Name: Establecimiento de un nuevo sistema de perfusión pulmonar ex vivo para pulmones de rata después de la muerte circulatoria (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-18T14:10:00.000+00:00
Duration: 9 min 14 s
Description: Aprenda a establecer un modelo de perfusión pulmonar ex vivo en ratas tras muerte circulatoria. Este sistema mantiene la función pulmonar durante 4 horas y ofrece una plataforma reproducible para investigar la calidad de pulmones donantes.

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Este trabajo fue financiado por la Financiación de la Investigación Clínica del Hospital Nacional de Alto Nivel Nacional y el proyecto Profesionales Médicos de Élite del Hospital de la Amistad China-Japón (números de subvención[2022-NHLHCRF-LX-03-0303] y [ZRJY2021-GG07]).

Los animales de experimentación fueron ratas macho SD con un peso de 250-400 g. Las ratas se alojaron en condiciones experimentales estándar a 18-22 °C con un ciclo controlado de luz-oscuridad de 12 h y tuvieron libre acceso a alimentos y agua. El Comité de Cuidado y Uso de Animales del Instituto de Investigación Clínica del Hospital de la Amistad China-Japón aprobó los experimentos con animales y los llevó a cabo de acuerdo con las directrices. Todas las cirugías se realizaron bajo anestesia general. La Figura 1 presenta un diagrama esquemático y una imagen real del sistema EVLP como referencia. La marca y el modelo específicos de todos los instrumentos y equipos utilizados se detallan en la Tabla de Materiales
1. Construcción de aparatos
NOTA: El plástico impreso en 3D parece ser una opción prometedora para el aparato. Sin embargo, según nuestra experiencia limitada, es difícil regular la fuerza al hacer nudos con materiales plásticos; Muy poca fuerza puede hacer que el tubo se deslice, y demasiada fuerza puede bloquear el tubo de plástico. Los tubos rígidos metálicos evitan estos problemas y son relativamente duraderos, por lo que se utilizan aquí.
<ol>
	<li>Conecte el módulo a la tubería de plástico y utilice un soporte de marco de hierro y una plataforma de elevación ajustable para colocar todas las piezas a la altura adecuada. Agregue 150 mL de perfusión en el tanque de almacenamiento de líquido, abra la bomba peristáltica y ajuste el caudal a 20 mL/min para que la perfusión llene el tubo.</li>
	<li>1.2 Muela una ranura circular para la intubación endotraqueal. Prepare una mezcla de gases que contenga 8% deO2, 6% de CO2 y 86% deN2 como gas hipóxico. Pasa el gas hipóxico a la perfusión a través del pulmón de membrana artificial. Ventile con oxígeno puro durante 5 minutos antes de la medición de gases en sangre.</li>
	<li>Hacer la arteria pulmonar y las cánulas auriculares con tubos huecos de acero inoxidable 304 que están curvados para adaptarse a la anatomía de las ratas (Figura 2A). Muele una ranura circular para la intubación de las arterias. Haga un agujero en el extremo distal de la pared de la cánula auricular y pula el surco anular en la pared externa (Figura 2C). Coloque un dispositivo de escape antes del tubo en el tubo de perfusión de la arteria pulmonar.</li>
	<li>Conecte una válvula de tres vías al sistema de circulación externa del baño de agua y regule la temperatura del depósito, el compartimento del órgano y la perfusión de la arteria pulmonar. Minimice la longitud de la tubería de conexión sin baño de agua y controle el error de temperatura en todos los puntos del dispositivo dentro del rango de ± 0,2 °C. La temperatura deseada para el diseño del estudio es de 37 °C.</li>
	<li>Llene la línea de control de presión con solución salina y ajuste el dispositivo de control de presión a la misma altura que el pulmón del donante. Abra la válvula para conectar la línea de monitoreo de presión con la arteria pulmonar y la línea de perfusión venosa, inicie el colector de datos y ponga a cero. Controle la presión de perfusión arterial y la presión de retorno venoso en tiempo real.</li>
</ol>
2. Anestesia de ratas
<ol>
	<li>Use equipo de protección personal: mascarillas quirúrgicas, guantes y overoles desechables antes de manipular ratas y pañuelos de rata.</li>
	<li>Pesa las ratas y registra sus pesos. Llene una jeringa con 1000 U/kg de heparina e inyéctela en la vena de la cola con una aguja.</li>
	<li>Colocar las ratas en una cámara de inducción cerrada y anestesiarlas con gas isoflurano al 3%. Sujeta los dedos de las ratas; Si no hay respuesta, indica que las ratas han alcanzado la profundidad deseada de anestesia. De lo contrario, continúe aumentando el tiempo de anestesia. Aplique ungüento oftálmico estéril para prevenir la sequedad ocular.</li>
	<li>Prepare múltiples suturas (3-0 o 4-0). Transfiera las ratas a la mesa de operaciones, colóquelas en posición supina, asegúrelas con suturas y desinféctelas con alcohol en aerosol.</li>
</ol>
3. Obtención de pulmón de un donante
<ol>
	<li>Coloque la cabeza de la rata en la máscara de anestesia y mantenga la anestesia suministrando aire que contenga isoflurano al 1,5%. Sujeta los dedos de las ratas; Si no hay respuesta, indica que las ratas han alcanzado la profundidad deseada de anestesia.</li>
	<li>Haga una incisión longitudinal de 2-3 cm con tijeras quirúrgicas para roedores a lo largo de la línea media del cuello frente a la tráquea, corte la piel, diseccione el tejido muscular frente a la tráquea y exponga completamente la tráquea.</li>
	<li>Libere el espacio detrás de la tráquea, pase una sutura 3-0 a través de ella y haga un nudo suelto para su uso posterior. Haga una incisión en forma de V de 0,5 cm con tijeras quirúrgicas para roedores por encima del nudo en la tráquea, inserte un tubo traqueal (14G) en la tráquea, apriete el nudo de sutura y asegure el tubo traqueal (Figura 3A).</li>
	<li>Conecte el tubo traqueal al ventilador, enciéndalo y comience la ventilación de los pulmones.</li>
	<li>Monitorear y registrar los signos vitales con frecuencia para garantizar la anestesia y los cambios en los signos vitales hasta que se confirme la muerte.</li>
	<li>Iniciar maniobras de reclutamiento pulmonar, reiniciar la ventilación mecánica en modo de presión controlada y ventilar durante 5 min. Utilice los siguientes parámetros: PEEP 3 cmH2O, inspiratorio: relación espiratoria (I:E) 1:2, frecuencia respiratoria 40 respiraciones/min y FiO2 0,5.</li>
	<li>Pinzar la tráquea y permitir que los pulmones se sometan a 1 h de tiempo isquémico caliente (WIT). Después del período de WIT, extraiga los pulmones como se describe a continuación y divídalos aleatoriamente en tres grupos: (1) extracción directa de pulmón, (2) 4 h de conservación estática en frío (CS) y (3) evaluación de EVLP de 4 h.</li>
	<li>Para la extracción directa de pulmón, se toman muestras de los pulmones del donante obtenidos sin ningún tratamiento para diversas pruebas. Para 4 h de conservación estática en frío (CS), almacene los pulmones del donante en conservación estática fría en el refrigerador a 4 °C durante 4 h y luego tome muestras para su detección. Evaluación EVLP de 4 h. Para una evaluación de EVLP de 4 horas, siga el paso 5.</li>
	<li>Ajuste la mesa de operaciones a una posición inclinada de 45° a la altura de la cabeza y a los pies bajos.</li>
	<li>Retira el vello con una afeitadora desde el centro del pecho y el abdomen de la rata, desinféctalo con yodo 3 veces y cúbrelo con una toalla quirúrgica.</li>
	<li>Haga una incisión longitudinal de 6-7 cm a lo largo de la línea media del abdomen con tijeras quirúrgicas para roedores, corte la piel, abra la pared abdominal a la cavidad abdominal y exponga los órganos abdominales. Use un hisopo de algodón para empujar suavemente los intestinos hacia el lado derecho de la cavidad abdominal para exponer la vena cava inferior detrás de ellos.</li>
	<li>Con una jeringa, inyectar una solución de 1000 U/kg de heparina en la vena cava inferior. Espere 5 minutos para asegurar una heparinización adecuada de la sangre. La heparina previene la formación de microtrombos en la arteria pulmonar.</li>
	<li>Corta la vena cava inferior de la rata con unas tijeras, desangrándola. Inicie la ventilación mecánica de los pulmones con los ajustes iniciales del ventilador a un volumen corriente de 3 mL/kg, presión positiva al final de la espiración (PEEP) de 2 cmH2O, frecuencia respiratoria de 60 respiraciones/min y una relación I:E de 1:2.</li>
	<li>Use fórceps para levantar la apófisis xifoidea; haga una incisión longitudinal a lo largo del esternón de abajo hacia arriba. Use un separador de costillas para exponer la cavidad torácica. Extirpar el tejido del timo para exponer el corazón y los vasos sanguíneos principales que se encuentran debajo de él. 
	NOTA: Los pulmones de las ratas son frágiles; Evite tocarlos o tocar los órganos abdominales con instrumentos metálicos. Para una mejor visibilidad, empuje suavemente los pulmones a un lado con un hisopo de algodón.</li>
	<li>Libere la aorta de la rata y el espacio detrás de la arteria pulmonar, pase una sutura 3-0 a través de ella y haga un nudo suelto para usarlo más tarde.</li>
	<li>Realice una incisión en forma de V de 2-3 mm en la superficie anterior del tracto de salida del ventrículo derecho, inserte una cánula de la arteria pulmonar en la arteria pulmonar a través de la incisión y apriete la sutura preatada para asegurar la cánula (Figura 3B).</li>
	<li>Corte la punta del corazón de rata, inserte pinzas hemostáticas en el ventrículo izquierdo, rompa las válvulas entre el ventrículo izquierdo y la aurícula izquierda, y asegúrese de que el tracto de salida de la aurícula izquierda esté limpio.</li>
	<li>Conecte la cánula de la arteria pulmonar al circuito de perfusión y enjuague la sangre residual a una velocidad de 0,6-1 mL/min utilizando 15 mL de solución baja en potasio. Enjuague hasta que los pulmones se vuelvan blancos o hasta que el líquido de perfusión que sale del ventrículo izquierdo se vuelva blanco.</li>
	<li>Coloque una sutura detrás del corazón y rodee el ventrículo; inserte la cánula del ventrículo izquierdo a través de la incisión en el ventrículo izquierdo; y apriete la sutura preatada para asegurar la cánula (Figura 3C).</li>
	<li>Corte la tráquea por encima del tubo traqueal, levante la tráquea y use unas tijeras para separar el tejido conectivo detrás de la tráquea hacia abajo hasta el nivel del diafragma.</li>
	<li>Cortar la vena cava inferior y la arteria pulmonar principal por encima del diafragma; extirpar el corazón y los pulmones (Figura 3D).</li>
	<li>Para mantener los pulmones inflados, pinje inmediatamente el tercio inferior de la tráquea al final de la inhalación, recoja el corazón y los pulmones y colóquelos en una solución baja en potasio para su conservación.</li>
	<li>Coloque el corazón y los pulmones en la posición designada del circuito EVLP y conecte la cánula del ventrículo izquierdo al circuito de perfusión (Figura 4A).</li>
</ol>
4. Inicialización del sistema de perfusión pulmonar ex vivo
<ol>
	<li>Ensamble el circuito EVLP: conecte la tubería, el oxigenador, el depósito, la bomba peristáltica y la cámara del órgano.</li>
	<li>Llene el circuito EVLP con 120 mL de solución reparadora de perfusión pulmonar que tenga 1000 unidades de heparina sódica, 50 mg de cefoperazona y 50 mg de metilprednisolona antes de la perfusión. Deshágase de las burbujas de aire en el tubo para usar el dispositivo de escape al final de la perfusión de la arteria pulmonar.</li>
	<li>Ajuste el baño de agua a temperatura ambiente y comience a hacer circular agua tibia para calentar todo el circuito EVLP.</li>
	<li>Abra el programa de adquisición de datos de la computadora y conecte el sensor de presión de la arteria pulmonar, el sensor de peso pulmonar, el sensor de velocidad de la bomba y el sensor de temperatura al circuito EVLP y al registrador.</li>
	<li>Llene el tubo de control de la presión arterial con solución salina normal, ajuste la altura de la mesa para que coincida con la altura del pulmón suministrado, conecte el tubo de control de la presión a la arteria pulmonar y al tubo de perfusión venosa, abra la válvula, inicie el colector de datos y ponga a cero el sistema.</li>
	<li>Abra la válvula de gas hipóxico, pase el gas hipóxico a través del pulmón de membrana durante 10 minutos hasta que la solución de perfusión alcance un estado hipóxico estable, cierre la válvula de gas y detenga la bomba peristáltica, esperando la llegada del pulmón donante para la perfusión pulmonar ex vivo.</li>
	<li>Prepare la mesa de operaciones y los instrumentos quirúrgicos cerca de la plataforma EVLP para animales pequeños y presterilícelos con esterilización por vapor a alta presión.</li>
</ol>
5. Perfusión pulmonar ex vivo
<ol>
	<li>Llene la trampa de burbujas con una cantidad suficiente de solución de perfusión para evitar que las burbujas entren en los pulmones (causando embolia gaseosa).</li>
	<li>Coloque la unidad cardiopulmonar en la cámara del órgano, conéctela al dispositivo EVLP, encienda el ventilador y la bomba peristáltica, e inicie la perfusión EVLP (Figura 4B).</li>
	<li>Inicie la perfusión al 20% del caudal objetivo; aumente gradualmente el caudal hasta el caudal objetivo en 1 h; calcule el caudal objetivo como el 20% del gasto cardíaco (75 mL/min/250 g de peso del donante).</li>
	<li>Ajuste el intercambiador de calor a 40 °C para mantener una temperatura pulmonar de 37,5 °C. En 20 minutos, la temperatura de la solución de perfusión aumenta de 25 °C a 37 °C.</li>
	<li>Retire la pinza endotraqueal 20 min después del inicio de la perfusión. Iniciar la ventilación mecánica con una frecuencia respiratoria (RR) de 60 lpm, presión positiva al final de la espiración (PEEP) de 3 cmH2 O, y un volumen corriente inicial (VT) de 4 mL/kg, alcanzando un volumen corriente máximo de 6 mL/kg en 10 min.</li>
	<li>Iniciar el flujo de gas hipóxico (8% CO2, 6%O2 y 86%N2) para mantener la solución de perfusión PCO2 entrando en la arteria pulmonar entre 35 y 45 mmHg simultáneamente durante la ventilación.</li>
	<li>Controle constantemente la velocidad de flujo de la solución de perfusión, la presión arteriovenosa, la presión máxima de las vías respiratorias y los parámetros de la función pulmonar durante la perfusión.</li>
</ol>

Evaluation of Apoptosis and Lung Injury in DCD Donor Lungs Preserved by EVLP

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Los autores declaran que no tienen intereses contrapuestos.

Este estudio presenta un diseño rentable y modular para una plataforma EVLP de animales pequeños y la validación de la eficacia de esta plataforma en un modelo de rata de DCD. Los hallazgos indican que EVLP puede mejorar significativamente la calidad de los pulmones de donantes fallecidos, ampliando así el grupo de donantes potenciales para el trasplante de pulmón. La escasez de pulmones de donantes para trasplantes sigue siendo un desafío crítico. Para abordar este problema, algunos países han comenzado a implementar programas DCD28. Este enfoque ofrece una estrategia valiosa para aumentar el número de injertos de órganos viables. En particular, múltiples estudios han demostrado que las tasas de supervivencia a largo plazo después del trasplante de hígado con órganos DCD son comparables a las que usan órganos de DBD29,30. Sin embargo, la utilización de pulmones de donantes con DCD sigue siendo limitada debido al daño extenso causado por la isquemia prolongada31. La evaluación eficiente y la utilización de los limitados recursos pulmonares obtenidos de los donantes de DCD tienen un inmenso potencial para aliviar la escasez de pulmones trasplantables. EVLP es una técnica prometedora que puede mejorar la calidad de los pulmones y extender su tiempo de preservación antes del trasplante. Para validar la efectividad de EVLP en comparación con el almacenamiento en frío a 4 ° C, empleamos un modelo de muerte circulatoria en ratas. Nuestra hipótesis es que nuestra técnica de perfusión puede mitigar el daño causado por la lesión por isquemia-reperfusión y mejorar la función pulmonar después de la muerte circulatoria. Nuestros resultados experimentales son consistentes con los hallazgos recientes reportados por Wang et al.32 y Hasenauer et al.33.
Mantener una temperatura constante en todo el circuito de perfusión es crucial para una función óptima de EVLP. Sin embargo, muchos sistemas EVLP existentes carecen de mecanismos de control de temperatura confiables y adaptables. Los sistemas de intercambio de calor individuales a menudo requieren ajustes que alteran la temperatura en ubicaciones específicas. Esta fluctuación de temperatura puede afectar la composición del fluido de perfusión, interrumpir las mediciones del índice de oxigenación y, en última instancia, comprometer la precisión de los resultados experimentales. Para superar esta dificultad, se creó un sistema EVLP y se equipó con tres intercambiadores de calor de baño de agua separados que se colocaron en el depósito, las zonas de perfusión de la arteria pulmonar y la cámara del órgano. Además, el sistema utiliza tuberías mínimas para minimizar la pérdida de calor y garantizar un control preciso de la temperatura dentro de un rango de 4-40 °C. Esta configuración permite un control de temperatura altamente preciso, con temperaturas medidas en cada segmento del circuito que no se desvían más de ± 0,2 °C del punto de ajuste. El diseño cumple eficazmente con los estrictos requisitos de control de temperatura para los experimentos EVLP. 
Los modelos animales pequeños, debido a sus órganos más pequeños, son particularmente susceptibles al edema pulmonar y la atelectasia34. Estas complicaciones dificultan significativamente la realización de experimentos de perfusión prolongados. Para abordar este desafío y garantizar una protección pulmonar óptima durante la perfusión, adoptamos el enfoque de Toronto, el estándar de oro actual en la práctica clínica. Este método implica un aumento gradual tanto en el caudal de perfusión como en la ventilación durante un período de tiempo establecido35. La perfusión se inició al 10% del flujo objetivo (20% del gasto cardíaco = 75 mL/min/250 g de peso del donante) y aumentó gradualmente durante 1 h. Del mismo modo, la ventilación se inició a una velocidad baja (4 mL/kg) y el volumen corriente se incrementó gradualmente hasta un máximo de 6 mL/kg durante 10 min. La investigación también destaca los beneficios de agregar albúmina sérica bovina (BSA) al perfusato. La suplementación con BSA eleva la presión osmótica coloidal, reduciendo así el edema tisular36. En EVLP de animales pequeños, existen dos configuraciones de perfusión primarias basadas en la canulación auricular: circuito cerrado y circuito abierto. Los sistemas de circuito cerrado mantienen una presión baja y constante dentro de las aurículas, imitando las condiciones fisiológicas y facilitando mediciones precisas de gases en sangre. Un estudio de Linacr et al. ha demostrado que mantener una presión auricular específica durante la perfusión puede mejorar la función pulmonar y reducir el edema34. Sin embargo, pueden ocurrir picos de presión si el músculo auricular obstruye el circuito. Además, la atadura de la aurícula y la presencia de burbujas de aire pueden comprometer los resultados experimentales debido al posible daño de las fibras miocárdicas y las lecturas de presión inconsistentes7. Para superar estas limitaciones y lograr una perfusión efectiva en circuito cerrado, se fabricó una cánula auricular especialmente diseñada. Esta cánula cuenta con un aparato ortopédico saliente en su punta para evitar la obstrucción del músculo auricular. Además, las ranuras anulares a lo largo del cuerpo de la cánula facilitan la colocación segura de la ligadura. Además, el sistema incorpora trampas de burbujas y técnicas de preperfusión para eliminar la embolia gaseosa y mantener una presión de perfusión constante. 
Las plataformas EVLP para animales pequeños son las preferidas en la investigación científica por sus numerosos beneficios: condiciones controladas de los animales, rentabilidad, alojamiento de muestras de gran tamaño y bajo consumo de fluidos de perfusión. Además, el uso de una sola cepa de animales pequeños (por ejemplo, ratas en este estudio, pero también conejillos de indias y conejos 24,35,36) permite un control meticuloso tanto de la dieta como de los entornos experimentales. La versatilidad del sistema permite la adaptación de todas estas especies mediante el ajuste de los parámetros respiratorios y el caudal de perfusión. Los videos adjuntos detallan el modelo animal y los procedimientos EVLP, lo que proporciona a los investigadores una comprensión integral. Al seguir estos protocolos, los investigadores pueden mejorar el éxito experimental, minimizar el sufrimiento de los animales y reducir el uso general de animales.
Si bien la investigación ha establecido un sistema EVLP asequible, modular y fácil de usar para animales pequeños que supera las opciones comerciales en estabilidad, calidad de perfusión y capacidad de ajuste, se necesita más investigación para optimizar los protocolos de EVLP, incluidos los parámetros de perfusión y ventilación, e identificar los medicamentos protectores pulmonares más efectivos. Esta tecnología fácil de usar y eficiente ha permitido realizar pruebas exitosas en muchos pulmones de donantes aprovechando la infraestructura. Los esfuerzos de investigación actuales se centran en la restauración y conservación de los pulmones de los donantes.

El trasplante de pulmón (LTx) sigue siendo el único tratamiento definitivo para los pacientes con enfermedad pulmonar terminal. El éxito del trasplante pulmonar depende de la disponibilidad de pulmones de donantes de alta calidad con una función adecuada. Sin embargo, ha surgido una creciente lista de espera para trasplantes de pulmón en todo el mundo debido a una escasez crítica de pulmones de donantes1. Muchos pacientes en la lista de espera experimentan un deterioro de la salud o incluso la muerte mientras esperan un pulmón de donante adecuado dentro de un período de tiempo razonable2. Por lo tanto, es crucial ampliar el grupo de posibles injertos para satisfacer las necesidades de los pacientes en lista de espera de trasplantes. La donación después de la muerte cardiocirculatoria (DCD)1,3 y la perfusión pulmonar ex vivo (EVLP)4,5 son dos estrategias prometedoras para aumentar el número de pulmones disponibles para trasplante. Actualmente, la donación después de la muerte encefálica (DBD)6 es la principal fuente de trasplantes de pulmón. Sin embargo, debido a la actual escasez de injertos, la DCD está ganando terreno. Este cambio se debe a las limitaciones de los injertos DBD, donde los cambios en el flujo sanguíneo, la ventilación mecánica, la infección y la aspiración pueden comprometer la calidad del injerto. La calidad del injerto tiene un impacto directo en los resultados del paciente y la supervivencia a largo plazo después del trasplante. El proceso de perfusión pulmonar ex vivo (EVLP, por sus siglas en inglés) aumentó efectivamente el número de trasplantes de pulmón disponibles al reevaluar los injertos de pulmón de donantes después de la muerte cardíaca (DCD), lo que resultó en resultados similares tanto a corto como a largo plazo7,8. El objetivo de este estudio fue desarrollar un sistema de perfusión pulmonar extracorpórea en ratas con pulmones cíclicamente muertos y evaluar con precisión a los donantes de DCD. Para disminuir la probabilidad de disfunción primaria del injerto (DGP), el daño a los donantes de DCD9 puede minimizarse mediante el uso de diagnóstico molecular10 y empleando tratamientos dirigidos especializados.
EVLP es una técnica que replica el entorno natural de los pulmones fuera del cuerpo, manteniendo una temperatura fisiológica normal. Permite la monitorización y evaluación continua de los pulmones11,12, extiende el tiempo de conservación de los trasplantes13, y utiliza perfusión externa, ventilación y medicamentos para mejorar la calidad de los pulmones marginales, haciéndolos adecuados para el trasplante14. El primer uso exitoso de pulmones de donantes marginales para el trasplante de pulmón utilizando EVLP fue reportado por Steen et al. en 200715. Desde entonces, el uso de la tecnología EVLP se ha integrado gradualmente en la práctica clínica16,17. Posteriormente, el equipo de Toronto adaptó el enfoque de EVLP mediante el uso de ventilación de bajo volumen corriente y bajos caudales junto con la estrategia de protección pulmonar ideal de una bomba centrífuga; Esto resultó en una perfusión constante durante una duración de 12 h18.
EVLP ofrece varios beneficios, incluyendo la reducción del riesgo de fracaso primario del injerto, la minimización del edema pulmonar, la mitigación de la inflamación relacionada con la muerte cerebral, la preparación del sistema inmunológico del receptor para el trasplante y la prevención de infecciones pulmonares, aspiración, embolia pulmonar y lesiones por isquemia-reperfusión14,19,20. Si bien EVLP ofrece ventajas significativas, existe la necesidad de mejorar los métodos para mejorar la calidad del injerto.
Actualmente, no hay consenso sobre los ajustes específicos para la perfusión y la ventilación en la plataforma EVLP de ratas. Ohsumi et al.21 idearon un nuevo modelo para estudiar cómo los pulmones de donantes que fueron sometidos a largos períodos de isquemia fría (CIT) podrían mantener su función pulmonar durante el proceso de perfusión pulmonar ex vivo (EVLP) y después de ser trasplantados. A nivel internacional, ha habido varios esfuerzos para crear modelos de perfusión pulmonar ex vivo (EVLP) en ratas22,23,24,25,26,27 para lograr una perfusión más confiable y precisa. Por lo tanto, es esencial desarrollar un sistema EVLP de animales pequeños rentable, altamente reproducible y estrictamente controlado para facilitar la investigación adicional en esta área. Los sistemas EVLP existentes para animales pequeños suelen ser caros y tienen una flexibilidad limitada en términos de modificación de las condiciones de funcionamiento para diferentes necesidades de investigación. Este artículo propone un diseño de sistema EVLP rentable y adaptable. Además, proporciona una explicación detallada de los pasos técnicos y quirúrgicos necesarios para su implementación. Empleamos un modelo que utiliza ratas fallecidas en parada circulatoria para demostrar que EVLP mejora la calidad de los pulmones DCD, aumentando así el grupo de donantes de pulmón viables para trasplantes. Nuestro objetivo es compartir nuestra experiencia exitosa para ayudar a otros investigadores a establecer una plataforma EVLP fácilmente disponible para animales pequeños después de la muerte cardiocirculatoria.

<table><tbody><tr><td>Tubo aséptico médico de 3,0 mm</td><td>Zhifang Pump industry Co., LTD, Hebei, China</td><td>3,0 mm</td><td>En la circulación de la sangre, en lugar de los vasos sanguíneos</td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina</td><td>Sigma-Aldrich Trading Co.Ltd, Shanghai, China</td><td>BSAV-RO</td><td>Mejorar la presión osmótica coloidal de la perfusión</td></tr><tr><td>BP-100/102 Transductor de presión arterial intravascular</td><td>iWorx Systems, Inc, New Hampshire, EE. UU.</td><td>BP-100/102</td><td>Registros de presión vascular pulmonar en ratas</td></tr><tr><td>Cefazolin</td><td>Beijing psaitong Biotechnology Co., Ltd, Pekín, China</td><td>PHR1291 Infección</td><td>antibacteriana</td></tr><tr><td>Desoxigenador</td><td>Dongguan Kewei Instrumento médico, Guangdong, China</td><td>Sin especificación de modelo</td><td>Reemplace la función pulmonar de la rata Intercambio de gases en la sangre</td></tr><tr><td>F500 Máquina de anestesia general para animales</td> <td>pequeñosBeijing Yi Zejia Technology Co., LTD, Pekín, China</td><td>F500</td><td>Administrar anestesia de gas para el suministro de anestesia</td></tr><tr><td>Mezcla de gases (6% O2, 8% CO2, 86% N2)</td><td>Beijing Oriental Medical Gas Co., LTD, Pekín, China</td><td>Sin especificación de modelo</td><td>Mantener el equilibrio ácido-base en la sangre, simula la fisiología vascular pulmonar</td></tr><tr><td>Intercambiador de calor</td><td>Centro de instrumentos de precisión de Changhong, Shenzhen, China</td><td>DHC-05-B</td><td>Control de temperatura en el circuito de perfusión</td></tr><tr><td>heparina</td><td>Beijing psaitong Biotechnology Co., Ltd, Pekín, China</td><td>H0200000</td><td>Anti-micro trombosis</td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>RWD Life Science Co., Ltd, Shenzhen, China</td><td>R510-22</td><td>Ratas anestesiadas</td></tr><tr><td>Cámara de aislamiento</td><td>Hecho a mano de Shanghai Leighton Industrial Co., LTD, Shanghai, China</td><td>Sin especificación de modelo</td><td>Almacenamiento de pulmones de rata</td></tr><tr><td>Analizador clínico portátil i-STAT 1 Abbott</td><td>point of care, Inc, NJ, USA</td><td>300G</td><td>El análisis de gases en sangre en perfusión</td></tr><tr><td>iWorx RA-834 Recorder</td><td>iWorx Systems, Inc, New Hampshire, USA</td><td>RA-834 Salida de señal de</td><td>presión de los vasos sanguíneos pulmonares</td></tr><tr><td>Bomba peristáltica multicanal LabMate</td><td>Zhifang Pump industry Co., LTD, Hebei, China</td><td>LabMate2</td><td>suministra energía para el proceso de circulación de perfusión</td></tr><tr><td>PERFADEX Plus</td><td>XVIVO Perfusion, Gotemburgo, Suecia</td><td>NA</td><td>El pulmón de la rata donante se sometió a un prelavado; solución baja en potasio&nbsp;</td></tr><tr><td>cánula pulmonar</td><td>De acero inoxidable Acero inoxidable</td><td>304/SUS304</td><td>2.0/2.5 mm</td></tr><tr><td>Cánula de vena pulmonar</td><td>De acero inoxidable</td><td>304 Acero inoxidable 304/SUS304</td><td>4.0mm</td></tr><tr><td>QAH-INF-1 kit de ensayo</td><td>Innopsys, Parcd'Activit&eacute; s Activestre</td><td></td><td></td></tr><tr><td>R415 Ventilador para animales pequeños</td><td>RWD Life Science Co., Ltd, Shenzhen, China</td><td>R415</td><td>La ventilación del pulmón de</td></tr><tr><td>rata Reservoir</td><td>Shanghai Leighton Industrial Co., LTD, Shanghai, China</td><td>Capacidad 1 L</td><td>Almacenamiento de perfusión</td></tr><tr><td>SOLU-MEDROL</td><td>Beijing psaitong Biotechnology Co., Ltd, Beijing, China</td><td>M0639</td><td>NA</td></tr><tr><td>Sensor de temperatura (TM-100)</td><td>iWorx Systems, Inc, New Hampshire, EE. UU.</td><td>TM-100</td><td>Temperatura récord de perfusión pulmonar</td></tr></tbody></table>

establecimiento de un nuevo sistema de perfusión pulmonar ex vivo para pulmones de rata después de la muerte circulatoria

Establishment of a Novel Ex Vivo Lung Perfusion System for Rat Lungs After Circulatory Death

La creciente escasez de pulmones de donantes para trasplantes ha estimulado un interés significativo en la utilización de órganos obtenidos de donantes después de la muerte cardíaca (DCD). Sin embargo, sigue existiendo un desafío crítico para maximizar el número de pulmones viables que cumplan con criterios estrictos para el uso clínico. La perfusión pulmonar ex vivo (EVLP, por sus siglas en inglés) surge como una tecnología prometedora para evaluar y potencialmente mejorar la función de los pulmones donados. Este artículo describe el desarrollo de una plataforma experimental de animales pequeños rentable y reproducible, diseñada específicamente para la investigación de EVLP. Esta plataforma ofrece un alto grado de personalización, lo que permite a los investigadores adaptar los parámetros experimentales para abordar preguntas de investigación específicas dentro del campo de EVLP. El equipo estableció un modelo de rata para simular la DCD e implementó un enfoque de preservación en dos etapas. Los pulmones se sometieron a almacenamiento estático en frío utilizando una solución de perfusión a 4 °C durante 4 h, seguida de EVLP normotérmico durante otras 4 h. Los investigadores evaluaron varios parámetros de la función pulmonar, incluida la resistencia vascular pulmonar, la distensibilidad dinámica pulmonar, las mediciones de gases en sangre del perfusionado y la muerte celular apoptótica en los tejidos pulmonares. El estudio demuestra que la EVLP podría mejorar significativamente el rendimiento funcional de los pulmones DCD en comparación con el almacenamiento en frío simple a 4 °C, lo que sugiere que la EVLP tiene el potencial de mitigar la lesión por isquemia-reperfusión y mejorar la función del injerto después de la muerte circulatoria, aumentando así la reserva de pulmones trasplantables.

Es necesario evaluar el número de células apoptóticas detectadas mediante tinción TUNEL, los niveles de marcadores inflamatorios (detectados en el perfusado utilizando el kit de ensayo QAH-INF-1) y el aspecto físico general (teñido con hematoxilina y eosina (H&amp;E)) de los pulmones donantes con corazón latiendo en todos los grupos, para determinar qué tan bien EVLP preservó los pulmones donantes DCD. Todos los pulmones donantes DCD fueron sometidos a 4 h de perfusión. La mayoría de los pulmones mostraron una complianza estable, con una disminución gradual observada durante el período de 4 h (Figura 5B). No se encontraron diferencias significativas en la resistencia vascular ni en los niveles de oxigenación del injerto pulmonar entre los pulmones donantes DCD (Figura 5A,C). Los niveles de glucosa en el perfusado disminuyeron con el tiempo, sin observarse diferencias significativas entre ratas individuales (Figura 5D). Los niveles de electrolitos en el perfusado se mantuvieron similares entre los grupos (Figura 5E-F).
La tinción TUNEL se realizó utilizando la técnica de etiquetado de extremos rotos con desoxinucleotidil transferasa terminal dUTP, con el kit de detección de apoptosis, siguiendo las instrucciones del fabricante para la detección nuclear de apoptosis. La tinción TUNEL se empleó para cuantificar la apoptosis (muerte celular programada) de las células epiteliales alveolares en pulmones donantes de DCD bajo diferentes condiciones de preservación. Un análisis ciego del número de células apoptóticas reveló un número significativamente mayor de células positivas en el grupo donante en comparación con los otros grupos. Además, el grupo de preservación en frío presentó un mayor número de células positivas en comparación con los pulmones donantes de DCD perfundidos con EVLP (Figura 6). Se utilizaron cinco variables independientes para puntuar las secciones histopatológicas teñidas con H&amp;E: 1) influxo de células inflamatorias en el espacio alveolar, 2) engrosamiento del septo alveolar, 3) hemorragia intra y extraalveolar, 4) edema intraalveolar y 5) formación de membranas hialinas. Las variables se puntuaron de 0 a 4: 0 = negativo, 1 = leve, 2 = moderado, 3 = alto y 4 = severo. La suma de las variables puntuadas generó las puntuaciones totales de lesión pulmonar. La puntuación de lesión pulmonar es significativamente menor en el grupo EVLP que en el grupo de preservación estática en frío y en el grupo control (Figura 7A). Se puede observar engrosamiento de la pared alveolar y hemorragia alveolar en el grupo de preservación estática en frío de 4 h (Figura 7B). La estructura alveolar normal se mantiene en el grupo EVLP (Figura 7C).
<img alt="Configuración de la circulación extracorpórea, oxigenación con membrana, diagrama esquemático, método experimental." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67168/67168fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 1"> 
Figura 1: Diagrama y fotografía del circuito de perfusión pulmonar ex vivo (EVLP) para pequeños animales. Las letras del diagrama coinciden con las de la fotografía para describir la función de cada componente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67168/67168fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Componentes del sistema de cromatografía; diagrama de conectores metálicos, accesorios y tubos." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67168/67168fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figura 2"> 
Figura 2: Cánulas hechas a medida. (A) Cánula de la arteria pulmonar. (B) Cánula traqueal. (C) Cánula del atrio izquierdo. (D) Un conjunto de cánulas para perfusión pulmonar ex vivo en ratas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67168/67168fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Diagrama del procedimiento quirúrgico en roedores que muestra los pasos de la disección cardiovascular y la exposición de órganos." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67168/67168fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 3"> 
Figura 3: Aislamiento de pulmón de rata. (A) La cánula traqueal se coloca en posición y se asegura con una sutura de seda. (B) Se canula la arteria pulmonar y se ata con la sutura de seda previamente colocada. (C) La cánula en la aurícula izquierda se asegura con una sutura de seda. (D) Se realiza una disección roma del tejido conectivo para extraer el bloque corazón-pulmón. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67168/67168fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Configuración del experimento de perfusión de órganos; A: conexiones de tubos, B: órgano en cámara de preservación para investigación." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67168/67168fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 4"> 
Figura 4: Configuración de perfusión pulmonar en ratas. (A) El bloque corazón-pulmón se coloca en el circuito de perfusión pulmonar ex vivo. (B) Un pulmón que ventila y perfunde adecuadamente conectado al circuito EVLP. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67168/67168fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Gráficos de parámetros fisiológicos a lo largo del tiempo: PaO2/FiO2, CDyn, PVR, Glucosa, Sodio, Potasio." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67168/67168fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 5"> 
Figura 5: Función pulmonar durante el protocolo de EVLP en ratas. (A-F) Función pulmonar y análisis de gases en sangre de pulmones donantes sometidos a EVLP tras una exposición de 1 h a tiempo de isquemia cálida (WIT). (A) Índice de oxigenación pulmonar. (B) Complianza pulmonar dinámica (Cdyn). (C) Resistencia vascular pulmonar (PVR). (D) Nivel de glucosa en la perfusión a las 4 h después de EVLP. (E) Nivel de sodio en la perfusión a las 4 h después de EVLP. (F) Nivel de potasio en la perfusión a las 4 h después de EVLP. Las barras de error indican la desviación estándar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67168/67168fig05large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Diagrama del ensayo TUNEL con tinción DAPI, comparando las condiciones DCD, DCD+COLD, DCD+EVLP." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67168/67168fig06.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 6"> 
Figura 6: Imágenes representativas del ensayo TUNEL en diferentes casos. Células TUNEL-positivas: la fluorescencia verde muestra células apoptóticas; DAPI: la fluorescencia azul representa el núcleo; Fusión (Merge): todas las células, incluidas aquellas que están experimentando muerte celular programada (apoptosis); DCD se refiere al grupo con recolección directa del pulmón. DCD+COLD se refiere al grupo con preservación estática en frío durante 4 h. DCD+EVLP se refiere al grupo con perfusión pulmonar ex vivo (EVLP) durante 4 h. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67168/67168fig06large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.</a>
<img alt="Gráfico de barras del puntaje de lesión pulmonar y análisis histológico del tejido pulmonar, representación de resultados experimentales." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67168/67168fig07.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 7"> 
Figura 7: Puntaje de lesión pulmonar y hallazgos histológicos. (A) El puntaje de lesión pulmonar en el grupo control, SCS y grupo EVLP (*, p &lt;0.05). (B) Cortes representativos teñidos con hematoxilina y eosina (H&amp;E) de donantes con preservación estática en frío (SCS). La flecha negra indica ruptura del epitelio capilar pulmonar, y las flechas azules indican engrosamiento de las paredes alveolares. (C) Cortes representativos teñidos con H&amp;E de donantes EVLP. La flecha roja indica infiltración de células inflamatorias. (D) Cortes representativos teñidos con H&amp;E de donantes con recolección directa (control). Las flechas negras indican ruptura y hemorragia del epitelio capilar pulmonar. Las barras de error indican desviación estándar; el análisis de significancia se realizó mediante análisis de varianza unidireccional (ANOVA). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67168/67168fig07large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

El objetivo es desarrollar un nuevo modelo de perfusión pulmonar ex vivo (EVLP) en ratas que pueda mantener una función pulmonar constante durante 4 h durante todo el EVLP y proporcionar a la industria detalles de implementación que ofrecerán un método robusto para aplicar EVLP a modelos de roedores.

Establecimiento de un nuevo sistema de perfusión pulmonar ex vivo para pulmones de rata después de la muerte circulatoria

The increasing scarcity of donor lungs for transplantation has spurred significant interest in the utilization of organs procured from donors after ...

establishment-novel-ex-vivo-lung-perfusion-system-for-rat-lungs-after

Research

Investigación

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Este video muestra una técnica ex vivo para la perfusión pulmonar aislada. Se trata de una herramienta para la investigación pulmonar que ayudará a los estudios de diversos mecanismos fisiológicos y patológicos implicados en los procedimientos de trasplante pulmonar.

Perfusión pulmonar ex vivo: una técnica para la investigación pulmonar en un modelo de conejo

Ex-Vivo perfusión pulmonar (EVLP) ha permitido el trasplante de pulmón en los seres humanos para ser más fácilmente disponible, permitiendo la capacidad de evaluar los órganos y ampliar el grupo de donantes. Aquí se describe el desarrollo de un programa EVLP rata y mejoras que permitan un modelo reproducible para una futura expansión.

Método de aislados<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Perfusión pulmonar en un modelo de rata: Lecciones Aprendidas de Desarrollo de un Programa EVLP Rata

La preparación aislada del pulmón de conejo es una herramienta estándar de oro en la investigación pulmonar. Esta publicación tiene como objetivo describir la técnica desarrollada para el estudio de los mecanismos fisiológicos y patológicos involucrados en la reactividad de las vías respiratorias, la preservación pulmonar y la investigación preclínica en trasplante pulmonar y edema pulmonar.

Sistema de perfusión pulmonar aislada en el modelo de conejo

Los pulmones ex vivo son útiles para una variedad de experimentos para recopilar datos fisiológicos y excluir las variables de confusión de los experimentos in vivo . Las configuraciones comerciales suelen ser caras y limitadas en cuanto a los tipos de datos que pueden recopilar. Describimos un método para construir una configuración totalmente modular, adaptable a varios diseños de estudio.

Diseño e implementación de un modelo de perfusión pulmonar ex vivo en ratas

Aquí, describimos los pasos necesarios para establecer un modelo de EVLP en ratas y mostramos el perfil inflamatorio asociado con los pulmones perfundidos. El objetivo es propagar el conocimiento y las experiencias sobre el modelo EVLP de ratas, permitiendo la comprensión integral de las respuestas biológicas asociadas a esta revolucionaria técnica.

Establecimiento de un modelo de rata de perfusión pulmonar ex vivo para obtener información traslacional en el trasplante de pulmón

Este protocolo presenta un modelo de perfusión pulmonar ex-vivo en ratas que incorpora una exposición transitoria a un estrés térmico calibrado, promoviendo mecanismos protectores endógenos para el reacondicionamiento terapéutico de injertos pulmonares dañados. El enfoque es escalable y reproducible y apoya el desarrollo de terapias no farmacológicas para mejorar el éxito del trasplante de pulmón.

Preacondicionamiento térmico durante la perfusión pulmonar ex vivo para la rehabilitación de injertos pulmonares dañados antes del trasplante

Los mecanismos que conducen al desarrollo de hiperplasia de la íntima (IH) y la insuficiencia injerto de vena son aún poco conocidos. Este estudio describe un sistema ex vivo para perfundir venas humanos bajo flujo y presión controladas. Además, la eficiencia de refuerzo de malla externa para limitar el desarrollo de la IH se evaluó.

Procedimiento para safena humana Venas Ex Vivo Perfusión y refuerzo externo

Hay una escasez de donantes de hígado significativa, y se han ampliado los criterios de los donantes de hígado. Perfusión normotérmica ex vivo hígado (NEVLP) ha sido desarrollada para evaluar y modificar la función del órgano. Este estudio muestra un modelo de rata de NEVLP y pone a prueba la capacidad de pegilado-catalasa, para mitigar la lesión hepática de preservación.

Un pequeño modelo de la perfusión hepática normotérmica Ex Vivo

Este protocolo muestra un enfoque simple y flexible para la evaluación de nuevos agentes acondicionadores o estrategias para aumentar la viabilidad de la donación cardíaca después de la muerte circulatoria.

Modelo preclínico de donación cardíaca después de la muerte circulatoria

Aquí, presentamos optimizaciones para un modelo de trasplante de pulmón de rata que sirven para mejorar los resultados. Proporcionamos una guía de tamaño para los puños basada en el peso corporal, una estrategia de medición para determinar el4º espacio intercostal y métodos de cierre de heridas y recolección de líquido y tejido BAL (lavado broncoalveolar).

Un modelo de trasplante de pulmón de rata de lesión por isquemia/reperfusión caliente: optimizaciones para mejorar los resultados

Aprenda a establecer un modelo de perfusión pulmonar ex vivo en ratas tras muerte circulatoria. Este sistema mantiene la función pulmonar durante 4 horas y ofrece una plataforma reproducible para investigar la calidad de pulmones donantes.

Establecimiento de un nuevo sistema de perfusión pulmonar ex vivo para pulmones de rata después de la muerte circulatoria

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