Name: Aislamiento y caracterización de exosomas derivados de tejidos de bazo de ratón (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-20T14:10:00.000+00:00
Duration: 5 min 27 s
Description: Aprenda a aislar exosomas de bazo de ratón mediante digestión con colagenasa tipo I y ultracentrifugación diferencial. Este protocolo preserva la integridad de la membrana celular y permite estudios funcionales en enfermedades cardiovasculares.

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Las muestras se obtuvieron de ratones, con la aprobación ética otorgada por el Comité de Ética de la Universidad Médica de Guangdong. Las descripciones detalladas de los materiales, equipos y software utilizados en este protocolo se proporcionan en la Tabla de Materiales. Los detalles de la preparación previa a la extracción se ilustran en la Figura 1, mientras que el proceso de extracción y enriquecimiento de Spleen-Exo se describe en la Figura 2.
1. Preparación
<ol>
	<li>Enfríe previamente las centrífugas de alta velocidad y ultra alta velocidad a 4 °C y ajuste la temperatura de un agitador de escritorio a 37 °C.</li>
	<li>Prepare placas de cultivo celular (<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/67234/67234eq01.jpg" style="margin: auto;">100 mm), tubos de centrífuga estériles de 50 mL, hielo y colador de células estériles (<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/67234/67234eq01.jpg" style="margin: auto;">70 μm) como se muestra en la Figura 1A, B.</li>
	<li>Esterilice las tijeras y las pinzas con alcohol en aerosol al 75 %, seguido de una esterilización a alta temperatura. Estas herramientas se muestran en la Figura 1C.</li>
	<li>Coloque el tejido del bazo en una placa de Petri estéril <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/67234/67234eq01.jpg" style="margin: auto;">de 100 mm sobre hielo y lave la sangre de la superficie con 1 solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS) helada. Seque los tejidos del bazo con una gasa estéril y péselos después del secado. NOTA: Si el pañuelo está congelado, descongélelo en un plato durante 15 minutos sobre hielo antes de continuar.</li>
	<li>Hidrate el filtro de células (<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/67234/67234eq01.jpg" style="margin: auto;">70 μm) dejando caer 1 mL de PBS estéril en el filtro con una pipeta de transferencia estéril.</li>
	<li>Prepare el tampón digestivo (0,1% de colagenasa tipo I) utilizando 1x PBS con un mezclador de vórtice. NOTA: Use 10 mL de tampón digestivo por cada 100 mg de tejido del bazo. La concentración de colagenasa se eligió en este estudio con base en las instrucciones del producto. Para otros tipos de tejido, es posible que los investigadores deban ajustar estos parámetros en función de la densidad y la composición del tejido. Se recomiendan experimentos preliminares con diferentes concentraciones y tiempos de digestión para determinar las condiciones óptimas para cada tipo de tejido.</li>
</ol>
2. Digestión de tejidos
<ol>
	<li>Picar el tejido en trozos pequeños uniformes con unas tijeras en una placa de cultivo con hielo (Figura 3A) y transferirlo a un tubo de centrífuga de 50 ml con una pipeta de transferencia estéril.</li>
	<li>Agregue tampón de digestión al tubo de acuerdo con el peso del tejido del bazo como se indicó anteriormente (Figura 3B), luego agite el tubo con un ángulo de 45° en un agitador horizontal a 37 °C. Controle el progreso de la digestión y detenga la digestión cuando los trozos de tejido se hayan dispersado y la mayoría hayan perdido su forma. El tiempo de digestión debe variar entre tejidos. En las condiciones experimentales de este estudio, el tiempo de digestión es de aproximadamente 30 min.</li>
	<li>Transfiera la mezcla digerida a un colador de células (Ф70 μm) a temperatura ambiente (RT) para eliminar los restos de tejido fibroso y más grandes. NOTA: Filtración completa inmediatamente después de la digestión.</li>
	<li>Recoja el filtrado en un nuevo tubo de centrífuga de 50 mL.</li>
</ol>
3. Aislamiento de exosomas por centrifugación diferencial
<ol>
	<li>La centrífuga filtra a 500 x g durante 10 min a 4 °C. Se puede ver un pellet que contiene células residuales, restos celulares y núcleos después de la centrifugación, como se muestra en la Figura 3C.</li>
	<li>Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo y centrifugue a 3000 x g durante 20 min a 4 °C. Se puede ver un pellet que contiene cuerpos apoptóticos y microsomas después de la centrifugación, como se muestra en la Figura 3D.</li>
	<li>Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo y centrifuga a 10.000 x g durante 30 min a 4 °C. Los gránulos que contienen microvesículas y membrana plasmática se pueden ver después de la centrifugación, como se muestra en la Figura 3E.</li>
	<li>Ultracentrífuga el sobrenadante resultante a 120.000 x g durante 2 h a 4 °C. Se puede ver un pellet en la parte inferior del tubo después de la centrifugación, como se muestra en la Figura 3F.</li>
	<li>Deseche el sobrenadante, lave el pellet con PBS y vuelva a ultracentrífugar a 120.000 x g durante 2 h a 4 °C para obtener exosomas. Se puede ver un pellet en el fondo del tubo después de la centrifugación, como se muestra en la Figura 3G.</li>
	<li>Disuelva los exosomas aislados con PBS estéril (200 μL por bazo) y almacene los exosomas aislados en un nuevo tubo de centrífuga de 2 mL a -80 °C.</li>
</ol>
4. Caracterización de exosomas por microscopía electrónica de transmisión (TEM)
NOTA: Se utilizó TEM para determinar si el Exo extraído mostraba características vesículas. Las muestras Exo identificadas por microscopía electrónica deben ser muestras frescas o almacenadas brevemente a 4 °C durante un breve período de tiempo.
<ol>
	<li>Fije los exosomas (2-6 μg/μL) con paraformaldehído de grado de microscopía electrónica (EM) al 2% en RT durante 2 h.</li>
	<li>Coloque 10 μL de solución de exosomas en una malla de cobre, incube a RT durante 10 minutos, enjuague con agua destilada estéril y seque el exceso de líquido con papel absorbente.</li>
	<li>Tiñe la malla de cobre con acetato de uranilo al 2% durante 1 min, seca el exceso de líquido con papel de filtro y seca bajo una lámpara incandescente durante 2 min.</li>
	<li>Observar la muestra preparada bajo un microscopio electrónico de transmisión a 80 kV.</li>
</ol>
5. Distribución de tamaño y medición de la concentración de partículas de exosomas
<ol>
	<li>Cargue las nanopartículas de poliestireno estándar (250 nm) en el citómetro de nanoflujo.</li>
	<li>Mida la concentración de proteínas de las muestras Exo utilizando un kit de ensayo de proteínas BCA. Diluya la muestra Exo con PBS de acuerdo con los resultados del ensayo de proteínas BCA (diluya los exosomas a 1-10 ng/μL), luego cargue las muestras Exo en el nanoflujo para medir la intensidad de dispersión lateral (SSI).</li>
	<li>Calcule la concentración de Exo de acuerdo con la relación entre SSI y concentración de partículas en las nanopartículas de poliestireno estándar. NOTA: Para la medición del tamaño, se genera una curva estándar cargando nanopartículas de sílice estándar con tamaños de gradiente (68 nm, 91 nm, 113 nm, 155 nm) en el citómetro de nanoflujo. La carga de la muestra Exo sigue a esto. La distribución de tamaños de Exo se calculó de acuerdo con la cura estándar.</li>
</ol>
6. Confirmación de lisis e inmunotransferencia de proteínas exosomas
<ol>
	<li>Añada 100 μL de tampón de lisis del ensayo de radioinmunoprecipitación (RIPA) al gránulo de exosomas para el análisis de proteínas.</li>
	<li>Vórtice vigorosamente, cúbralo con parafilm, muévase durante 20 minutos en RT, luego vuelva a vórtice.</li>
	<li>Centrifugar brevemente a 1000 x g durante 30-60 s para recoger la muestra, transferir a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 mL y almacenar a -20 °C a -80 °C hasta el análisis.</li>
	<li>Para el inmunoblot, mezcle las muestras con un tampón de carga 5x para lograr una concentración 1x y prepárese para la electroforesis en gel.</li>
	<li>Si se desean controles de homogeneización de tejido completo, utilice un tampón de lisis fuerte con un inhibidor de la proteasa para lisar el tejido, como se detalló anteriormente. A continuación, centrifugar las muestras a 10.000 x g durante 10 minutos y desechar el resto de la matriz extracelular, las células enteras o los restos celulares intactos.</li>
	<li>Hervir el tampón de muestra que contiene exosomas u homogeneizado de tejidos a 95 °C durante 5-10 min. Cargue la misma proteína por carril en un gel SDS-PAGE al 10%. La carga es igual a la proteína del homogeneizado del tejido como control.</li>
	<li>Proceda con la electroforesis en gel a una tensión de 80 V durante aproximadamente 2 h utilizando el tampón de electroforesis convencional. Realice el análisis de Western blot para confirmar la expresión de la proteína Exo en los lisados purificados y comparar la abundancia relativa de Exo en fracciones.</li>
</ol>

<meta charset="utf8"></head><body>Técnicas de refinamiento para el aislamiento de exosomas derivados del bazo murino

<ol><li>Meldolesi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+and+Ectosomes+in+Intercellular+Communication%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Exosomes and Ectosomes in Intercellular Communication.</a> Curr Biol. 28 (8), R435-R444 (2018).</li>
<li>Costa-Silva, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+cancer+exosomes+initiate+pre-metastatic+niche+formation+in+the+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Pancreatic cancer exosomes initiate pre-metastatic niche formation in the liver.</a> Nat Cell Biol. 17 (6), 816-826 (2015).</li>
<li>Crescitelli, R., Lasser, C., Lotvall, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+extracellular+vesicle+subpopulations+from+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of extracellular vesicle subpopulations from tissues.</a> Nat Protoc. 16 (3), 1548-1580 (2021).</li>
<li>de Jong, B., Barros, E. R., Hoenderop, J. G. J., Rigalli, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+extracellular+vesicles+as+drug+delivery+systems+and+their+potential+in+precision+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Recent advances in extracellular vesicles as drug delivery systems and their potential in precision medicine.</a> Pharmaceutics. 12 (11), 1006(2020).</li>
<li>Crescitelli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subpopulations+of+extracellular+vesicles+from+human+metastatic+melanoma+tissue+identified+by+quantitative+proteomics+after+optimized+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Extracell+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Subpopulations of extracellular vesicles from human metastatic melanoma tissue identified by quantitative proteomics after optimized isolation.</a> J Extracell Vesicles. 9 (1), 1722433(2020).</li>
<li>Jensen, C., Teng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+it+time+to+start+transitioning+from+2D+to+3D+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Mol+Biosci%22%5BJournal%5D)">Is it time to start transitioning from 2D to 3D cell culture.</a> Front Mol Biosci. 7, 33(2020).</li>
<li>Leung, L. L., Riaz, M. K., Qu, X., Chan, J., Meehan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profiling+of+extracellular+vesicles+in+oral+cancer%2C+from+transcriptomics+to+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cancer+Biol%22%5BJournal%5D)">Profiling of extracellular vesicles in oral cancer, from transcriptomics to proteomics.</a> Semin Cancer Biol. 74, 3-23 (2021).</li>
<li>Shah, R., Patel, T., Freedman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+extracellular+vesicles+in+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Circulating extracellular vesicles in human disease.</a> N Engl J Med. 379 (10), 958-966 (2018).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+enrichment+method+for+small+extracellular+vesicles+derived+from+liver+cancer+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">An enrichment method for small extracellular vesicles derived from liver cancer tissue.</a> J Vis Exp. (192), e64499(2023).</li>
<li>Vella, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rigorous+method+to+enrich+for+exosomes+from+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Extracell+Vesicles%22%5BJournal%5D)">A rigorous method to enrich for exosomes from brain tissue.</a> J Extracell Vesicles. 6 (1), 1348885(2017).</li>
<li>Hoshino, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicle+and+particle+biomarkers+define+multiple+human+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicle and particle biomarkers define multiple human cancers.</a> Cell. 182 (4), 1044-1061.e18 (2020).</li>
<li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yiwei+decoction+promotes+apoptosis+of+gastric+cancer+cells+through+spleen-derived+exosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Yiwei decoction promotes apoptosis of gastric cancer cells through spleen-derived exosomes.</a> Front Pharmacol. 14, 1144955(2023).</li>
<li>Useckaite, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+profiling+of+paired+human+liver+homogenate+and+tissue-derived+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Proteomic profiling of paired human liver homogenate and tissue-derived extracellular vesicles.</a> Proteomics. 24 (11), e2300025(2023).</li>
<li>Hurwitz, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+method+for+enrichment+of+whole+brain-derived+extracellular+vesicles+reveals+insight+into+neurodegenerative+processes+in+a+mouse+model+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">An optimized method for enrichment of whole brain-derived extracellular vesicles reveals insight into neurodegenerative processes in a mouse model of Alzheimer's disease.</a> J Neurosci Methods. 307, 210-220 (2018).</li>
<li>Lai, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosome+processing+and+characterization+approaches+for+research+and+technology+development%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Sci+%28Weinh%29%22%5BJournal%5D)">Exosome processing and characterization approaches for research and technology development.</a> Adv Sci (Weinh). 9 (15), e2103222(2022).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosome%3A+A+review+of+its+classification%2C+isolation+techniques%2C+storage%2C+diagnostic+and+targeted+therapy+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Exosome: A review of its classification, isolation techniques, storage, diagnostic and targeted therapy applications.</a> Int J Nanomedicine. 15, 6917-6934 (2020).</li>
<li>Roh, Y. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+tissue-derived+exosomes+alleviate+particulate+matter-induced+inflammatory+response+and+skin+barrier+damage+in+atopic+dermatitis-like+triple-cell+model%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Adipose tissue-derived exosomes alleviate particulate matter-induced inflammatory response and skin barrier damage in atopic dermatitis-like triple-cell model.</a> PLoS One. 19 (1), e0292050(2024).</li>
<li>Gallart-Palau, X., Serra, A., Sze, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enrichment+of+extracellular+vesicles+from+tissues+of+the+central+nervous+system+by+PROSPR%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Neurodegener%22%5BJournal%5D)">Enrichment of extracellular vesicles from tissues of the central nervous system by PROSPR.</a> Mol Neurodegener. 11 (1), 41(2016).</li>
<li>Kurian, T. K., Banik, S., Gopal, D., Chakrabarti, S., Mazumder, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elucidating+methods+for+isolation+and+quantification+of+exosomes%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Elucidating methods for isolation and quantification of exosomes: A review.</a> Mol Biotechnol. 63 (4), 249-266 (2021).</li>
<li>Menu, E., Vanderkerken, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+in+multiple+myeloma%3A+from+bench+to+bedside%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Exosomes in multiple myeloma: from bench to bedside.</a> Blood. 140 (23), 2429-2442 (2022).</li>
<li>Shen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+lysate%2Ftissue+storage+at+-80+degrees+C+on+subsequently+extracted+EVs+of+epithelial+ovarian+cancer+tissue+origins%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">Effects of lysate/tissue storage at -80 degrees C on subsequently extracted EVs of epithelial ovarian cancer tissue origins.</a> iScience. 26 (4), 106521(2023).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>70 y micro; m Filtro de células</td><td>Biologix Group Co., Ltd.USA</td><td>15-1070</td><td></td></tr><tr><td>Anti CD9 anticuerpo</td><td>Cell Signaling Technology, Inc (CST), EE. UU.</td><td>983275</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo GM130</td><td>Proteintech Group, Inc.China&nbsp;</td><td>66662-1-lg</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo anti TSG101</td><td>Abcam Plc, Reino Unido</td><td>125011</td><td></td></tr><tr><td>Placa de cultivo celular</td><td>Wuxi NEST Biotechnology Co., Ltd, China</td><td>704001</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de centrífuga</td><td>Wuxi NEST Biotechnology Co., Ltd, China</td><td>788211</td><td></td></tr><tr><td>Colagenasa Tipo I</td><td>Sigma-Aldrich Corp., EE. UU.</td><td>C2674</td><td></td></tr><tr><td>Agitador</td> <td>termostático de escritorioShanghai bluepard instruments Co., Ltd., China</td><td>THZ-100</td><td></td></tr><tr><td>Tampón de electroforesis</td><td>Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd., China &nbsp;</td><td>G2081-1L</td><td></td></tr><tr><td>Kit de ensayo de proteína BCA mejorado</td><td>Shanghai Beyotime Biotechnology Co., Ltd., China &nbsp;</td><td>P0010S</td><td></td></tr><tr><td>Flow NanoAnalyzer</td><td>NanoFCM Inc., China</td><td>N30E</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de imágenes de fluorescencia/quimioluminiscencia&nbsp;</td><td>Guangzhou Biolight Biotechnology Co., Ltd., China</td><td>GelView 6000Plus</td><td></td></tr><tr><td>HRP Cabra anti-ratón IgG</td><td>Proteintech Group, Inc.China &nbsp;</td><td>15014</td><td></td></tr><tr><td>HRP Cabra anti-Conejo IgG</td><td>Proteintech Group, Inc.China&nbsp;</td><td>15015</td><td></td></tr><tr><td>lector de microplacas</td><td>Molecular Devices, EE. UU.</td><td>Microtijeras CMax Plus</td><td></td></tr><tr><td>Shanghai</td><td>&nbsp; Médico&nbsp; Instrumentos (grupo)&nbsp;Co., Ltd.,China</td><td>WA1010</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas microscópicas</td><td>Shanghai&nbsp; Médico&nbsp; Instrumentos (grupo)&nbsp;Co., Ltd.,China</td><td>WA3010</td><td></td></tr><tr><td>Multifuge X1R Pro centrífuga</td><td>Thermo Fisher Scientific, EE. UU.</td><td>75009750</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras oftálmicas</td><td>Shanghai&nbsp; Médico&nbsp; Instrumentos (grupo)&nbsp;Co., Ltd.,China</td><td>Y00030</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas oftálmicas</td><td>Shanghai&nbsp; Médico&nbsp; Instrumentos (Grupo)&nbsp;Co., Ltd., China&nbsp;</td><td>JD1060</td><td></td></tr><tr><td>Optima XPN-100 Centrífuga de ultrafiltración</td><td>Beckman Coulter, EE. UU.</td><td>A94469</td><td></td></tr><tr><td>solución salina tamponada con fosfato (PBS)</td><td>Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd., China</td><td>P1003</td><td></td></tr><tr><td>Tampón de lisis RIPA (fuerte, sin inhibidores)</td><td>Shanghai Beyotime Biotechnology Co., Ltd., China &nbsp;</td><td>P0013K</td><td></td></tr><tr><td>Regla</td><td>Deli&nbsp; Fabricación&nbsp; Compañía, China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SDS-PAGE Tampón de carga de muestras, 5x</td><td>Shanghai Beyotime Biotechnology Co., Ltd., China &nbsp;</td><td>P0015</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta de transferencia</td><td>Biologix Group Co., Ltd.USA</td><td>30-0238A1</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio electrónico de transmisión</td><td>Hitachi, Japón</td><td>H-7650</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de ultracentrifugación</td><td>Beckman Coulter, EE. UU</td>. <td>355618</td><td></td></tr><tr><td>Tampón de transferencia occidental&nbsp;</td><td>Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd., China &nbsp;</td><td>G2028-1L</td><td></td></tr></tbody></table>

aislamiento y caracterización de exosomas derivados de tejidos de bazo de ratón

Isolation and Characterization of Exosomes Derived from Mouse Spleen Tissues

Aislamiento y purificación de exosomas derivados del bazo Para aislar los exosomas del tejido del bazo de ratón, empleamos una combinación de digestión de colagenasa y ultracentrifugación diferencial (Figura 2). Los pasos iniciales consistieron en el tratamiento previo del tejido del bazo para eliminar la sangre de la superficie, seguido de la digestión con colagenasa tipo I. Este tratamiento enzimático facilitó la descomposición de los componentes de la matriz extracelular, liberando así los exosomas y preservando su integridad. Después de la digestión, se emplearon una serie de pasos de centrifugación para eliminar secuencialmente los desechos celulares, los cuerpos apoptóticos y las vesículas más grandes, culminando con la ultracentrifugación del sobrenadante a 120.000 x g para granular los exosomas. Los procedimientos de aislamiento posteriores produjeron gránulos solubles en PBS enriquecidos con Exo derivado del bazo, como se muestra en la Figura 3G.
Resultados de TEM La morfología de los exosomas aislados se examinó mediante microscopía electrónica de transmisión, un método de referencia para estudiar la caracterización de exosomas. TEM se usa comúnmente para validar la presencia de exosomas, evaluar la calidad de los exosomas y observar la morfología de los exosomas. Las imágenes TEM (Figura 4A) revelaron la presencia de vesículas en forma de copa, que son características de los exosomas. Estas vesículas mostraron una clara estructura de bicapa lipídica, lo que confirma el aislamiento exitoso de los exosomas del tejido del bazo.
Distribución del tamaño de Spleen-Exo La distribución del tamaño y la concentración de los exosomas se determinaron utilizando un citómetro de nanoflujo. Los resultados (Figura 4B) indicaron que el diámetro de los exosomas aislados osciló entre 30 y 150 nm, con una concentración máxima de aproximadamente 60 nm. El diámetro de las partículas aisladas fue predominantemente de 50-80 nm, con una concentración media de partículas de 4,6 x 109 partículas/mL. Este rango de tamaño es consistente con las características previamente reportadas de los exosomas, lo que valida aún más el protocolo de aislamiento.
Análisis de Western blot Para confirmar la presencia de marcadores exosomales, se realizó un análisis de Western blot. Los marcadores exosomales TSG101 y CD9 se detectaron en las muestras de Bazo-Exo, mientras que GM130, una proteína de la matriz de Golgi utilizada como control negativo, no se detectó (Figura 4C). En comparación, la proteína de estos marcadores se expresó en los tejidos del bazo de ratón (Spleen-T). Esto indica la alta pureza de los exosomas aislados, ya que estaban desprovistos de contaminantes celulares.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67234/67234fig01.jpg"> 
Figura 1: Preparación de suministros. (A) Se colocaron tubos de centrífuga de 50 mL, placas de cultivo, hielo y herramientas quirúrgicas en un gabinete de bioseguridad. (B) Un filtro de células estériles (<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/67234/67234eq01.jpg" style="margin: auto;">70 μm). (C) Herramientas quirúrgicas esterilizadas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67234/67234fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67234/67234fig02.jpg"> 
Figura 2: Procedimiento de aislamiento del bazo-exo. Prepare el tejido del bazo y córtelo en trozos pequeños en PBS helado, seguido de la digestión con colagenasa tipo I y la centrifugación según se indique. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67234/67234fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67234/67234fig03.jpg"> 
Figura 3: Imágenes representativas del aislamiento de Spleen-Exo. (A) Pequeños bloques de bazo listos para su posterior digestión. (B) Bloques de tejido del bazo con tampón de digestión. (C) Pellets después de una centrifugación de 500 x g . (D) Pellets después de una centrifugación de 3.000 x g . (E) Pellets después de la centrifugación de 10.000 x g . (F) Pellets después de una centrifugación de 120.000 x g . (G) Pellets de exosomas después de una centrifugación de 120.000 x g . <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67234/67234fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67234/67234fig04.jpg"> 
Figura 4: Identificación de Spleen-Exo. (A) Resultados de TEM que muestran partículas aisladas como vesículas membranosas redondas u ovaladas con morfología en forma de copa. Barra de escala = 200 nm y 50 nm, respectivamente. (B) El análisis de la distribución de tamaño realizado por Flow Nano Analyzer mostró que el diámetro de Spleen-Exo osciló predominantemente entre 50 nm y 80 nm, con una concentración media de partículas de 4,6 × 109 partículas/mL. (C) Análisis de Western blot que muestra la expresión de proteínas marcadoras específicas de exosomas (TSG101 y CD9) en Spleen-Exo, con expresión negativa de GM130. Estos marcadores fueron detectables en muestras de proteínas extraídas de bazos de ratón (grupo Spleen-T). Se mostraron las imágenes representativas de Western blot (n = 6 tejidos). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67234/67234fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Aislamiento y caracterización de exosomas derivados de tejidos de bazo de ratón

Exosomes (Exo) are lipid-bilayer structures secreted by various cells, including those of animals, plants, and prokaryotes. Previous studies have revealed ...

isolation-characterization-exosomes-derived-from-mouse-spleen

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Este video describe un simple ahorro de tiempo para la técnica de la disociación del tejido automatizado utilizando el disociador gentleMACS para preparar una sola célula suspensiones de esplenocitos de ratón.

Preparación de una sola célula suspensiones de bazo de ratón con el disociador gentleMACS

Este documento muestra los métodos para el aislamiento, purificación y detección de exosomas, así como las técnicas para el análisis de su contenido molecular. Estos métodos son adaptables para el aislamiento exosoma de ambos medios de cultivo de células y fluidos biológicos, y puede más allá del análisis de contenido molecular también ser útil en los estudios funcionales.

Aislamiento y caracterización de ARN que contienen exosomas

En este artículo se demuestra el aislamiento de las células del pulmón murino residentes madre mesenquimales (MSC pulmón), su expansión, la caracterización y análisis de las propiedades inmunomoduladoras.

Aislamiento y Caracterización de Hoechst Baja CD45 Negativo Mouse células madre mesenquimales de pulmón

La presencia de microRNAs estables (miRNAs) en exosomas ha generado gran interés como un nuevo modo de comunicación intercelular, por su utilidad potencial como marcadores biológicos y como una ruta para la intervención terapéutica. Aquí se demuestra la purificación de exosomas sanguíneos y medios de cultivo seguido de PCR cuantitativa para identificar miRNAs que se transportan.

Purificación y microRNA perfiles de exosomas derivados de la sangre y Cultura Medios

Se describen técnicas que describen un procedimiento de gradiente para separar exosomas de partículas del virus de inmunodeficiencia humana (VIH). Este procedimiento se utilizó para aislar exosomas de partículas de VIH en plasma humano de individuos infectados por el VIH. Los exosomas aislados se analizaron para determinar el contenido de citocinas/quimiocinas.

Aislamiento de exosomas del plasma de VIH-1 en individuos positivos

El líquido biliar es una valiosa fuente de vesículas/exosomas extracelulares que contienen biomarcadores potencialmente importantes. Este protocolo representa un método sólido para aislar exosomas de la bilis humana para análisis posteriores, incluido el perfil de miARN.

El aislamiento y la generación de perfiles de exosomas de la bilis humana que contiene microRNA

Aquí, presentamos un protocolo para aislar las células dendríticas de bazos murinos por clasificación magnética celular y posterior transferencia adoptiva en ratones ingenuos. El modelo de células dendríticas activadas de sal fue elegido para explicar los procedimientos paso a paso de transferencia adoptiva y citometría de flujo.

Aislamiento y la transferencia adoptiva de sal alta tratan células dendríticas presentadoras de antígenos

Este protocolo ilustra 1) el aislamiento y cultivo de fibroblastos primarios del músculo gastrocnemio de ratón adulto, así como 2) la purificación y caracterización de exosomas utilizando un método de ultracentrifugación diferencial combinado con gradientes de densidad de sacarosa seguidos de análisis de Western blot.

Aislamiento y caracterización de exosomas de fibroblastos del músculo esquelético

Aquí describimos y demostramos un protocolo para el aislamiento primario de células endoteliales sinusoidales sinusoidales hepáticas (LSEC) del ratón. El protocolo se basa en la perfusión de colagenasa hepática, la purificación de células no parentales por centrifugación de baja velocidad y la selección de perlas magnéticas CD146. También fenotipo y caracterizamos estos LSEC aislados mediante citometría de flujo y microscopía electrónica de barrido.

Aislamiento y caracterización de células endoteliales sinusoidales sinusoidales hepáticas primarias de ratón

Este estudio utiliza citometría de flujo y dos estrategias diferentes de gating en ratones perfundidos aislados plexos coroideos cerebrales; este protocolo identifica los principales subconjuntos de células inmunes que pueblan esta estructura cerebral.

Aislamiento y caracterización de las células inmunes de plexos coroideos de ratón microdisecados

Aprenda a aislar exosomas de bazo de ratón mediante digestión con colagenasa tipo I y ultracentrifugación diferencial. Este protocolo preserva la integridad de la membrana celular y permite estudios funcionales en enfermedades cardiovasculares.

Aislamiento y caracterización de exosomas derivados de tejidos de bazo de ratón

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