Name: Cocultivo epitelial, mesenquimatal, endotelial e inmunitario derivado de iPSC para modelar la integridad de la barrera de las vías respiratorias en la salud y la enfermedad pulmonar (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-12-06T13:40:00.000+00:00
Duration: 6 min 27 s
Description: Aprende a generar un modelo multicelular de barrera respiratoria usando células derivadas de iPSC: epitelio, mesénquima, endotelio y macrófagos. Este sistema permite estudiar la remodelación de vías aéreas y respuestas a toxinas ambientales in vitro.

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<meta charset="utf8"></head><body>Modelo de vía aérea para estudiar la integridad de la barrera pulmonar, la enfermedad y el descubrimiento de fármacos

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</ol>

<table><tbody><tr><td>Placas de 12 pocillos</td><td>Corning</td><td>3512</td><td></td></tr><tr><td>insertos de 12 pocillos, 0,4 y micro; m, translúcido&nbsp;</td><td>VWR</td><td>10769-208</td><td></td></tr><tr><td>2-mercaptoetanol&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Innovative Cell Tech</td><td>AT104</td><td></td></tr><tr><td>Activin A</td><td>R& D Systems</td><td>338-AC</td><td></td></tr><tr><td>Ácido retinoico (RA) totalmente trans &nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R2625</td><td></td></tr><tr><td>ácido ascórbico</td><td>Sigma</td><td>A4544</td><td></td></tr><tr><td>B27 sin ácido retinoico&nbsp;</td><td>ThermoFisher</td><td>12587010</td><td></td></tr><tr><td>BMP4&nbsp;</td><td>R& D Systems</td><td>314-BP/CF</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina (BSA) Fracción V, solución al 7,5%&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>15260-037</td><td></td></tr><tr><td>Br-cAMP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B5386</td><td></td></tr><tr><td>CD 14 (FITC)</td><td>BioLegend</td><td>982502</td><td></td></tr><tr><td>CD 31 PECAM-1(APC)</td><td>R& D System</td><td>FAB3567A</td><td></td></tr><tr><td>CD 45 (PE)</td><td>BD Biosciences</td><td>560975</td><td></td></tr><tr><td>CD 68 (PE)</td><td>BioLegend</td><td>33808</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab120890</td><td></td></tr><tr><td>CPM</td><td>Fujifilm</td><td>014-27501</td><td></td></tr><tr><td>Dexametasona&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4902</td><td></td></tr><tr><td>Dispase&nbsp;</td><td>StemCellTech</td><td>7913</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>10565042</td><td></td></tr><tr><td>Dorsomorphin</td><td>R& D Systems</td><td>3093</td><td></td></tr><tr><td>E-CAD/CD 324 (APC)</td><td>BioLegend</td><td>324107</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>R& D Systems</td><td>236-EG</td><td></td></tr><tr><td>EGM2 Medio</td><td>Lonza</td><td>CC-3162</td><td></td></tr><tr><td>EPCAM/CD 326 (APC)</td><td>BioLegend</td><td>324212</td><td></td></tr><tr><td>FBS&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>10082139</td><td></td></tr><tr><td>FGF10</td><td>R& D Systems</td><td>345-FG/CF</td><td></td></tr><tr><td>FGF7</td><td>R& D Systems</td><td>251-KG/CF</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectina</td><td>Fisher 356008</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Forskolin</td><td>Abcam</td><td>ab120058</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>Jamón' s F12&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>11765-054</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>IBMX (3-Isobtyl-1-methylxanthine)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5879</td><td></td></tr><tr><td>IL-3</td><td>Peprotech</td><td>200-03</td><td></td></tr><tr><td>Iscove' s Dulbecco modificado' s Medio (IMDM) + Glutamax&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>31980030</td><td></td></tr><tr><td>Knockout Serum Replacement (KSR)</td><td>Life Technologies</td><td>10828028</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>354230</td><td></td></tr><tr><td>M-CSF</td><td>Peprotech&nbsp;</td><td>300-25</td><td></td></tr><tr><td>Monotioglicerol &nbsp;</td><td>Sigma</td><td>M6145</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR plus Kit (10/caja)</td><td>Stem Cell Tech</td><td>5825</td><td></td></tr><tr><td>N2&nbsp;</td><td>ThermoFisher</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>NEAA</td><td>Life Technologies</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Pen/estreptococo</td><td>Lonza</td><td>17-602F</td><td></td></tr><tr><td>ReleSR</td><td>Stem Cell Tech</td><td>5872</td><td></td></tr><tr><td>RPMI1640 + Glutamax&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>12633012</td><td></td></tr><tr><td>SB431542&nbsp;</td><td>R& D Systems</td><td>1614</td><td></td></tr><tr><td>SCF</td><td>PeproTech</td><td>300-07</td><td></td></tr><tr><td>SMA</td><td>Invitrogen</td><td>50-9760-80</td><td></td></tr><tr><td>STEMdiff APEL 2 Medio</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>5275</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express</td><td>Gibco</td><td>12605-028</td><td></td></tr><tr><td>VEGF165</td><td>Preprotech</td><td>100-20</td><td></td></tr><tr><td>Vimentin</td><td>Señalización celular</td><td>5741S</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 (Inhibidor de rocas)&nbsp;</td><td>R& D Systems</td><td>1254/1</td><td></td></tr><tr><td>ZO-1</td><td>Invitrogen</td><td>339100</td><td></td></tr></tbody></table>

cocultivo epitelial, mesenquimatal, endotelial e inmunitario derivado de ipsc para modelar la integridad de la barrera de las vías respiratorias en la salud y la enfermedad pulmonar

iPSC-Derived Epithelial, Mesenchymal, Endothelial, and Immune Cell Co-Culture to Model Airway Barrier Integrity in Lung Health and Disease

Existen múltiples etapas en las que se puede evaluar que la diferenciación de los organoides de las vías respiratorias, las células endoteliales, las células inmunitarias y los cocultivos derivados de iPSC se ha completado con éxito. Las diferenciaciones se pueden realizar en diferentes líneas de iPSC, y este protocolo se ha probado en al menos cinco líneas diferentes. El protocolo debe adaptarse a cada nueva línea de iPSC, específicamente modificando y optimizando la densidad de siembra.
El rendimiento exitoso de los organoides de las vías respiratorias derivados de iPSC se puede evaluar a través de campo claro y tendrá cuatro características: límites/bordes definidos, morfología translúcida/quística, capacidad de proliferar/expandirse y ausencia de células necróticas. Los organoides de las vías respiratorias que parecen borrosos no aumentan de tamaño durante las 2 semanas de cultivo y tienen necrosis no deben usarse para experimentos de cocultivo. Organoides con una gruesa capa luminal en la periferia vs. Los organoides translúcidos/quísticos aún se pueden utilizar para experimentos posteriores. Sin embargo, los organoides translúcidos/quísticos de las vías respiratorias están compuestos predominantemente por células basales, mientras que los organoides gruesos de doble membrana están compuestos predominantemente por células club. Debido a que las células basales proliferan y se expanden fácilmente, son más adecuadas para el cultivo y la polarización de la interfase aire-líquido. Otros métodos para evaluar el rendimiento exitoso de los organoides pulmonares derivados de iPSC son el análisis de citometría de flujo en la etapa progenitora pulmonar (día 16 de la diferenciación) para el marcador de superficie CPM (Tabla 1), un rendimiento de diferenciación exitoso &gt;50% de células CPM+.
Para la disociación de organoides de las vías respiratorias y el cultivo de interfase aire-líquido, asegúrese de que se haya eliminado todo el polímero de ECM, o evitará que las células se expandan en la membrana. Las células deben estar confluentes para el día 3 de cultivo, antes del levantamiento aéreo. La confirmación de los tipos de células en las vías respiratorias se puede evaluar mediante la tinción de los respectivos marcadores específicos del tipo de célula: células basales (p63+), células club (SCGB1A1+), células caliciformes (MUC5AC+) y células ciliadas (AcTub+). La caracterización y los marcadores distintivos del tipo de células pulmonares se verifican en LungMAP21. El mesénquima se puede detectar con anticuerpos contra la vimentina o la actina del músculo liso. Para generar más células ciliadas, los cultivos pueden requerir transporte aéreo durante un período de tiempo más largo o la adición de DAPT.
El rendimiento exitoso de las células endoteliales derivadas de iPSC se puede evaluar a través de campo claro, mostrando una morfología similar a un adoquín (día 6 de la diferenciación endotelial derivada de iPSC). Un cultivo endotelial exitoso derivado de iPSC contendrá &gt;50% de células CD31+, y se deben generar suficientes células para que, después de la clasificación, el rendimiento sea de más de 500.000 células. Las células pueden ser conducidas o criopreservadas, y el marcador CD31 debe probarse a través del flujo con cada paso o nuevo cultivo. Las celdas no deben pasar más allá de P4. Como referencia, ver Células endoteliales derivadas de iPSC antes y después de la clasificación de CD31 (Figura 1C). Las células endoteliales serán planas con un cuerpo celular grande con morfología alargada y en forma de huso.
Para la diferenciación de macrófagos, los cuerpos embrioides deben permanecer en el fondo del pocillo de ULA, y solo debe haber un EB en cada pocillo. Deberían mostrar cambios quísticos entre el día 5 y el 7. Si no forman un EB después de la centrifugación, siembre las iPSC en la placa ULA de 96 pocillos sin girar. Puede ser necesario aumentar el número de iPSC. El éxito de las células inmunitarias derivadas de iPSC depende totalmente de la capacidad de los cuerpos embrioides (EB) para convertirse en quistes (día 7 de diferenciación). Las EB inmunitarias derivadas de iPSC que no desarrollan quistes no formarán estroma cuando se coloquen en gelatina y no producirán progenitores mieloides. Después de la transferencia a la placa recubierta de gelatina, los EB deben permanecer unidos a la parte inferior de la placa. El movimiento de la placa debe hacerse con cuidado para no desalojarlos. Las placas deben cambiarse manualmente dos veces por semana y las células suspendidas deben pasar a Mac-CM2 o criopreservadas. Además, después de recolectar los progenitores mieloides suspendidos, deben adherirse al matraz de plástico no recubierto y generar células brillantes en campo claro con vacuolas, lo que indica macrófagos. El marcador de monocitos, CD14+, debe estar en un &gt;90% en las células en suspensión. El marcador de macrófagos, CD68, debería aumentar con el tiempo, con ~50% de macrófagos expresando CD68+ después de 2 semanas (Figura 1D). La eficiencia de adhesión debe determinarse para cada línea celular. Logramos un promedio de 20% de eficiencia de adherencia. Para la polarización, los macrófagos M0 se polarizan a macrófagos M1 (iPSC-M1) o M2 (iPSC-M2) durante 48 h en medio de diferenciación II suplementado con diferentes estímulos: 100 ng/mL LPS y 20 ng/mL IFN-g para la polarización M1 o 50 ng/mL IL-4 y 20 ng/mL IL-13 para la polarización M2. El marcador de polarización M1 es CD80+ y la polarización M2 es CD206+.
El éxito de la generación del triple cocultivo puede evaluarse mediante inmunofluorescencia para los marcadores epiteliales de unión estrecha EPCAM, ECAD o ZO-1, o el marcador de unión estrecha endotelial CD31 (Figura 2C, Tabla 1). La funcionalidad del triple cocultivo también puede evaluarse mediante la resistencia epitelial/endotelial transeléctrica (TEER). Los cocultivos de organoides y endoteliales de las vías respiratorias bien ensamblados tendrán una mayor resistencia eléctrica, lo que indica una comunicación y conexión celular óptimas. Las agresiones ambientales, como los cigarrillos electrónicos o el desafío viral, comprometerán la integridad de la barrera epitelial y endotelial, lo que resultará en una reducción de la resistencia eléctrica del cocultivo (Figura 3A, B) y uniones estrechas desorganizadas (Figura 3C).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67247/67247fig01v2.jpg"> 
Figura 1: Diferenciación y caracterización de cultivos de epitelio, endotelio e inmunitarios de vías respiratorias derivados de iPSC. (A) Esquema de las diferenciaciones dirigidas por iPSC para el montaje de la iAirway. (B) Organoides de epitelio de las vías respiratorias derivados de iPSC caracterizados por campo claro (izquierda) y análisis de citometría de flujo (derecha) para EPCAM y ECAD. (C) Endotelio de las vías respiratorias derivado de iPSC caracterizado por campo claro (izquierda), inmunofluorescencia y análisis de citometría de flujo (derecha) para CD31. A la derecha se muestra el campo claro respectivo después de la clasificación CD31. (D) Los macrófagos derivados de iPSC se caracterizan mediante análisis de campo claro (izquierda) y citometría de flujo (derecha) para el marcador hematopoyético pan-CD45, el marcador de monocitos CD14 y el marcador de macrófagos CD68. Barras de escala: 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67247/67247fig01largev2.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67247/67247fig02.jpg"> 
Figura 2: Cocultivo de células epiteliales, mesenquimales, endoteliales y macrófagos derivadas de iPSC. (A) Esquema del montaje de la vía aérea. (B) Imágenes de campo claro del respectivo monocultivo epitelial y endotelial, el bicultivo epitelial y endotelial, y el cocultivo epitelial, endotelial y macrófago. Macrófagos marcados con citotracker rojo. Barras de escala: 100 μm. (C) Tinción inmunofluorescente para el marcador de unión estrecha ZO-1 en el lado apical del inserto de cultivo celular y CD31 en el lado basolateral. Barras de escala: 100 μm. (D) Sección transversal del inserto de cultivo celular con organoides de vía aérea disociados en el lado apical, 1 semana después del levantamiento aéreo. El panel izquierdo con tinción de H&amp;E con la flecha negra muestra las células ciliadas. El panel central, con imágenes de inmunofluorescencia, muestra el marcador epitelial E-cadherina (ECAD). El panel derecho, con imágenes de inmunofluorescencia, muestra marcadores mesenquimales como la vimentina (VIM) y la actina del músculo liso (SMA). Barras de escala: 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67247/67247fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67247/67247fig03.jpg"> 
Figura 3: Cambios en la función de barrera de las vías respiratorias de las vías respiratorias expuestas a cigarrillos electrónicos y virus. (A) Esquema de la herramienta de medición de resistencia epitelial/endotelial transeléctrica (TEER). (B) Gráfico de barras de TEER después de 7 días de adición de cigarrillos electrónicos mentolados a los medios. Media +/- intervalo de confianza del 95%. N = 5 réplicas biológicas y 3 réplicas técnicas; Valor p &lt;0,001. (C) Tinción inmunofluorescente para la proteína de unión estrecha ZO-1 antes y después de la infección por SARS-CoV-2. Obsérvese el diseño desordenado de ZO-1 después de la infección. Barras de escala: 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67247/67247fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anticuerpo</td>
			<td>Aplicación</td>
			<td>Dilución</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD 31 PECAM-1(APC)</td>
			<td>citometría de flujo (FC)</td>
			<td>10 μl en tampón de 100 ul</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EPCAM/CD 326 (APC)</td>
			<td>FC</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E-CAD/CD 324 (APC)</td>
			<td>FC</td>
			<td>5 μl en tampón de 100 ul</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CPM</td>
			<td>FC</td>
			<td>1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD 45 (PE)</td>
			<td>FC</td>
			<td>5 μl en tampón de 100 ul</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD 14 (FITC)</td>
			<td>FC</td>
			<td>5 μl en tampón de 100 ul</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD 68 (PE)</td>
			<td>FC</td>
			<td>5 μl en tampón de 100 ul</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZO-1</td>
			<td>Inmunofluorescencia (IF)</td>
			<td>1:300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vimentina</td>
			<td>SI</td>
			<td>1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMA</td>
			<td>SI</td>
			<td>1:100</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabla 1: Anticuerpos utilizados en FACS e Inmunofluorescencia.
Archivo complementario 1: Composiciones de medios y búferes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67247/Supplementary%20File%201.zip" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>

Cocultivo epitelial, mesenquimatal, endotelial e inmunitario derivado de iPSC para modelar la integridad de la barrera de las vías respiratorias en la salud y la enfermedad pulmonar

Human lung tissue is composed of an interconnected network of epithelium, mesenchyme, endothelium, and immune cells from the upper airway of the ...

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Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

Aquí se presenta un protocolo para el aislamiento primario de monocitos de sangre humana, así como su diferenciación en macrófagos y células dendríticas y el montaje con células epiteliales en un modelo pulmonar humano multicelular. Se comparan las respuestas biológicas de las cocultivos compuestas de células inmunitarias diferenciadas de los monocitos recién aislados o descongelados, tras la exposición a estímulos proinflamatorios.

Modelo alveolar humano multicelular compuesto por células epiteliales y células inmunes primarias para la evaluación de riesgos

Este artículo proporciona una metodología detallada para los enfoques de disociación tisular y fraccionamiento celular que permiten el enriquecimiento de células epiteliales viables de las regiones proximal y distal del pulmón humano. En este caso, estos enfoques se aplican para el análisis funcional de células progenitoras epiteliales pulmonares mediante el uso de modelos de cultivo de organoides 3D.

Aislamiento y enriquecimiento de células progenitoras epiteliales pulmonares humanas para cultivo de organoides

El presente protocolo describe células alveoidales alveoidales pluripotentes derivadas de células madre pluripotentes inducidas por humanos (iAT2). Estas células pueden cultivarse como esferas autorrenovadoras en cultivo 3D o adaptarse al cultivo de interfaz aire-líquido (ALI).

Generación de esferas 3D y cultivos de interfaz aire-líquido 2D de células epiteliales alveolares pluripotentes inducidas por humanos derivadas de células madre pluripotentes de tipo 2

Los avances recientes en los protocolos de diferenciación de células madre pluripotentes inducidas por humanos permiten la derivación gradual de tipos de células específicas de órganos. Aquí, proporcionamos pasos detallados para el mantenimiento y la expansión de las células basales de las vías respiratorias derivadas de iPSC y su diferenciación en un epitelio mucociliar en cultivos de interfaz aire-líquido.

Generación de cultivos de interfaz aire-líquido de células epiteliales de las vías respiratorias a partir de células madre pluripotentes humanas

El protocolo presentado describe el desarrollo y uso de una técnica de tinción de actina filamentosa basada en faloidina con microscopía de barrido láser confocal (CLSM) para visualizar la estructura de la capa celular adherente en canales de cultivo dinámico microfluídico y cámaras tradicionales de cultivo estático de pozo fijo. Este enfoque ayuda a evaluar la confluencia de la capa celular, la formación de monocapa y la uniformidad del espesor de la capa.

Preparación y evaluación estructural de monocapas de células epiteliales en un dispositivo de cultivo microfluídico de tamaño fisiológico

Aquí se presenta un método reproducible, asequible y robusto para el aislamiento y la expansión de células epiteliales bronquiales primarias para biobancos a largo plazo y la generación de células epiteliales diferenciadas por cultivo en la interfaz aire-líquido.

Aislar células epiteliales bronquiales del tejido pulmonar resecado para biobancos y establecer cultivos de interfaz aire-líquido bien diferenciados

Este informe proporciona protocolos para el ensamblaje, el cultivo celular y los ensayos en la plataforma μSiM para la construcción de modelos de barrera hematoencefálica.

Uso de la plataforma de tejido de barrera MicroSiM (μSiM) para modelar la barrera hematoencefálica

Aquí, se proporciona un protocolo para el cultivo de organoides esofágicos humanos y el cultivo de interfaz aire-líquido. El cultivo de la interfaz aire-líquido de los organoides esofágicos se puede utilizar para estudiar el impacto de las citocinas en la barrera epitelial esofágica.

Modelos de cultivo celular tridimensional para investigar la barrera epitelial en la esofagitis eosinofílica 

En este trabajo describimos un modelo in vitro para aislar y diferenciar células epiteliales murinas de las vías respiratorias, centrándonos en su aclimatación al extracto crónico de humo de cigarrillo (CSE). El modelo podría utilizarse para caracterizar de forma exhaustiva el impacto multiómico de la CSE, lo que posiblemente proporcione información sobre las respuestas celulares bajo una exposición crónica al humo.

Modelo in vitro para el estudio de la diferenciación y los cambios de las células epiteliales de las vías respiratorias murinas estimuladas con extracto de humo de cigarrillo

Este protocolo describe el cultivo primario / co-cultivo de tejido ovárico ratón, utilizando los ovarios de ratones recién nacidos y los folículos ováricos individuales de ratones prepúberes. Las técnicas de cultivo de apoyar el desarrollo de una manera altamente fisiológica, lo que permite la investigación del efecto de los agentes extrínsecos en el ovario, y de las interacciones entre los folículos ováricos.

Cultura y Co-cultura de ratón ovarios y los folículos ováricos

Aprende a generar un modelo multicelular de barrera respiratoria usando células derivadas de iPSC: epitelio, mesénquima, endotelio y macrófagos. Este sistema permite estudiar la remodelación de vías aéreas y respuestas a toxinas ambientales in vitro.

Cocultivo epitelial, mesenquimatal, endotelial e inmunitario derivado de iPSC para modelar la integridad de la barrera de las vías respiratorias en la salud y la enfermedad pulmonar (Video) | JoVE Journal

Cocultivo epitelial, mesenquimatal, endotelial e inmunitario derivado de iPSC para modelar la integridad de la barrera de las vías respiratorias en la salud y la enfermedad pulmonar

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