Name: Evaluación de la actividad de la ADNasa mediante transferencia de energía de resonancia de fluorescencia radiométrica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-07-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 55 s
Description: Aprenda a evaluar la actividad de ADNasa mediante un ensayo FRET radiométrico sensible que permite monitoreo en tiempo real. Este método sistemático analiza el efecto del pH y la temperatura en nucleasas débiles.

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<ol><li>A guide to ratiometric fluorescence. , AZoM. 
 <a target="_blank" href="https://www.azom.com/article.aspx?ArticleID=16081">https://www.azom.com/article.aspx?ArticleID=16081</a> (2018).</li>
<li>Müller, S. M., Galliardt, H., Schneider, J., Barisas, B. G., Seidel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+F%C3%B6rster+resonance+energy+transfer+by+monitoring+sensitized+emission+in+living+plant+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">Quantification of Förster resonance energy transfer by monitoring sensitized emission in living plant cells.</a> Front Plant Sci. 4, 413(2013).</li>
<li>Lakowicz, J. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLakowicz%2C+JR+%22Principles+of+fluorescence+spectroscopy%22">Principles of fluorescence spectroscopy</a>. , Springer Science & Business Media. (2006).</li>
<li>Chai, H., Tang, Y., Guo, Z., Miao, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ratiometric+electrochemical+switch+for+circulating+tumor+DNA+through+recycling+activation+of+blocked+DNAzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Ratiometric electrochemical switch for circulating tumor DNA through recycling activation of blocked DNAzymes.</a> Anal Chem. 94 (6), 2779-2784 (2022).</li>
<li>Liu, G., Ma, X., Tang, Y., Miao, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ratiometric+fluorescence+method+for+ctDNA+analysis+based+on+the+construction+of+a+DNA+four-way+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">Ratiometric fluorescence method for ctDNA analysis based on the construction of a DNA four-way junction.</a> Analyst. 145 (4), 1174-1178 (2020).</li>
<li>Minchew, C. L., Didenko, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoblinker%3A+Brownian+motion+powered+bio-nanomachine+for+FRET+detection+of+phagocytic+phase+of+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Nanoblinker: Brownian motion powered bio-nanomachine for FRET detection of phagocytic phase of apoptosis.</a> PLoS One. 9 (9), e108734(2014).</li>
<li>Didenko, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Express+FRET+labeling+and+analysis+of+phagocytic+clearance%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Express FRET labeling and analysis of phagocytic clearance.</a> Methods Mol Biol. 1644, 3-11 (2017).</li>
<li>Domingo, B., Sabariegos, R., Picazo, F., Llopis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+FRET+standards+by+steady-state+fluorescence+and+lifetime+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc+Res+Tech%22%5BJournal%5D)">Imaging FRET standards by steady-state fluorescence and lifetime methods.</a> Microsc Res Tech. 70 (12), 1010-1021 (2007).</li>
<li>Lee, M. H., Kim, J. S., Sessler, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+molecule-based+ratiometric+fluorescence+probes+for+cations%2C+anions%2C+and+biomolecules%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Soc+Rev%22%5BJournal%5D)">Small molecule-based ratiometric fluorescence probes for cations, anions, and biomolecules.</a> Chem Soc Rev. 44 (13), 4185-4191 (2015).</li>
<li>Torriglia, A., Leprêtre, C., Padrón-Barthe, L., Chahory, S., Martin, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanism+of+L-DNase+II+activation+and+function+as+a+molecular+switch+in+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanism of L-DNase II activation and function as a molecular switch in apoptosis.</a> Biochem Pharmacol. 76 (11), 1490-1502 (2008).</li>
<li>Padron-Barthe, L., Leprêtre, C., Martin, E., Counis, M. F., Torriglia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformational+modification+of+serpins+transforms+leukocyte+elastase+inhibitor+into+an+endonuclease+involved+in+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Conformational modification of serpins transforms leukocyte elastase inhibitor into an endonuclease involved in apoptosis.</a> Mol Cell Biol. 27 (11), 4028-4036 (2007).</li>
<li>Torriglia, A., Martin, E., Jaadane, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+hidden+side+of+SERPINB1%2Fleukocyte+elastase+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">The hidden side of SERPINB1/leukocyte elastase inhibitor.</a> Semin Cell Dev Biol. 62, 178-186 (2017).</li>
<li>Torriglia, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((L-DNase+II%2C+a+molecule+that+links+proteases+and+endonucleases+in+apoptosis%2C+derives+from+the+ubiquitous+serpin+leukocyte+elastase+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">L-DNase II, a molecule that links proteases and endonucleases in apoptosis, derives from the ubiquitous serpin leukocyte elastase inhibitor.</a> Mol Cell Biol. 18 (6), 3612-3619 (1998).</li>
<li>Summer, H., Grämer, R., Dröge, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Denaturing+urea+polyacrylamide+gel+electrophoresis+%28Urea+PAGE%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Denaturing urea polyacrylamide gel electrophoresis (Urea PAGE).</a> J Vis Exp. (32), e1485(2009).</li>
<li>Lauková, L., Konečná, B., Janovičová, Ľ, Vlková, B., Celec, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deoxyribonucleases+and+their+applications+in+biomedicine%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecules%22%5BJournal%5D)">Deoxyribonucleases and their applications in biomedicine.</a> Biomolecules. 10 (7), 1036(2020).</li>
<li>Minchew, C. L., Didenko, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+detection+of+nucleolytic+and+proteolytic+markers+of+lysosomal+cell+death%3A+DNase+II-type+breaks+and+cathepsin+D%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Dual detection of nucleolytic and proteolytic markers of lysosomal cell death: DNase II-type breaks and cathepsin D.</a> Methods Mol Biol. 1554, 229-236 (2017).</li>
<li>Nucleases (DNases and RNases). , Sigma-Aldrich. 
 <a target="_blank" href="https://www.sigmaaldrich.com/US/en/products/protein-biology/proteins-and enzymes/nucleases">https://www.sigmaaldrich.com/US/en/products/protein-biology/proteins-and enzymes/nucleases</a> (2025).</li>
<li>Altairac, S., Zeggai, S., Perani, P., Courtois, Y., Torriglia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis+induced+by+Na%2B%2FH%2B+antiport+inhibition+activates+the+LEI%2FL-DNase+II+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">Apoptosis induced by Na+/H+ antiport inhibition activates the LEI/L-DNase II pathway.</a> Cell Death Differ. 10 (5), 548-557 (2003).</li>
<li>Li, J. J., Geyer, R., Tan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+molecular+beacons+as+a+sensitive+fluorescence+assay+for+enzymatic+cleavage+of+single-stranded+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Using molecular beacons as a sensitive fluorescence assay for enzymatic cleavage of single-stranded DNA.</a> Nucleic Acids Res. 28 (11), E52(2000).</li>
<li>Ma, C., Tang, Z., Huo, X., Yang, X., Li, W., Tan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+monitoring+of+double-stranded+DNA+cleavage+using+molecular+beacons%5BTitle%5D)+AND+%22Talanta%22%5BJournal%5D)">Real-time monitoring of double-stranded DNA cleavage using molecular beacons.</a> Talanta. 76 (2), 458-461 (2008).</li>
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El enfoque de fluorescencia radiométrica es un método analítico que utiliza proporciones de señales de fluorescencia en lugar de depender únicamente de la intensidad de una sola señal 1,2. La ventaja de usar las proporciones es que proporcionan calibración interna y compensan muchos factores aleatorios, como variaciones en las concentraciones de muestras y sondas, parámetros del instrumento, etc. Esto mejora la precisión y la sensibilidad de las sondas fluorescentes.
En el contexto específico de las sondas de transferencia de energía de resonancia (FRET) de Förster, el término "radiométrico" se refiere al hecho de que la medición se basa en la relación de dos señales de emisión del par de fluoróforos donantes y aceptores FRET. Para cuantificar la actividad del analito objetivo, las sondas FRET radiométricas utilizan la relación entre las intensidades de emisión aceptor/donante (o, en algunos casos, la relación donante/aceptor invertida). La relación está directamente relacionada con la eficiencia FRET. Proporciona un mecanismo de autonormalización que minimiza el ruido de fondo y tiene en cuenta las variaciones en las condiciones de iluminación y la concentración de la sonda3.
Las aplicaciones recientes interesantes del método radiométrico incluyen su uso en biosensores electroquímicos radiométricos para la detección de ADN tumoral circulante (ctDNA)4,5, en bionanomáquinas accionadas por movimiento browniano para la detección FRET de la fase fagocítica de la apoptosis6, y para el etiquetado rápido de FRET y el análisis de la depuración fagocítica7. El enfoque radiométrico FRET descrito en este trabajo es útil para la evaluación cuantitativa de la actividad de la ADNasa. Las mediciones del ensayo se basan en las proporciones de las emisiones del par FRET. Debido a su capacidad para detectar incluso una escisión menor y lenta del ADN, el ensayo es particularmente adecuado para la investigación de actividad nucleolítica débil que requiere períodos de observación más largos y para experimentos a diferentes niveles de pH.
Aquí, algunas ventajas específicas del ensayo radiométrico FRET se ilustran por su aplicación para estudiar la actividad de la ADNasa de un inhibidor débil de la elastasa de nucleasas-leucocitos (LEI). El informe incluye un protocolo detallado con instrucciones paso a paso y una descripción del análisis de datos radiométricos.
Descripción de la sonda FRET radiométrica
La sonda FRET radiométrica es un oligo de ADN de 38 meros autocomplementario que lleva el par donante-aceptor FRET de FAM-TAM (fluoresceína-tetrametilrodamina). Su secuencia es 5'-AAGGGT(TAM) CCTGCTGCAGGACCCTTAACGCATTATGCGT(FAM)T-3'. El 38-mer autohibridable asume una conformación en forma de grapa, que comprende dos horquillas conectadas de 23 y 15 nucleótidos, que posicionan sus dos fluoróforos a 23,8 Å entre sí. Esto es significativamente más cercano que el radio de Förster para este par, R0 = 55 Å8. Tal posicionamiento corresponde a una eficiencia muy alta de transferencia de energía del donante al aceptor7: EFRET = 0.993477. Como resultado, cuando se ilumina en la longitud de onda de excitación FAM (488 nm), la sonda FRET emite fluorescencia en la longitud de onda de emisión del aceptor TAM (580 nm), mientras que la emisión FAM (525 nm) se suprime.
La Figura 1A muestra la estructura secundaria de la sonda predicha por UNAFold, con pequeños bucles en ambos vértices de horquilla debido al obstáculo estérico de la curvatura cerrada. El esquema de la detección de roturas de ADN por la sonda FRET se presenta en la Figura 1B. Muestra que la rotura de la oligosonda por una DNasa separa su par FRET. Esta separación produce cambios drásticos en los espectros de emisión de ambos fluoróforos en la sonda. La Figura 1C presenta los espectros de emisión de la sonda antes y después de su escisión y demuestra que la división del par FRET después de la escisión de la sonda DNasa II aumenta la emisión del donante a 525 nm (ID 525 nm) y simultáneamente disminuye la emisión del aceptor a 580 nm (IA 580 nm). La Figura 1D muestra las relaciones PAGE gel y FRET correspondientes a los espectros de emisión. La escisión de la sonda DNasa II produjo dos bandas anchas correspondientes a fragmentos de FAM de 12-16 meros (verde) y TAM de 20-24 meros (rojo), lo que indica cortes aleatorios del 38-mer a cada lado de T23 en las proximidades del área de conexión entre las horquillas.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67134/67134fig1v5.jpg"> 
Figura 1: Estructura y funcionamiento de la sonda FRET radiométrica. (A) Estructura secundaria prevista de la sonda FRET generada por UNAFold. (B) Representación esquemática de la sonda FRET en funcionamiento. La sonda FRET radiométrica es un oligonucleótido de 38 meros en forma de grapa marcado con un donante FRET (FAM) y un aceptor (TAM) a una distancia FRET efectiva de 23,8 Å, lo que garantiza una eficiencia FRET del &gt;99%. La escisión de la oligosonda por una DNasa separa el par FRET, aboliendo FRET. (C) Espectros de emisión de la sonda FRET antes y después de la escisión mediada por ADNasa II. Antes de la escisión, se suprime la emisión de FAM y la emisión de TAM es prominente. La escisión mediada por ADNasa separa FAM y TAM, restaurando la emisión de FAM (pico de 525 nm) y aboliendo la emisión de TAM (caída de 580 nm). Excitación λ = 488 nm. (D) Evaluación radiométrica y electroforética de la sonda FRET antes y después de la escisión de la ADNasa II. Panel superior: relaciones FRET (RD/A = ID 525 nm / IA 580 nm), que representan una medida cuantitativa del estado de la sonda. Rojo: sin afeitar; verde: DNasa II escindida. Panel inferior: Gel PAGE desnaturalizante correspondiente a datos fluorométricos. La escisión de la ADNasa II produce fragmentos marcados con FAM (12-16 nt, verde) y fragmentos marcados con TAM (20-24 nt, rojo), lo que indica una escisión cerca de la conexión entre horquillas, flanqueando T23. El control desactivado muestra fluorescencia amarilla. Escalera: oligonucleótidos marcados con FAM y TAM correspondientes a los segmentos 5 'y 3' de la sonda de 38 meros, con etiquetas fluorescentes en sus posiciones originales. Condiciones de reacción: tampón de acetato de sodio de 10 mM (pH 5,2), sonda FRET de 1 pmol/μL, 0,0033 U/μL de ADNasa II, 24 h a 37 °C. RD/A = ID 525 nm/IA 580 nm; Excitación λ = 488 nm. Condiciones UNAFold: Sonda FRET de 1 μM, 10 mM Na+, 0 mM Mg2+, 37 °C. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67134/67134fig1v5large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Aunque los cambios en los espectros de emisión de prueba individuales son evidentes, las comparaciones cuantitativas entre un gran número de espectros de emisión requieren un parámetro cuantitativo más compacto y fácil de usar. Este papel lo desempeña el ratio FRET. El método de fluorescencia presentado pertenece a un grupo de enfoques radiométricos que se basan en las relaciones directas (de dos canales) de las emisiones de fluorescencia de los miembros del par FRET para sus evaluaciones cuantitativas 2,9.
El enfoque utiliza la relación de emisiones donantes/aceptoras (RD/A = ID 525 nm / IA 580 nm), que está relacionada con la eficiencia de FRET y caracteriza cuantitativamente la condición del 38-mer (roto o intacto). La relación ID / IA proporciona un mecanismo de autonormalización que explica inherentemente las variaciones en factores como la concentración de la sonda, la intensidad de la excitación y el fotoblanqueo3. El enfoque es adecuado solo para sondas FRET que tienen donante y aceptor vinculados dentro de la misma sonda, donde su proporción es conocida y constante. Por esta razón, el enfoque no necesita considerar ni la excitación directa del aceptor ni la diafonía del donante2. La estequiometría fija donante-aceptor de la sonda garantiza que las relaciones de emisión donante/aceptor no se vean afectadas por estas variaciones y reflejen directamente la condición de la sonda. Como resultado, la relación de emisiones donante-aceptor proporciona un parámetro cuantitativo de escisión del ADN con normalización de señal incorporada 2,3.
El ensayo emplea la relación ID / IA ( en lugar de la relación opuestaI A / ID ) porque esta relación describe el cese de FRET después de la escisión de la sonda y, por lo tanto, cambia en la misma dirección que la actividad de la ADNasa, aumentando con una mayor escisión. Esto se ilustra en la Figura 1D, que muestra la relación FRET de la sonda radiométrica y su electroforesis PAGE antes y después de su escisión por DNasa II, ambas correspondientes a los espectros de la Figura 1C. Para demostrar la conveniencia, el tiempo y la facilidad de uso del ensayo FRET radiométrico, se aplicó para descubrir y estudiar la actividad de la ADNasa de un inhibidor débil de la elastasa de nucleasas-leucocitos (LEI).
LEI nucleasa débil
El inhibidor de la proteasa LEI es naturalmente metaestable, es decir, topológicamente desequilibrado. Esta característica es esencial para su mecanismo inhibitorio. Cuando su proteasa diana escinde el bucle del sitio reactivo (RSL) del IPJ, la molécula inhibidora de la proteasa sufre un cambio conformacional drástico, estirando mecánicamente la proteasa en una forma inactiva10,11. Sorprendentemente, esto también rompe y distiende la propia molécula de LEI y desenmascara un sitio críptico de ADNasa que está cubierto en su pliegue nativo, convirtiendo así LEI en una endonucleasa L-DNasa II activa (ADNasa II derivada de LEI)11,12. El sitio críptico de la ADNasa también puede estar expuesto por la desnaturalización y rotura del LEI causada por su incubación nocturna a pH 2 en ácido sulfúrico10,13. La utilización de este ensayo FRET para estudiar el LEI demostró que los tratamientos de desnaturalización química agresivos y la escisión enzimática dirigida no son estrictamente necesarios para desenmascarar la actividad nucleolítica latente del LEI.
La aplicación y el protocolo presentados del enfoque FRET radiométrico describen el descubrimiento de una actividad débil de la ADNasa inherentemente presente en el LEI normal y no desnaturalizado. El descubrimiento de la capacidad nucleolítica intrínseca del IPJ no incorporado y su análisis fue posible gracias a la idoneidad del ensayo para períodos prolongados de observación a diferentes niveles de pH ácido.

<table><tbody><tr><td>Placa de 96 pocillos</td><td>Halcón</td><td>353219</td><td></td></tr><tr><td>Sonda de ADN FRET</td><td>ADN IDT</td><td></td><td>5'-AAG GGT(TAM)CCT GCT GCA GGA CCC TTA ACG CAT TAT GCG T(FAM)T- 3'; FAM &ndash; Fluoresceína-dT; &nbsp; TAM &ndash; Tetrametilrodamina-dT.</td></tr><tr><td>ADNasa II</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8764</td><td></td></tr><tr><td>Cámara réflex digital EVOLT</td><td>Olimpo</td><td>E500</td><td></td></tr><tr><td>Aparato de electroforesis en gel con fuente de alimentación</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LEI</td><td>Novoproteína</td><td>CJ01</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de imágenes en gel LiCOR</td><td>LiCOR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agua libre de nucleasas</td><td>Invitrogen</td><td>10977015</td><td></td></tr><tr><td>Gel PAGE prefabricado</td><td>Invitrogen</td><td>EC68852</td><td></td></tr><tr><td>Solución tampón de acetato de sodio pH 5.2</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S2899-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Espectrofluorómetro</td><td>Tecan</td><td></td><td>Fuego de vida 2</td></tr></tbody></table>

evaluación de la actividad de la adnasa mediante transferencia de energía de resonancia de fluorescencia radiométrica

Assessment of DNase Activity by Ratiometric Fluorescence Resonance Energy Transfer

Este estudio representativo destaca las ventajas específicas del enfoque FRET radiométrico para investigar reacciones enzimáticas lentas que requieren períodos prolongados de observación. En particular, la aplicación demuestra la detección y el análisis de la actividad inherente de la ADNasa del LEI utilizando un sistema FRET radiométrico. Los resultados de este estudio se muestran en la Figura 2.
U...

Evaluación de la actividad de la ADNasa mediante transferencia de energía de resonancia de fluorescencia radiométrica

The present protocol describes a simple and sensitive ratiometric F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) assay for the detection and quantitative ...

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