Name: Generación de organoides vasculares a partir de células madre pluripotentes inducidas por humanos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-12-13T13:20:00.000+00:00
Duration: 4 min 41 s
Description: Aprende a generar organoides vasculares a partir de células madre pluripotentes inducidas humanas usando inhibidores ROCK y confinamiento en micropocillos. Este método mejora la reproducibilidad y permite aplicaciones en modelado de enfermedades.

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<meta charset="utf8"></head><body>Organoides vasculares derivados de hiPSC para el cribado de fármacos y el modelado de enfermedades

<ol><li>Park, S. E., Georgescu, A., Huh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoids-on-a-chip%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Organoids-on-a-chip.</a> Science. 364 (6444), 960-965 (2019).</li>
<li>Takebe, T., Wells, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoids+by+design%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Organoids by design.</a> Science. 364 (6444), 956-959 (2019).</li>
<li>Griffith, L. G., Swartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capturing+complex+3d+tissue+physiology+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Bio%22%5BJournal%5D)">Capturing complex 3d tissue physiology in vitro.</a> Nat Rev Mol Cell Bio. 7 (3), 211-224 (2006).</li>
<li>Lancaster, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebral+organoids+model+human+brain+development+and+microcephaly%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cerebral organoids model human brain development and microcephaly.</a> Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).</li>
<li>Pasca, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+cortical+neurons+and+astrocytes+from+human+pluripotent+stem+cells+in+3d+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Functional cortical neurons and astrocytes from human pluripotent stem cells in 3d culture.</a> Nat Methods. 12 (7), 671-678 (2015).</li>
<li>Takasato, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kidney+organoids+from+human+iPS+cells+contain+multiple+lineages+and+model+human+nephrogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis.</a> Nature. 526 (7574), 564-568 (2015).</li>
<li>Koike, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+human+hepato-biliary-pancreatic+organogenesis+from+the+foregut-midgut+boundary%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Modelling human hepato-biliary-pancreatic organogenesis from the foregut-midgut boundary.</a> Nature. 574 (7776), 112-116 (2019).</li>
<li>Takebe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascularized+and+functional+human+liver+from+an+iPSC-derived+organ+bud+transplant%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Vascularized and functional human liver from an iPSC-derived organ bud transplant.</a> Nature. 499 (7459), 481-484 (2013).</li>
<li>Osakada, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+the+generation+of+rod+and+cone+photoreceptors+from+mouse%2C+monkey+and+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Toward the generation of rod and cone photoreceptors from mouse, monkey and human embryonic stem cells.</a> Nat Biotechnol. 26 (2), 215-224 (2008).</li>
<li>Potente, M., Gerhardt, H., Carmeliet, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+and+therapeutic+aspects+of+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Basic and therapeutic aspects of angiogenesis.</a> Cell. 146 (6), 873-887 (2011).</li>
<li>Wimmer, R. A., Leopoldi, A., Aichinger, M., Kerjaschki, D., Penninger, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+blood+vessel+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Generation of blood vessel organoids from human pluripotent stem cells.</a> Nat Protoc. 14 (11), 3082-3100 (2019).</li>
<li>Wimmer, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+blood+vessel+organoids+as+a+model+of+diabetic+vasculopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Human blood vessel organoids as a model of diabetic vasculopathy.</a> Nature. 565 (7740), 505-510 (2019).</li>
<li>He, S., et al. Mapping morphological malformation to genetic dysfunction in blood vessel organoids with 22q11.2 deletion syndrome. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHe%2C+S+%22Biorxiv%22">Biorxiv</a>. , (2021).</li>
<li>He, S., et al. Human vascular organoids with a mosaic akt1 mutation recapitulate proteus syndrome. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHe%2C+S+%22Biorxiv%22">Biorxiv</a>. , (2024).</li>
<li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+polypharmacology+platform+promotes+cytoprotection+and+viability+of+human+pluripotent+and+differentiated+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">A versatile polypharmacology platform promotes cytoprotection and viability of human pluripotent and differentiated cells.</a> Nat Methods. 18 (5), 528-541 (2021).</li>
<li>Ungrin, M. D., Joshi, C., Nica, A., Bauwens, C., Zandstra, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reproducible%2C+ultra+high-throughput+formation+of+multicellular+organization+from+single+cell+suspension-derived+human+embryonic+stem+cell+aggregates%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Reproducible, ultra high-throughput formation of multicellular organization from single cell suspension-derived human embryonic stem cell aggregates.</a> PLoS ONE. 3 (2), e1565(2008).</li>
<li>Hwang, Y. -S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microwell-mediated+control+of+embryoid+body+size+regulates+embryonic+stem+cell+fate+via+differential+expression+of+wnt5a+and+wnt11%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Microwell-mediated control of embryoid body size regulates embryonic stem cell fate via differential expression of wnt5a and wnt11.</a> Proc Natl Acad Sci. 106 (40), 16978-16983 (2009).</li>
<li>Antonchuk, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+embryoid+bodies+from+human+pluripotent+stem+cells+using+aggrewell+plates%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Formation of embryoid bodies from human pluripotent stem cells using aggrewell plates.</a> Methods Mol Biol. 946, 523-533 (2013).</li>
<li>Lippmann, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+blood-brain+barrier+endothelial+cells+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Derivation of blood-brain barrier endothelial cells from human pluripotent stem cells.</a> Nat Biotechnol. 30 (8), 783-791 (2012).</li>
<li>Nishihara, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+to+brain+microvascular+endothelial+cell-like+cells+suitable+to+study+immune+cell+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Star+Protoc%22%5BJournal%5D)">Differentiation of human pluripotent stem cells to brain microvascular endothelial cell-like cells suitable to study immune cell interactions.</a> Star Protoc. 2 (2), 100563(2021).</li>
<li>Qian, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+to+blood-brain+barrier+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Adv%22%5BJournal%5D)">Directed differentiation of human pluripotent stem cells to blood-brain barrier endothelial cells.</a> Sci Adv. 3 (11), e1701679(2017).</li>
<li>Stebbins, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+pluripotent+stem+cell-derived+brain+pericyte-like+cells+induce+blood-brain+barrier+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Adv%22%5BJournal%5D)">Human pluripotent stem cell-derived brain pericyte-like cells induce blood-brain barrier properties.</a> Sci Adv. 5 (3), eaau7375(2019).</li>
<li>Campisi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+self-organized+microvascular+model+of+the+human+blood-brain+barrier+with+endothelial+cells%2C+pericytes+and+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">3D self-organized microvascular model of the human blood-brain barrier with endothelial cells, pericytes and astrocytes.</a> Biomaterials. 180, 117-129 (2018).</li>
<li>Osaki, T., Sivathanu, V., Kamm, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+3D+vascular+and+neuronal+networks+in+a+microfluidic+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Engineered 3D vascular and neuronal networks in a microfluidic platform.</a> Sci Rep. 8 (1), 5168(2018).</li>
<li>Osaki, T., Uzel, S. G. M., Kamm, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microphysiological+3D+model+of+amyotrophic+lateral+sclerosis+%28ALS%29+from+human+iPS-derived+muscle+cells+and+optogenetic+motor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Adv%22%5BJournal%5D)">Microphysiological 3D model of amyotrophic lateral sclerosis (ALS) from human iPS-derived muscle cells and optogenetic motor neurons.</a> Sci Adv. 4 (10), eaat5847(2018).</li>
<li>Sakurai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microengineered+vascularized+bleeding+model+that+integrates+the+principal+components+of+hemostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">A microengineered vascularized bleeding model that integrates the principal components of hemostasis.</a> Nat Commun. 9 (1), 509(2018).</li>
<li>Kim, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+of+a+biomimetic+pericyte-covered+3d+microvascular+network%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Engineering of a biomimetic pericyte-covered 3d microvascular network.</a> PLoS ONE. 10 (7), e0133880(2015).</li>
<li>Kosyakova, N., et al. Differential functional roles of fibroblasts and pericytes in the formation of tissue-engineered microvascular networks in vitro. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKosyakova%2C+N+%22Biorxiv%22">Biorxiv</a>. , (2019).</li>
<li>Whisler, J. A., Chen, M. B., Kamm, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+perfusable+microvascular+network+morphology+using+a+multiculture+microfluidic+system%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+C+Methods%22%5BJournal%5D)">Control of perfusable microvascular network morphology using a multiculture microfluidic system.</a> Tissue Eng Part C Methods. 20 (7), 543-552 (2013).</li>
<li>Haase, K., Kamm, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+on-chip+vascularization%5BTitle%5D)+AND+%22Regen+Med%22%5BJournal%5D)">Advances in on-chip vascularization.</a> Regen Med. 12 (3), 285-302 (2017).</li>
<li>Wong, K. H. K., Chan, J. M., Kamm, R. D., Tien, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+models+of+vascular+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Microfluidic models of vascular functions.</a> Annu Rev Biomed Eng. 14 (1), 205-230 (2012).</li>
<li>Boerckel, J. D., Uhrig, B. A., Willett, N. J., Huebsch, N., Guldberg, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+regulation+of+vascular+growth+and+tissue+regeneration+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Mechanical regulation of vascular growth and tissue regeneration in vivo.</a> Proc Natl Acad Sci. 108 (37), E674-E680 (2011).</li>
<li>Homan, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow-enhanced+vascularization+and+maturation+of+kidney+organoids+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Flow-enhanced vascularization and maturation of kidney organoids in vitro.</a> Nat Methods. 16 (3), 255(2019).</li>
<li>Mansour, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vivo+model+of+functional+and+vascularized+human+brain+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">An in vivo model of functional and vascularized human brain organoids.</a> Nat Biotechnol. 36 (5), 432-441 (2018).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>2-Mercaptoetanol (1000x)</td><td>Gibco</td><td>21985023</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6964</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 AffiniPure F(ab')2 Fragmento de burro anti-conejo IgG (H + L)</td><td>Jackson Immuno Research Labs</td><td>711-546-152</td><td>reconstituir con 0.25 mL 50% glicerol,&nbsp; almacenar a -20 &ng; C hasta 1 año, relación de dilución para su uso: 1:1000</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 AffiniPure F(ab')2 Fragmento de burro anticabra IgG (H+L)&nbsp;</td><td>Jackson Immuno Research Labs</td><td>705-606-147</td><td>reconstituye con 0.25 mL 50% de glicerol, &nbsp; almacene a -20 grados; C hasta por 1 año, proporción de dilución para el uso: suplemento de B27 1:1000</td></tr><tr><td>menos vitamina A (50x)</td><td>Gibco</td><td>12587010</td><td>descongelar a 4 & grados; C, alícuota y almacenar a -20 &deg; C, evite el ciclo de congelación-descongelación</td></tr><tr><td>BMP4</td><td>ProSpec</td><td>CYT-081</td><td>reconstituir con ddH2O estéril a una concentración de 100 ng/&micro; L, alícuota y almacenar a -20 &deg; </td></tr><tr><td>Anticuerpo C CD31&nbsp;</td><td>abcam</td><td>ab28364</td><td>relación de dilución: 1:400</td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Eppendorf</td><td>022626001</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Tocris Bioscience</td><td>4423/10</td><td>hacer la solución madre a 12 mM con DMSO, y almacenar a -20 &deg; C hasta por 1 año.</td></tr><tr><td>Chroman 1</td><td>Tocris</td><td>7163/10</td><td>hacer la solución madre a 100 &micro; M con DMSO, y almacene a -20 &deg; C hasta por 1 año.</td></tr><tr><td>Colágeno I&nbsp;</td><td>Microscopio confocal Corning</td><td>40236</td><td></td></tr><tr><td>Nikon</td><td></td><td>AXRMP/Ti2</td><td></td></tr><tr><td>Placas de eplasia Corning</td><td>4441</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Countess II FL contador de células automatizado</td><td>Thermo Fisher</td><td>AMQAF1000</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12, suplemento GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>10565018</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12, polvo</td><td>Gibco</td><td>12500062</td><td>hacer 10 veces la solución madre con ddH2O biograde y esterilizarla con un 0,2 &micro; Filtro M. Almacenar a 4 &deg;C.</td></tr><tr><td>Edi042A</td><td>Cedars Sinai</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Emricasan</td><td>Medchemexpress LLC</td><td>HY1039610MG</td><td>hacer la solución de stock a 1 mM con DMSO, y almacenar a -20 &deg; C hasta por 1 año.</td></tr><tr><td>Anticuerpo ERG</td><td>Cell Singali Technology</td><td>97249</td><td>relación de dilución: 1:400</td></tr><tr><td>Suero fetal bovino - Premium</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td>descongelar a 4 & grados; C&nbsp; y alícuota, tienda at&nbsp; -20 &deg; C hasta por cinco años, o almacene a 4 &deg; C durante un máximo de un mes</td></tr><tr><td>FGF2</td><td>ProSpec</td><td>CYT557</td><td>reconstituir con ddH2O estéril a una concentración de 100 ng/&micro; L, alícuota y almacenar a -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Plato de cultivo celular de fluoroplato</td><td>World Precision Instruments</td><td>FD35-100</td><td></td></tr><tr><td>Forskolin</td><td>Tocris Bioscience</td><td>1099</td><td>reconstituir con DMSO a una concentración de 12 mM, alícuota y almacenar a -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Gentamicina (50 mg/mL)</td><td>Gibco</td><td>15710064</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX suplemento (100x)</td><td>Gibco</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>Heparina, 100 kU</td><td>MilliporeSigma</td><td>375095100KU</td><td>reconstituir con ddH2O estéril a una concentración de 4 kU/mL</td></tr><tr><td>HEPES (1 M)</td><td>Gibco</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora</td><td>Thermo Scientific 13998123</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Knockout Serum Reemplazo</td><td>Gibco 10828028</td><td></td><td>descongelar a 4 & deg; C, alícuota y almacenar a -20&deg; C, evite el ciclo de congelación-descongelación</td></tr><tr><td>Matrigel, GFR Matriz de membrana basal</td><td>Corning</td><td>356230</td><td>descongelación a 4 & grados; C, alícuota y almacenar a -80 grados; C, evite el ciclo de congelación-descongelación</td></tr><tr><td>MEM Solución de aminoácidos no esenciales (NEAA, 100x)</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>Agua de grado de biología molecular</td><td>Corning</td><td>46000CV</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR plus kit</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>1001130</td><td>descongelar a 4 & grados; C, alícuota y almacenar a -20&deg; C, evite el ciclo de congelación-descongelación</td></tr><tr><td>suplemento de N2 (100x)</td><td>Gibco</td><td>17502048</td><td>descongela a 4 & grados; C, alícuota y almacenar a -20&deg; C, evite el ciclo de congelación-descongelación</td></tr><tr><td>de la solución de NaOH (1 M)</td><td>Cytiva&nbsp; HyClone</td><td>SH31088.01</td><td></td></tr><tr><td>Medio NeuroBasal</td><td>Gibco</td><td>21103049</td><td></td></tr><tr><td>NIS-Elements, ver 5.42</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Normal Donkey Serum</td><td>Jackson Immuno Research Labs</td><td>17000121</td><td>reconstituir con ddH2O estéril de 10 mL, almacenar a 4 & grados; C durante un máximo de dos semanas</td></tr><tr><td>paraformaldehído, 20%</td><td>Electrónica Microscopy Sciences</td><td>15713S</td><td>diluido con PBS</td></tr><tr><td>PBST, 20x</td><td>Thermofisher</td><td>28352</td><td></td></tr><tr><td>PDGFR&beta; anticuerpo</td><td>R& D</td> Relación de dilución <td>AF385</td><td>: 1:400</td></tr><tr><td>suplemento de poliamina (1000x)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8483</td><td></td></tr><tr><td>Rapiclear reactivo de limpieza, 1.49</td><td>SUNJIN LAB</td><td>RC149001</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato de sodio (7.5%)</td><td>Gibco</td><td>25080094</td><td></td></tr><tr><td>desoxicolato de sodio monohidrato</td><td>Thermofisher</td><td>J6228822</td><td>disolver con ddH2O para una solución madre al 1% (wt/v)</td></tr><tr><td>TBST, 20x</td><td>Thermofisher</td><td>28360</td><td></td></tr><tr><td>trans-ISRIB</td><td>Tocris Bioscience</td><td>5284/10</td><td>hacen la solución madre a 1 mM con DMSO y almacenan a -20 grados; C hasta por 1 año.</td></tr><tr><td>Tritin X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787-50ML</td><td></td></tr><tr><td>Tinte Azul Trypan (0.4%)</td><td>Thermo Fisher</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7949-100ML</td><td></td></tr><tr><td>VEGF-A</td><td>ProSpec</td><td>CYT-116</td><td>reconstituir con ddH2O estéril a una concentración de 100 ng/&micro; L, alícuota y almacenar a -20 grados; C</td></tr></tbody></table>

generación de organoides vasculares a partir de células madre pluripotentes inducidas por humanos

Vascular Organoid Generation from Human-Induced Pluripotent Stem Cells

La Figura 1A presenta el esquema de este protocolo, incluidos los componentes clave utilizados en cada etapa. La diferenciación comenzó con la formación de EB, seguida de la inducción del mesodermo y la especificación del linaje vascular (Figura 1B-D). Los agregados se hicieron más grandes y menos esféricos con el tiempo. Los organoides comenzaron a mostrar bordes ásperos el día 5. Después de incrustarse en la mezcla de colágeno I-membrana basal, las células endoteliales vasculares y los pericitos brotaron y crecieron para formar redes vasculares complejas ya en el día 7 (Figura 1E). Como el objetivo principal de este método modificado es minimizar las variaciones entre los diferentes lotes de generación, medimos el tamaño de EB de dos lotes independientes, y tanto las mediciones de tamaño como el análisis estadístico confirmaron la consistencia y uniformidad con este método (Figura 1F).
Para validar la diferenciación vascular, los organoides se recolectaron el día 5 antes de la inclusión y se tiñeron con marcadores vasculares, incluidos CD31, ERG1 y PDGFRβ. Los organoides expresaron CD31, ERG1 y PDGFRβ (Figura 2), lo que indica la presencia de células endoteliales vasculares y pericitos.
Después del aclaramiento del tejido, las redes vasculares se analizaron con microscopía de inmunofluorescencia de montaje completo (Figura 3A). Los organoides maduros se tiñeron con CD31, ERG1 y PDGFRβ el día 17 (Figura 3B, muestra en el bloque de gel) y el día 28 (Figura 3C, la muestra se extrajo del bloque de gel y se cultivó individualmente en una placa de 96 pocillos; nótese que la red vascular en los bordes envolvía los esferoides en lugar de expandirse radialmente después de recuperarse del bloque de gel).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67125/67125fig01.jpg"> Figura 1: Generación de organoides vasculares. (A) Esquema de los pasos y cronograma para la generación de organoides vasculares. (B-E) Imágenes representativas de campo claro de organoides vasculares en diferentes etapas. Barras de escala: 100 μm. (F) Análisis estadístico en tamaño EB de dos lotes diferentes de generación de EB utilizando el método de micropocillos presentado en este trabajo. Para la generación de EB se utilizaron 1.000 celdas por micropocillo, y para los lotes 1 y 2, n = 42 y n = 40, respectivamente. La significación se presenta como ns, no significativa. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67125/67125fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67125/67125fig02.jpg"> Figura 2: Inmunotinción de organoides vasculares antes de la inclusión en gel. Imágenes fluorescentes representativas de organoides teñidos con los marcadores endoteliales (A) CD31 (verde) y (B) ERG1 (verde), así como con (C) el marcador de pericitos, PDGFRβ (verde), respectivamente. Los núcleos se contratiñeron con DAPI (azul). Barras de escala: 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67125/67125fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67125/67125fig03.jpg"> Figura 3: Caracterizaciones inmunofluorescentes de la red vascular en organoides vasculares. (A) Una imagen representativa muestra organoides vasculares incrustados en gel en la placa de vidrio después de la limpieza del tejido. Los organoides eran transparentes pero visibles bajo una luz ultravioleta de 385 nm. (B) Una imagen representativa en 3D de montaje completo del organoide vascular en el día 17. El organoide vascular se tiñó con DAPI (azul), el marcador de células endoteliales vasculares, CD31 (verde) y el marcador de pericitos, PDGFRβ (magenta). (C) Una imagen 3D representativa de montaje completo de un organoide vascular recuperado en el día 28, teñida con los marcadores endoteliales CD31 (rojo) y ERG1 (verde). Barras de escala: 150 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67125/67125fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>medio de expansión hiPSC</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr><tr><td>Medio basal mTeSR Plus</td>
			<td>400 mL</td>
		</tr><tr><td>Suplemento mTeSR Plus</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr><tr><td>Gentamicina (50 mg/mL)</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr></tbody></table>Tabla 1: Composición del medio de expansión hiPSC.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Medio de siembra hiPSC</td>
			<td>20 mL</td>
		</tr><tr><td>Medio de expansión PSC</td>
			<td>20 mL</td>
		</tr><tr><td>Cromán 1 (100 μM)</td>
			<td>10 μL</td>
		</tr><tr><td>Emricasan (1 mM)</td>
			<td>30 μL</td>
		</tr><tr><td>Suplemento de poliamina (1000x)</td>
			<td>20 μL</td>
		</tr><tr><td>trans-ISRIB (1 mM)</td>
			<td>14 μL</td>
		</tr></tbody></table>Tabla 2: Composición del medio de siembra hiPSC.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>N2B27 medio</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr><tr><td>DMEM/F-12, suplemento GlutaMAX</td>
			<td>48.6 mL</td>
		</tr><tr><td>Medio NeuroBasal</td>
			<td>48.6 mL</td>
		</tr><tr><td>Suplemento GlutaMAX (100x)</td>
			<td>0,5 ml</td>
		</tr><tr><td>Solución de aminoácidos no esenciales MEM (NEAA, 100x)</td>
			<td>0,5 ml</td>
		</tr><tr><td>2-Mercaptoetanol (1000x)</td>
			<td>0,1 mL</td>
		</tr><tr><td>Gentamicina (50 mg/mL)</td>
			<td>0,1 mL</td>
		</tr><tr><td>Suplemento de N2 (100x)</td>
			<td>0,5 ml</td>
		</tr><tr><td>Suplemento de B27 menos vitamina A (50x)</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr><tr><td>Heparina, 4 kU/mL</td>
			<td>0,1 mL</td>
		</tr></tbody></table>Tabla 3: Composición del medio N2B27.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Medio de inducción de mesodermo (MIM)</td>
			<td>3 mL</td>
		</tr><tr><td>N2B27 medio</td>
			<td>3 mL</td>
		</tr><tr><td>BMP4 (100 ng/μL)</td>
			<td>0,9 μL</td>
		</tr><tr><td>CHIR99021 (12 mM)</td>
			<td>3 μL</td>
		</tr></tbody></table>Tabla 4: Composición del medio de inducción del mesodermo (MIM).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Medio de diferenciación vascular 1 (VDM1)</td>
			<td>3 mL</td>
		</tr><tr><td>N2B27 medio</td>
			<td>3 mL</td>
		</tr><tr><td>Forsklin (12 mM)</td>
			<td>0,5 μL</td>
		</tr><tr><td>VEGFA (100 ng/μL)</td>
			<td>3 μL</td>
		</tr></tbody></table>Tabla 5: Composición del medio de diferenciación vascular 1 (VDM1).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Mezcla de colágeno I</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr><tr><td>Colágeno I (3,61 g/mL)</td>
			<td>2.77 mL</td>
		</tr><tr><td>10x DMEM/F12 medio</td>
			<td>0,5 ml</td>
		</tr><tr><td>Bicarbonato de sodio, 7,5%</td>
			<td>0,5 ml</td>
		</tr><tr><td>HEPES, 1 M</td>
			<td>0,5 ml</td>
		</tr><tr><td>H2O</td>
			<td>0,73 ml</td>
		</tr><tr><td>NaOH, 1M</td>
			<td>75 μL</td>
		</tr></tbody></table>Tabla 6: Composición de la mezcla de colágeno I.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Colágeno I - mezcla de matriz de membrana basal</td>
			<td>6,5 mL</td>
		</tr><tr><td>Mezcla Collage I</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr><tr><td>Matrigel (10 mg/mL)</td>
			<td>1,5 ml</td>
		</tr></tbody></table>Tabla 7: Composición de la mezcla de matriz de colágeno I-membrana basal.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Medio de diferenciación vascular 2 (VDM2)</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr><tr><td>DMEM/F-12, suplemento GlutaMAX™</td>
			<td>3.67 mL</td>
		</tr><tr><td>Gentamicina (50 mg/mL)</td>
			<td>5 μL</td>
		</tr><tr><td>Solución de aminoácidos no esenciales MEM (NEAA, 100X)</td>
			<td>50 μL</td>
		</tr><tr><td>2-Mercaptoetanol (1000x)</td>
			<td>5 μL</td>
		</tr><tr><td>Heparina, 4 kU/mL</td>
			<td>5 μL</td>
		</tr><tr><td>Reemplazo de suero knockout</td>
			<td>0,75 ml</td>
		</tr><tr><td>FBS</td>
			<td>0,5 ml</td>
		</tr><tr><td>VEGFA (100 ng/μL)</td>
			<td>5 μL</td>
		</tr><tr><td>FGF2 (100 ng/μL)</td>
			<td>5 μL</td>
		</tr></tbody></table>Tabla 8: Composición del medio de diferenciación vascular 2 (VDM2).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Búfer de bloqueo</td>
			<td>50 mL</td>
		</tr><tr><td>Suero de burro</td>
			<td>2.5 mL</td>
		</tr><tr><td>Preadolescente 20</td>
			<td>0,25 ml</td>
		</tr><tr><td>Tritón X-100</td>
			<td>0,25 ml</td>
		</tr><tr><td>Solución de desoxicolato de sodio (1%, peso por v)</td>
			<td>0,5 ml</td>
		</tr><tr><td>PBS</td>
			<td>46.5 mL</td>
		</tr></tbody></table>Tabla 9: Composición del tampón bloqueante para inmunotinción.

Generación de organoides vasculares a partir de células madre pluripotentes inducidas por humanos

Vascular organoids derived from human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) recapitulate the cell type diversity and complex architecture of human ...

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Research

Investigación

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingeniería

El video muestra un método para generar organoides cerebrales humanos a partir de células madre pluripotentes inducidas. Muestra cómo la neurosfera forma una capa neuroectodérmica, que suprime la formación de otras capas germinales. Las neuroesferas están incrustadas en una matriz de gel 3D y forman brotes neuroepiteliales. Cuando se incuban con medios organoides, estas yemas neuroepiteliales se diferencian en regiones específicas del cerebro, lo que da lugar a la formación de organoides...

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Generación de organoides renales en suspensión a partir de células madre pluripotentes inducidas

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Desarrollo, la expansión y<em&gt; En vivo</em&gt; Monitoreo de las células NK humanas a partir de células madre embrionarias humanas (hESCs) y y células madre pluripotentes inducidas (iPSCs)

Aprende a generar organoides vasculares a partir de células madre pluripotentes inducidas humanas usando inhibidores ROCK y confinamiento en micropocillos. Este método mejora la reproducibilidad y permite aplicaciones en modelado de enfermedades.

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