Name: Visualización de la respuesta al daño del ADN en células de Purkinje mediante cultivos organotípicos cerebelosos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-12-27T12:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 41 s
Description: Aprende a visualizar la respuesta al daño del ADN en células de Purkinje mediante cultivos organotípicos cerebelosos de ratón. Este método permite estudiar la degeneración cerebelosa en la ataxia-telangiectasia.

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<meta charset="utf8"></head><body>Células cerebelosas de Purkinje: respuesta al daño del ADN en cultivos organotípicos

<table><tbody><tr><td><fuerte>Reactivo y equipo</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>150 x 30 cm Placa</td><td>de Petri Corning Inc.</td><td>3261</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri de 35 x 10 mm</td><td>Corning Inc.</td><td>3294</td><td></td></tr><tr><td>Acetona</td><td>Invitrogen</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>Acetona</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>270725-1L</td><td></td></tr><tr><td>Portaobjetos adhesivos para microscopio</td><td>Marienfeld</td><td>48187</td><td>76 x 26 x 1 mm</td></tr><tr><td>Cuchillas para picadora</td><td>TED PELLA</td><td>Modelo TC752-1</td><td>&nbsp; Referencia Hojas de Afeitar</td></tr><tr><td>BME</td><td>GIBCO</td><td>41010-026 500ml.&nbsp;</td><td>Sin L-Glut</td></tr><tr><td>Insertos de cultivo celular</td><td>Millipore</td><td>PICM0RG50</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucosa</td><td>Biológico Indo.</td><td>02-015-1A</td><td></td></tr><tr><td>HBSS sin rojo fenol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H-1138-500L</td><td>No Ca+,No Mg+</td></tr><tr><td>HBSS con rojo fenol</td><td>Sartorius</td><td>02-015-1A</td><td></td></tr><tr><td>Suero de caballo&nbsp;</td><td>GIBCO</td><td>26050088</td> pinza de iris <td>inactivada por calor</td></tr><tr><td></td><td>CellPath</td><td>GZX-0100-00A</td> Espátula de <td>iris dentada roma de 130 mm</td></tr><tr><td></td><td>F.S.T</td><td>10092-12</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina (200 mM)</td><td>Gibco</td><td>41010026</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>322412-1L</td><td></td></tr><tr><td>Metanol&nbsp;</td><td>Microscopio Sigma-Aldrich</td><td>G5767</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Medio de montaje sin</td><td>GRIGENE. Ltd, Israel</td><td>K239320A</td><td></td></tr><tr><td>Paraquat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>856177-250MG</td><td>Dicloruro de paraquat (viológeno de metilo)</td></tr><tr><td>PARG- Inhibidor de la glicohidrolasa poli(ADP-ribosa)</td><td>Tocris Bioscience, Reino Unido</td><td>PDD 00017273</td><td>sensible a la luz&nbsp;</td></tr><tr><td>Tampón de fosfato</td><td>Biológico Indo.</td><td>02-018-1A</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras, tejido</td><td></td><td></td><td></td>cutáneo</tr><tr><td>Placas de seis pocillos</td><td>Corning incorporadas</td><td>CLS3516</td><td></td></tr><tr><td>discos de corte de repuesto&nbsp;</td><td>TED PELLA</td><td>Modelo 10180-01</td><td></td></tr><tr><td>Picadora de tejidos</td><td>McIlwain</td><td>Modelo TC752</td><td>10180-220</td></tr><tr><td>Pinzas puntiagudas</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tazas urinarias</td><fuerte>Anticuerpos<td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa fluor 488 burro anti Conejo IgG</td><td>&nbsp; Invitrogen</td><td>A21206</td><td>1:500; ab secundario; Tampón de dilución secundario; &nbsp; Incubación durante 2 h a temperatura ambiente</td></tr><tr><td>Anti glial fibrilar ácido protien</td><td>Milliphore</td><td>MAB3402</td><td>1:1500; ab primario; bloqueo; Anfitrión:ratón</td></tr><tr><td>Anti-calbindina-D-28K</td><td>Swant&nbsp;</td><td>CB300</td><td>1:2000; ab primario; bloqueo; huésped: conejo&nbsp;</td></tr><tr><td>Anti-calbindina-D-28K</td><td>Swant</td><td>CB-38a</td><td>1:2000; ab primario; bloqueo&nbsp;</td></tr><tr><td>Reactivo anti-pan-ADP-ribosa</td><td>Milíforo</td><td>MABE1016</td><td>1:800; ab primario; bloqueo; incubación durante 2 h a temperatura ambiente</td></tr><tr><td>DAPI (4',6-diamidina-2'-fenilindol diclorhidrato)</td><td>Señalización celular</td><td>4084</td><td>1:1000; tampón de dilución secundario; incubación durante 20 min a temperatura ambiente</td></tr></tbody></table>

visualización de la respuesta al daño del adn en células de purkinje mediante cultivos organotípicos cerebelosos

Visualizing the DNA Damage Response in Purkinje Cells Using Cerebellar Organotypic Cultures

La Figura 1 ilustra el aspecto general de los cultivos organotípicos cerebelosos. La fila superior de la Figura 1A muestra la foliación cerebelosa, que se mantiene en cultivo, mientras que la fila inferior muestra los PCs teñidos para Calbindin D-28k (verde) y los núcleos neuronales teñidos para NeuN (rojo). En la Figura 1B, los astrocitos de los PCs (rojo) se tiñen para GFAP (verde), una proteína de filamento intermedio de tipo III. Las Figuras 2 y 3 muestran la tinción de PAR observada después de tratar estos cultivos con dos agentes dañinos para el ADN, ambos oxidantes fuertes: bromato de potasio (una concentración final de 10 mM durante 12 h) y paraquat. La respuesta a la PAR fue marcada en los CP tratados en el folio cerebeloso en comparación con el control.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67167/67167fig01.jpg"> Figura 1: Descripción general de los cultivos organotípicos cerebelosos murinos. (A) La fila superior ilustra la foliación cerebelosa, que se mantiene en cultivo. La fila inferior se centra en la capa de PC. Los PC están resaltados por Calbindin D-28k (verde). La tinción de NeuN (rojo) identifica los núcleos neuronales a través de las capas. (B) Una mirada más cercana a las PC (rojo). GFAP (verde), una proteína de filamento intermedio tipo III, que destaca en los astrocitos. Barras de escala = 968,8 μm (A, fila superior), 42,1 μm (A, segunda fila), 72,7 μm (B, fila superior), 18,2 μm (B, segunda fila). Abreviaturas: PC = células de Purkinje; GFAP = proteína ácida fibrilar glial; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67167/67167fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67167/67167fig02.jpg"> Figura 2: Tinción de PAR en un corte cerebeloso tratado con bromato de potasio. El corte cerebeloso se trató con bromato de potasio (KBrO3), un potente agente oxidante, a una concentración final de 10 mM durante 12 h. Barras de escala = 775 μm. Abreviaturas: PAR = poli(ADP-ribosa); DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67167/67167fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67167/67167fig03.jpg"> Figura 3: Respuesta PAR en cortes cerebelosos expuestos al paraquat, un fuerte productor de aniones superóxido. (A) Una vista general de un folio cerebeloso. Obsérvese la robusta respuesta PAR, especialmente en PC, en comparación con el control. (B) Un examen más detallado muestra la respuesta PAR en PC y otros tipos de células. Barras de escala = 193,8 μm (A), 18,2 μm (B). Abreviaturas: PAR = poli(ADP-ribosa); DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67167/67167fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td fo:border="1.5pt solid">Soluciones y tampones</td>
			<td colspan="3" fo:border="1.5pt solid"></td>
		</tr><tr><td fo:border="1.5pt solid">Solución  </td>
			<td colspan="3" fo:border="1.5pt solid">Ingredientes</td>
		</tr><tr><td fo:border="1.5pt solid">Medio de disección</td>
			<td colspan="3" fo:border="1.5pt solid">Solución salina equilibrada de Hank (HBSS) que contiene 0,5% de D-glucosa. Añadir 0,5 mL de solución de D-glucosa al 50% a 50 mL de HBSS sin Mg2+ y Ca2+.</td>
		</tr><tr><td fo:border="1.5pt solid">Medio de cultivo BME</td>
			<td colspan="3" fo:border="1.5pt solid">Mezcle 100 mL de Basal Medium Eagle (BME) que contiene rojo de fenol pero no L-glutamina ni HEPES, con 50 mL de HBSS con rojo de fenol, 50 mL de suero de caballo inactivado por calor, 2 mL de D-glucosa al 50% y 1 mL de L-glutamina 200 mM. Mezclar y filtrar a través de un filtro de 0,22 μm en un entorno estéril. Almacenar a 4 °C</td>
		</tr><tr><td fo:border="1.5pt solid">Solución bloqueante para la inmunotinción</td>
			<td colspan="3" fo:border="1.5pt solid">en 0,1 M Tampón de fosfato: añadir 0,5% Triton X-100, 10% Suero de cabra</td>
		</tr><tr><td fo:border="1.5pt solid">Tampón de dilución de anticuerpos secundarios</td>
			<td colspan="3" fo:border="1.5pt solid">0,1 M tampón de fosfato, 0,2%Triton X-100</td>
		</tr><tr><td fo:border="1.5pt solid">Tampón de lavado</td>
			<td colspan="3" fo:border="1.5pt solid">0,1 M tampón de fosfato, 0,2%Triton X-100</td>
		</tr><tr><td fo:border="1.5pt solid">Solución fijadora</td>
			<td colspan="3" fo:border="1.5pt solid">Actenoe:metanol (1:1 v:v)</td>
		</tr><tr><td fo:border="1.5pt solid">Solución de permeabilización</td>
			<td colspan="3" fo:border="1.5pt solid">Tampón de fosfato 0,1 M, 1%Triton X-100</td>
		</tr><tr><td fo:border="1.5pt solid">Solución DAPI</td>
			<td colspan="3" fo:border="1.5pt solid">Solución madre (2 mg/mL) diluida a 1 μg/mL en 1x PBS</td>
		</tr><tr><td fo:border="1.5pt solid">Tampón de fosfato</td>
			<td colspan="3" fo:border="1.5pt solid">Prepare dos soulutions A y B (ver más abajo). Mezcle las soluciones de acuerdo con las proporciones especificadas a continuación para formar un tampón de fosfato de 0,2 M. A continuación, diluir la solución 0,2M con DDW (1:1) para hacer un tampón de fosfato 0,1 M (solución de trabajo).</td>
		</tr><tr><td fo:border="1.5pt solid">solución A (para 0,2 M)</td>
			<td colspan="3" fo:border="1.5pt solid">12 g de Fosfato Sódico Monobásico Anhidro (Na2HPO4 FW 141.96) 500 mL de DDW</td>
		</tr><tr><td fo:border="1.5pt solid">Solución B (para 0,2 M)</td>
			<td colspan="3" fo:border="1.5pt solid">14,2 g de Fosfato sódico diabásico anhidro (Na2HPO4 FW 141.96) 500 mL de DDW</td>
		</tr><tr><td fo:border="1.5pt solid">Soluciones mixtas para hacer 0,2 M</td>
			<td colspan="3" fo:border="1.5pt solid">Preparar 1 L: 230 mL de solución A y 770 mL de solución B</td>
		</tr><tr><td fo:border="1.5pt solid">Tampón de fosfato de 0,1 M</td>
			<td colspan="3" fo:border="1.5pt solid">Diluir la solución mezclada con DDW (1:1)</td>
		</tr></tbody></table>Tabla 1: Soluciones y su composición.

Visualización de la respuesta al daño del ADN en células de Purkinje mediante cultivos organotípicos cerebelosos

Cerebellar Purkinje cells (PCs) exhibit a unique interplay of high metabolic rates, specific chromatin architecture, and extensive transcriptional ...

visualizing-dna-damage-response-purkinje-cells-using-cerebellar

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Este método describe la generación de organotípicos culturas del cerebelo y el efecto de ciertos estímulos apoptóticos sobre la viabilidad de los diferentes tipos de células del cerebelo.

Organotípicos Culturas del cerebelo: Retos y detección de apoptosis

Se presenta un protocolo que permite ver y para evaluar cuantitativamente la morfología del árbol dendrítico de las células de Purkinje individuales cultivadas en cultivos de cortes organotípicos cerebelosos. Este protocolo tiene como objetivo promover estudios sobre los mecanismos de desarrollo de Purkinje células dendríticas.

El análisis de la morfología de células dendríticas Purkinje en cultivos de corte organotípicos

Este video ilustra una técnica para obtener cortes organotípicos cerebelosos del cerebro de un cachorro de ratón y cultivar los cortes en medios suplementados con nutrientes y factores de crecimiento para imitar el desarrollo cerebeloso in vitro. Además, los cortes cerebelosos específicos se tratan con un compuesto de prueba y la capacidad neuroprotectora del compuesto se analiza mediante una técnica de tinción de inmunofluorescencia.

Análisis de la supervivencia de las células de Purkinje en cultivos organotípicos de cortes cerebelosos

La capa externa del gránulo del cerebelo es el sitio de la amplificación de tránsito más grande en el cerebro en desarrollo. A continuación, presentamos un protocolo para orientar la modificación genética a esta capa en el pico de la proliferación mediante electroporación ex vivo y la cultura de las rebanadas del cerebelo a partir de embriones Día 14 embriones de pollo.

Ex Vivo Cultura de polluelo cerebelosos Rebanadas y espacialmente focalizadas Electroporación de gránulos precursores celulares

Este protocolo describe un método simple para el aislamiento y cultivo de neuronas de gránulo cerebral primario de ratón (CGNs) de cachorros de 6-7 días, transduction eficiente de CGNs por pérdida y ganancia de estudios de la función y modelado de excitotoxicidad neuronal inducida por el NMDA, muerte celular inducida por potasio bajo, daño del ADN y estrés oxidativo utilizando el mismo modelo de cultura.

Modelado de la muerte Neuronal y la degeneración en las neuronas del gránulo cerebeloso primario de ratón

Aquí presentamos un método para preparar organotypic culturas rebanada de cerebelo de ratón y la vaina de mielina de tinción por inmunohistoquímica adecuado para investigar mecanismos de myelination y remielinización en el sistema nervioso central.

Preparación y el Immunostaining de Myelinating Organotypic rebanada cerebelosa culturas

Los cultivos de rodajas organotípicas son una poderosa herramienta para estudiar los procesos neurodesarrollo o degenerativos/regenerativos. Aquí, describimos un protocolo que modela la muerte del neurodesarrollo de las células de Purkinje en cultivos de rebanadas cerebelosas de ratón. Este método puede beneficiar la investigación en el descubrimiento de fármacos neuroprotectores.

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Aprende a visualizar la respuesta al daño del ADN en células de Purkinje mediante cultivos organotípicos cerebelosos de ratón. Este método permite estudiar la degeneración cerebelosa en la ataxia-telangiectasia.

Visualización de la respuesta al daño del ADN en células de Purkinje mediante cultivos organotípicos cerebelosos

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