpg"> 
Figura 2: Lectura de luminiscencia y diagrama experimental del diseño de placa de 96 pocillos del sistema de cocultivo ADCC. Las señales de luminiscencia son leídas por un lector de luminiscencia. Fila A: Los pozos del 1al 9contienen tampón de bioensayo ADCC. Fila B: 3 pozos rd-8th contienen el sistema de reacción ADCC de BHT101 (células diana + anticuerpo + células efectoras). El2º pocillo está sin anticuerpos. El9º pozo contiene solo tampón de bioensayo ADCC. Fila C: Los pozos 3 rd-8th contienen el sistema de reacción ADCC de SW-1736 (célula diana + anticuerpo + células efectoras). El2º pocillo está sin anticuerpos. El9º pozo contiene solo tampón de bioensayo ADCC. Fila D: 1pozo-9 contiene tampón de ensayo. Abreviaturas: ADCC = citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos; AB = tampón de bioensayo ADCC; VEGFR = Receptor del Factor de Crecimiento Epitelial Vascular; EGFR = receptor del factor de crecimiento epidérmico; mAb = anticuerpo monoclonal. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67077/67077fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67077/67077fig03.jpg"> 
Figura 3: Detección de la expresión de EGFR y VEGFR en carcinoma de tiroides BHT-101 y SW-1736 mediante Western blot. Se detectó expresión de EGFR, pero no de VEGFR, en ambas líneas celulares. Se utilizó B-actina como control de carga. Abreviaturas: EGFR = receptor del factor de crecimiento epidérmico; VEGFR = factor de crecimiento epidérmico vascular. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67077/67077fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67077/67077fig04.jpg"> 
Figura 4: Inducción de pliegues de la actividad de ADCC. (A) La línea celular de cáncer de tiroides BHT-101 exhibe un efecto ADCC en presencia del anticuerpo anti-EGFR Cetuximab. (B) La línea celular de cáncer de tiroides SW-1736 exhibe un efecto ADCC en presencia del anticuerpo anti-EGFR Cetuximab. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67077/67077fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Evaluación de la citotoxicidad mediada por células dependientes de anticuerpos en células cancerosas mediante el bioensayo reportero de citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos

The method for antibody-dependent, cell-mediated cytotoxicity (ADCC) represents an important tool to assess the efficacy of therapeutic antibodies in ...

assessing-antibody-dependent-cell-mediated-cytotoxicity-cancer-cells

Research

Investigación

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Immunology and Infection

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Evaluación de la citotoxicidad mediada por células dependientes de anticuerpos en células cancerosas mediante el bioensayo reportero de citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (Video) | JoVE Journal

Evaluación de la citotoxicidad mediada por células dependientes de anticuerpos en células cancerosas mediante el bioensayo reportero de citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos

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