Cuantificación de leucocitos adherentes inducidos por diabetes en la vasculatura de la retina

El enfoque de la investigación en nuestro laboratorio es aprender qué causa la retinopatía en la diabetes y cómo se puede prevenir. Varios laboratorios han demostrado que la leucostasis, la sobreacumulación de glóbulos blancos, en los pequeños vasos del ojo está aumentando la diabetes. Y esto podría contribuir a la oclusión y degeneración de los vasos de la retina en la diabetes. Esta técnica permite visualizar y cuantificar la gravedad de la leucostasis en la vasculatura retiniana. Y se puede utilizar en los estudios que quieran evaluar la eficacia de diferentes terapias, incluidos los fármacos.

[Instructor] Para configurar el infusor de presión, conecte en serie la bolsa de solución salina al 0,9%. el juego de catéteres intravenosos, una válvula de llave de paso de cuatro vías y la aguja de sonda. Abra el sistema de perfusión y enjuague las líneas y los puertos con solución salina durante dos minutos a un caudal de 18 a 20 mililitros por minuto para eliminar las burbujas de aire. Coloque el ratón anestesiado en posición supina en la etapa de perfusión. Identificar visualmente el proceso xifoides. Con el hemostático en la mano dominante, asegure y bloquee la piel. Luego transfiera el hemostático a la mano no dominante y levante la piel. Luego, con unas tijeras, corte un parche de piel en un ángulo de 90 grados con respecto a la columna vertebral para exponer la pared abdominal externa. Con el proceso xifoides y la caja torácica visibles, diseccione bilateralmente a través de la pared abdominal, evitando cuidadosamente cualquier órgano o vaso principal. Ahora, visualice los ventrículos cardíacos y los pulmones a través del diafragma. Con la punta de la tijera, haga una incisión en el diafragma de un lado cerca de la columna vertebral. Exponga el corazón en la cavidad torácica después de dividir el esternón. Con fórceps en la mano no dominante, agarre el corazón cerca de su vértice. Con la mano dominante, sostenga la aguja de sonda unida al catéter intravenoso y perfore el vértice del corazón. Asegúrese de que la punta esférica de la aguja de sonda sobresalga ligeramente del sitio de punción para evitar perforar completamente el ventrículo izquierdo o ingresar a la vasculatura pulmonar. A continuación, abra la llave de paso para permitir el flujo de solución salina al 0,9%. Al mismo tiempo, use tijeras para abrir la aurícula derecha. Continúe la perfusión durante dos o tres minutos, moviendo la aguja suavemente de lado a lado y hacia arriba y hacia abajo para evitar que la vasculatura se doble y aumente el drenaje de sangre del corazón. Después de la perfusión, gire la manija de la llave de paso para cerrar el flujo salino y permitir que fluya desde la jeringa hasta la aguja de sonda. Luego perfunda manualmente 10 mililitros de solución de concanavalina A dentro de 30 a 35 segundos. Después de perfundir el corazón de un ratón anestesiado con una solución de concanavalina A, gire el ratón de lado. Coloque el dedo índice de la mano no dominante en el párpado superior y el pulgar en el párpado inferior. Retraiga suavemente los párpados y la piel circundante para proptoizar el ojo, permitiendo que sobresalga parcialmente de la cuenca. Luego, usando las tijeras curvas en la mano dominante, saque debajo del ojo en un ángulo de 45 grados. Cortar las inserciones musculares y el nervio óptico. Usando las tijeras como espátula, transfiera el ojo a un recipiente pequeño. Coloque el ojo sobre cera dental para prepararse para la apertura del globo. Bajo el microscopio de disección, usando micropinzas, sostenga el pliegue escleral o los restos musculares adheridos a la parte posterior del ojo y oriente el ojo de modo que la córnea mire hacia un lado. Haga una incisión detrás y paralela al limbo. Use microtijeras para separar el segmento anterior del ojo, incluida la lente alrededor del perímetro de la copa ocular, asegurándose de que la retina esté completamente separada de la esclerótica. Saque la retina de la esclerótica con la microespátula. Si la retina todavía está unida por el nervio óptico, inserte microtijeras entre la retina y la esclerótica para cortar el nervio óptico. Coloque la retina no fijada en un portaobjetos con una gota de PBS. Haga de cuatro a cinco cortes radiales en la retina, creando un patrón de hoja de trébol para que quede plana. Observe la retina montada en plano bajo el microscopio con un aumento de 100x utilizando un objetivo de 10x. La microscopía fluorescente de la vasculatura retiniana mostró que las retinas diabéticas mostraban leucástasis leve con típicamente de 3 a 12 leucocitos por retina en comparación con 1 a 3 en los controles no diabéticos. Se observaron grupos significativos de leucocitos en modelos inflamatorios desafiados con lipopolisacáridos en contraste con la agrupación leve en muestras diabéticas.