Técnica de natación horizontal en forma de U para la preparación de espermatozoides de alta calidad con bajo índice de fragmentación del ADN

[Narrador] La investigación se centra en un método para la optimización de espermatozoides, con el objetivo de determinar si la técnica UHS ofrece ventajas en la preparación de espermatozoides de alta calidad con un bajo índice de fragmentación del ADN. Se ha utilizado la tecnología microfluídica para optimizar la selección de espermatozoides de alta calidad con menor DFI. La principal limitación del método UHS es su alta dependencia de la capacidad de autonatación de espermatozoides de alta calidad. El método UHS no es adecuado para pacientes con espermatozoides completamente inmóviles. La tigmotaxis juega un papel crucial en la separación de espermatozoides. La órbita en forma de U tiene un límite más largo, lo que facilita el libre movimiento de los espermatozoides de alta calidad, lo que permite su separación completa de los espermatozoides inmóviles, las impurezas y otros componentes. En comparación con la técnica DGC, el método de carril UHS implica menos pasos de operación manual para el personal de laboratorio, y los espermatozoides de alta calidad obtenidos a través del método de carril UHS no se someten a procedimientos de centrifugación repetidos, lo que resulta en un DFI más bajo. Para comenzar, agregue 20 microlitros de medio de fertilización al plato de operación para crear pistas en forma de U. Chupe 10 microlitros de medio de fertilización con una pipeta para crear una gota circular en el punto de inicio izquierdo de la pista en forma de U. Usando medio de fertilización, cree dos gotas amortiguadoras de 10 microlitros cada una a intervalos a lo largo de la sección central izquierda de la pista en forma de U. Conecte todas las gotas con el medio de fertilización para formar una pista continua. Use 2.5 microlitros de pirrolidona de polivinilo, o PVP, para crear una tira larga de gota de líquido en el lado derecho de la pista en forma de U. Haga seis microgotas usando el medio de procesamiento de ovocitos en el lado derecho de la tira de PVP. Agregue siete mililitros de aceite de cultivo al plato, asegurándose de que el aceite cubra completamente el punto más alto de las gotas. Coloque el plato en una incubadora de dióxido de carbono al 6% a 37 grados Celsius durante la noche para equilibrar. Después de recolectar el semen, mida su volumen utilizando el método de pesaje, asegurando una precisión de 0,01 mililitros. Coloque la muestra de semen en un ambiente de 37 grados Celsius durante 15 a 30 minutos y aspírela en una pipeta desechable de plástico de gran diámetro. Si el semen no se licua en 60 minutos, agregue una cantidad igual de medio de fertilización. Inhala y exhala repetidamente la mezcla con una pipeta de transferencia de plástico desechable hasta que se licúe por completo. Mida el valor de pH del semen utilizando papel de prueba de pH de precisión con un rango de seis a 10. Tome 10 microlitros de semen completamente licuado y gotee en una cámara de conteo macular. Evalúe la motilidad de los espermatozoides bajo un campo de 200X usando un microscopio óptico. Agregue cinco microlitros de semen a la microgota del medio de fertilización en el punto de inicio izquierdo de la pista en forma de U en la placa de operación ICSI. Ajuste el ángulo y la posición de la aguja de sujeción de ovocitos y la aguja de inyección debajo de la lente del objetivo 4X. Después de verificar la configuración, transfiera el ovocito seleccionado a la microgota del medio de procesamiento de ovocitos en la placa de operación ICSI. Coloque la placa de operaciones que contiene los ovocitos en la platina caliente del operador del microscopio preparado. Después de ajustar el enfoque, baje la aguja de inyección en la tira de PVP del plato de operaciones ICSI. Mueva la aguja de inyección hacia la tira larga en el lado derecho de la pista en forma de U y extraiga espermatozoides de alta calidad. Transfiera los espermatozoides a la tira de PVP en el lado derecho y coloque los espermatozoides en el fondo del plato de operaciones. Presione suavemente la aguja de inyección en la sección media o inferior de la cola del esperma. Tire rápidamente de la aguja de inyección hacia atrás y rasque el esperma para inmovilizarlo. Ahora, inhale el esperma desde la cola hasta la cabeza en la aguja de inyección. Inyecte lentamente espermatozoides en el citoplasma del ovocito e incube el ovocito inyectado. Agregue 1,5 mililitros de solución de centrifugación en gradiente de densidad al 45% a un tubo de ensayo de fondo cónico estéril de 15 mililitros. Y agregue lentamente 1,5 mililitros de solución de centrifugación en gradiente de densidad del 90% al fondo de la solución de gradiente del 45%. Ahora, agregue el semen licuado a la solución de centrifugación en gradiente y gire el tubo a 300 G durante 15 minutos a temperatura ambiente. Después de eliminar el sobrenadante, recolecte aproximadamente 0,5 mililitros del sedimento espermático restante y mézclelo con tres mililitros de medio de fertilización. Centrifugar la mezcla a 200 G durante cinco minutos a temperatura ambiente. Pipetea con cuidado el sobrenadante, dejando aproximadamente 0,2 mililitros de sedimento, luego agita y mezcla para volver a suspender el sedimento. Finalmente, cuente la concentración y motilidad de los espermatozoides antes de almacenar la muestra en una incubadora de dióxido de carbono al 6% a 37 grados Celsius para su uso posterior. Coloque un tubo que contenga 25 microlitros de solución de agarosa de bajo punto de fusión en un baño de agua de 90 a 100 grados Celsius durante uno o dos minutos. Luego transfiera el tubo a un baño de agua a 37 grados Celsius durante cinco minutos hasta que la temperatura se estabilice. Agregue de tres a 10 microlitros de semen a tubos de agarosa de bajo punto de fusión y mezcle bien. Deje caer 30 microlitros de la mezcla en un portaobjetos de vidrio pretratado en posición horizontal. Después de cubrir, coloque el portaobjetos de vidrio pretratado en un refrigerador a dos a ocho grados centígrados durante cuatro minutos, asegurándose de que permanezca en posición horizontal. Retire el portaobjetos del refrigerador y deslícelo suavemente fuera del vidrio de la cubierta. Sumerja rápidamente el portaobjetos de vidrio pretratado en una solución desnaturalizante durante siete minutos. Retire el portaobjetos y colóquelo en posición vertical. Luego use papel de filtro para absorber el exceso de gotas de agua sin tocar el área de la muestra. Lave el portaobjetos en agua destilada durante cinco segundos. Sumerja el portaobjetos de vidrio en serie en las soluciones adecuadas para el período específico. Luego, manteniendo el portaobjetos de vidrio pretratado horizontalmente, agregue alrededor de un mililitro de la solución de colorante mezclado en el portaobjetos. Después de teñir durante cinco minutos, enjuague suavemente el portaobjetos de vidrieras con agua destilada de 10 a 15 veces. Los espermatozoides de alta calidad con buena motilidad progresiva nadaron suavemente a lo largo del borde de la pista en forma de U, lo que facilitó que la aguja de inyección intracitoplasmática de espermatozoides los agarrara individualmente. Si bien se obtuvieron buenos espermatozoides utilizando ambos métodos, el índice de fragmentación del ADN de los espermatozoides de alta calidad separados mediante el método de centrifugación por gradiente de densidad fue significativamente mayor en comparación con el método de natación horizontal en forma de U.