Name: Visualización de trampas extracelulares de neutrófilos en vénulas mesentéricas después de una lesión por isquemia-reperfusión mesentérica mediante microscopía intravital (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-27T14:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 5 s
Description: Aprende a visualizar trampas extracelulares de neutrófilos en vénulas mesentéricas mediante microscopía intravital tras lesión por isquemia-reperfusión en modelos murinos. Este método permite observar la formación de NETs y la adhesión leucocitaria en tiempo real.

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<meta charset="utf8"></head><body>Papel endotelial de PAR1 en la adhesión de leucocitos y la formación de NET durante la lesión I/R

<table><tbody><tr><td>Naranja acridina</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>&nbsp; A-6014</td><td></td></tr><tr><td>Placa de 96 pocillos Múltiple PCR-Platten&nbsp;</td><td>Sarstedt</td><td>721977202.00</td><td></td></tr><tr><td>Sistemas de anestesia para roedores</td><td>GROPPLER medizintechnik</td><td>Uni Vet -Porta T-8</td><td></td></tr><tr><td>Aqua ad injectabilia IVM</td><td>B Braun Melsungen</td><td>53402101</td><td></td></tr><tr><td>masa negra</td><td>Arcilla de modelar</td><td>Staedtler</td><td></td></tr><tr><td>CD146 Microperlas, ratón</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-007</td><td></td></tr><tr><td>cellSens</td><td>Olympus</td><td>Olympus cellSense Dimension Desktop 2.3</td><td>software</td></tr><tr><td>dispositivo de carga acoplada cámara</td><td>Hamamatsu Photonics</td><td>ORCA-R2</td><td></td></tr><tr><td>cámara bastoncillos de algodón</td><td>B&ouml; ttger</td><td>09-119-9100</td><td></td></tr><tr><td>Hemostático curvo 125mm/5"</td><td>Instrumentos índigo&nbsp;</td><td>22466</td><td></td></tr><tr><td>Crema depilatoria</td><td>Balea</td><td>no aplicable</td><td></td></tr><tr><td>Dorbene Vet</td><td>zoetis Pinzas</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dumont</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-35</td><td></td></tr><tr><td>Etanol p.a. 99,5 %</td><td>Roth</td><td>5504.20</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras extraestrechas &ndash; Recto/Afilado-Afilado/10.5</td><td>FST</td><td>14088-10</td><td></td></tr><tr><td>Fentanilo</td><td>Pinzas Janssen-Cilag GmBH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>"Dumont #5" (Inox, punta 0,1 mm, longitud 11 cm)</td><td>FST</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>GentleMACS C Tubos</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-236</td><td></td></tr><tr><td>Graphpadprism</td><td>Graphpad</td><td>Prism 10</td><td>software</td></tr><tr><td>isoflurano&nbsp;</td><td>Piramal</td><td>4150097146757.00</td><td></td></tr><tr><td>iTaq UniversalSYBR Verde Supermix 10x5ml</td><td>BioRad</td><td>1725125.00</td><td></td></tr><tr><td>Cinta médica Leukofix</td><td>BSNMedical</td><td>0213600</td><td></td></tr><tr><td>Kit de disociación hepática, ratón</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-105-807</td><td></td></tr><tr><td>LS-Columnas de separación MACS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>MACS Smart Strainer 100 y micro; m</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-098-463</td><td></td></tr><tr><td>Microseal B Sellos Biorad</td><td></td><td>MSB1001</td><td></td></tr><tr><td>Midazolam</td><td>hameln</td><td>5918501.00</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Braun 2350748</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Portaagujas</td><td>FST</td><td>12001-13</td><td></td></tr><tr><td>Sutura de seda trenzada no absorbible, Tamaño: 7/0, 91 metros&nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>18020-70</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio de fluorescencia Olympus BX51WI</td><td>Microscopio</td><td>Olympus</td><td></td></tr><tr><td>PCR para tiras de tubo</td><td>Sarstedt</td><td>72985002.00</td><td></td></tr><tr><td>Tapas de tubo de PCR</td><td>Sarstedt</td><td>65989002.00</td><td></td></tr><tr><td>Catéter de polietileno</td><td>Smith Medical Deutschland GmbH</td><td>800/100/100</td><td></td></tr><tr><td>Prolene (8648G), Polipropileno 6-0, Nahtmaterial&nbsp;</td><td>Johnson & Johnson Medical GmbH&nbsp;</td><td>8695H</td><td></td></tr><tr><td>Relia Prep ARN Miniprep Systems</td><td>Promega</td><td>Z6112</td><td></td></tr><tr><td>Kit de Transcripción Inversa (ADNc de Alta Capacidad)</td><td>Applied Biosystems</td><td>4368813.00</td><td></td></tr><tr><td>Báscula escolar&nbsp;</td><td>KERN & SOHN GmbH</td><td>EMB 500-1</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras de resorte - Inclinadas a los lados</td><td>FST</td><td>15006-09</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio estereoscópico</td><td>Leica</td><td>M50</td><td></td></tr><tr><td>Hemostáticos rectos 135mm/5.5"</td><td>Indigo Instruments&nbsp;</td><td>22468</td><td></td></tr><tr><td>Jeringa 1 mL</td><td>Braun</td><td>9166017V</td><td></td></tr><tr><td>SYTOX Naranja</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S11368</td><td></td></tr><tr><td>Controlador de temperatura TC-1000</td><td>FMI F&ouml; hr Medical Instruments GmbH</td><td>no aplicable</td><td></td></tr><tr><td>Pinza de tejido - 1x2 dientes</td><td>FST</td><td>18057-14</td><td></td></tr><tr><td>pinza vascular</td><td>Fine Science Tools</td><td>18055-02</td><td></td></tr><tr><td>Vetiva mini</td><td>WAHL</td><td>1584-0480</td><td></td></tr></tbody></table>

visualización de trampas extracelulares de neutrófilos en vénulas mesentéricas después de una lesión por isquemia-reperfusión mesentérica mediante microscopía intravital

Visualization of Neutrophil Extracellular Traps in Mesenteric Venules After Mesenteric Ischemia-Reperfusion Injury via Intravital Microscopy

Para estudiar los efectos dependientes de las células endoteliales sobre la formación y adhesión de los leucocitos, así como sobre la formación de NET, inicialmente, se examinó la eficacia de la deficiencia de F2r inducible por VE-Cadherin Cre en células endoteliales. Se empleó la clasificación magnética de células para aislar las células endoteliales hepáticas. Posteriormente, se aisló el ARN, seguido de PCR cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR). Los ratones F2r ΔEC, en los que la Cre recombinasa expresada bajo el control del promotor VE-Cadherin está ausente, mostraron niveles de ARNm F2r (PAR1) significativamente reducidos (aproximadamente en un tercio) en comparación con los controles WT (Figura 1).
Después de confirmar la deficiencia en la línea de ratón, se realizó una lesión I/R mesentérica para examinar el impacto de PAR1 expresado por las células endoteliales vasculares sobre el rodaje y la adhesión de los leucocitos, visualizado por microscopía intravital (Figura 2A,B). Después de 1 h de isquemia, se retiró la pinza y se permitió que el vaso volviera a fusionarse. Se observó y registró el rodamiento y la adherencia de los leucocitos (teñido de verde, indicado por flechas blancas). Aunque ambos grupos mostraron un aumento en el número de leucocitos adherentes después de la lesión I/R, la deficiencia de F2r endotelial (PAR1) resultó en una adhesión de los leucocitos al endotelio mesentérico activado por I/R, lo que sugiere un papel activo de la activación endotelial de PAR1 en el reclutamiento de leucocitos a las vénulas mesentéricas isquémicas (Figura 2C).
El siguiente objetivo fue examinar si la expresión endotelial de PAR1 regula la formación de NET inducida por lesiones I/R. Por lo tanto, los ácidos nucleicos extracelulares se tiñeron con un colorante impermeable a las células30 y se visualizaron los NET generados mediante microscopía intravital (indicada por flechas negras) (Figura 2A, B). Después de la lesión I/R, se observaron NETs solo en el grupo WT que expresaban niveles normales de PAR1 en las células endoteliales, lo que indica un papel regulador de PAR1 en NETosis (Figura 2C, D). En particular, cuando se suprimió la expresión endotelial de F2r , no hubo NET en las vénulas mesentéricas lesionadas por I/R.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67264/67264fig01.jpg"> 
Figura 1: Expresión de ARNm F2r (PAR1). Expresión de células endoteliales hepáticas F2r de ratones WT (n = 6) y F2rΔEC (n = 9) en relación con el gen de mantenimiento L32. Los datos se presentan como una mediana con un intervalo de confianza del 95%. Se utilizó la prueba de Mann-Whitney para comparar dos grupos independientes, *p &lt; 0,05. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67264/67264fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67264/67264fig02.jpg"> 
Figura 2: El endotelial PAR1 afecta a la adhesión de los leucocitos y a la formación de NET en las vénulas mesentéricas lesionadas por I/R. Imágenes representativas de microscopía intravital de leucocitos adheridos teñidos con naranja de acridina (flechas blancas) y NETs teñidos con naranja Sytox (flechas negras) de ratones WT y F2rΔEC antes (pre) y después (post) de la lesión I/R (A) 10x y (B) aumento de 20x. Barras de escala: A, 50 μm; B, 20 μm. (C) Adhesión de leucocitos y (D) NETs pormm2 de ratones WT (n = 7) y F2rΔEC (n = 4) antes (pre) y después (post) de la lesión I/R. Todos los datos se representaron como mediana con un intervalo de confianza del 95%. Las comparaciones estadísticas se realizaron mediante la prueba de ANOVA de dos vías, **p&lt; 0,01, y las pruebas de comparación múltiple de Sídák para comparar las medias de diferentes genotipos en cada punto temporal (pre y post-isquemia). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67264/67264fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Visualización de trampas extracelulares de neutrófilos en vénulas mesentéricas después de una lesión por isquemia-reperfusión mesentérica mediante microscopía intravital

Intestinal ischemia-reperfusion (I/R) injury is an acute condition characterized by tissue damage resulting from restricted blood flow to the mesenteric ...

visualization-neutrophil-extracellular-traps-mesenteric-venules-after

Research

Investigación

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Las trampas de neutrófilos extracelular (TNE) es un importante mecanismo de inmunidad innata para luchar contra las bacterias patógenas, hongos y parásitos. A continuación se describen los métodos para aislar a los granulocitos neutrófilos de la sangre humana y para activarlos para formar NET. Se presentan las técnicas de preparación para visualizar NET en la microscopía óptica y electrónica.

Las trampas de neutrófilos extracelular: Cómo generar y visualizarlas

Se describe un protocolo de la microscopía de campo claro intravital para medir la dinámica de los neutrófilos interacciones célula endotelial durante el reclutamiento de neutrófilos en respuesta a la fuente de un quimioatrayente de neutrófilos en vivo. Rastreo de neutrófilos intraluminal, la migración y la quimiotaxis transendotelial en tejido de ratón músculo cremáster se visualizan con la fotografía de vídeo de tiempo transcurrido y el seguimiento con ImageJ.

Seguimiento de Rastreo de neutrófilos intraluminal, la migración transendotelial y la quimiotaxis de los tejidos por microscopía de vídeo intravital

Este video demuestra la inducción y visualización de trampas extracelulares de neutrófilos o NETs en neutrófilos premarcados utilizando suero del paciente que contiene anticuerpos anti-citoplasma de neutrófilos. Además, el uso de un tinte de ADN impermeable y la microscopía de fluorescencia permite la visualización de los NET.

Inducción y visualización de trampas extracelulares de neutrófilos en neutrófilos premarcados

Aquí se presenta una técnica experimental de microscopía intravital de fluorescencia para visualizar heterotípicas plaquetas neutrófilos interacciones en el endotelio activado durante la inflamación vascular y la formación de trombos en ratones vivos. Esta tecnología microscópica será valiosa para estudiar el mecanismo molecular de la enfermedad vascular y para poner a prueba los agentes farmacológicos bajo condiciones fisiopatológicas.

Imágenes en tiempo real de heterotypic plaquetas neutrófilos Interacciones en el endotelio activado durante la inflamación vascular y la formación de trombos en ratones vivos

Esta aplicación simplificada de la microscopía intravital de las venas del mesenterio en ratones se puede utilizar en diferentes modelos de inflamación para observar las interacciones leucocito-endotelial y plaqueta-leucocito.

Interacciones intravital microscopía de leucocitos endoteliales y plaquetas de leucocitos en mesenterial venas en ratones

Detallamos un protocolo para monitorizar el comportamiento de neutrófilos y monocitos en venas mesentéricas en estado estacionario e inflamatorio utilizando microscopía confocal intravital en ratones anestesiados.

Imaging neutrófilos y monocitos en mesentérica venas por Microscopia intravital en ratones anestesiados en Tiempo Real

Este protocolo describe la inducción de un modelo de isquemia-reperfusión (IR) en la piel de oreja de ratón utilizando sujeción imán. El uso de un modelo de imágenes intravital hecha a la medida, se estudia en las respuestas inflamatorias in vivo después de la reperfusión. La razón fundamental detrás del desarrollo de esta técnica es extender la comprensión de cómo los leucocitos responden a la lesión IR piel.

La inducción de la lesión por isquemia-reperfusión en la piel de la oreja del ratón para intravital n fotones de imágenes de la respuesta inmune

Los monocitos son importantes mediadores de la Arteriogénesis en el contexto de la enfermedad arterial periférica. Utilizando una matriz similar a la membrana del sótano y microscopia intravital, este protocolo investiga monocito recalada y relacionados con el tumor angiogénesis después de la inyección de monocitos en el modelo murino de la ligadura de la arteria femoral.

Microscopia intravital de monocito autoguiado hacia el blanco y la angiogénesis tumorales en un modelo murino de la enfermedad Arterial periférica

Las trampas extracelulares de neutrófilos (NET) son estructuras tridimensionales generadas por granulocitos neutrófilos estimulados. En los últimos años ha quedado claro que los NET están implicados en una amplia variedad de enfermedades. La detección de NETs en el tejido puede tener relevancia diagnóstica, por lo que se requieren protocolos estandarizados para etiquetar los componentes NET.

Etiquetado de inmunofluorescencia de trampas extracelulares de neutrófilos humanos y murinos en tejido incrustado por parafina

Describimos un método para identificar trampas extracelulares de neutrófilos (NET) en trombos arteriales cardiogénicas felinos finos fijos fijos fijos y con parafina incorporados de formaldehído mediante la recuperación de antígenos inducidos por calor y un protocolo de doble inmunoetiquetado.

Identificación de trampas extracelulares de neutrófilos en tromba arterial felino incrustada en parafina mediante microscopía de inmunofluorescencia

Las trampas extracelulares de neutrófilos (TNE) se asocian con diversas enfermedades, y la inmunofluorescencia se utiliza a menudo para su visualización. Sin embargo, existen varios protocolos de tinción y, en muchos casos, solo se examina un tipo de tejido. Aquí, establecemos un protocolo de aplicación general para la tinción de NET en tejido de ratón y humano.

Imágenes de inmunofluorescencia de trampas extracelulares de neutrófilos en tejidos humanos y de ratón

Aprende a visualizar trampas extracelulares de neutrófilos en vénulas mesentéricas mediante microscopía intravital tras lesión por isquemia-reperfusión en modelos murinos. Este método permite observar la formación de NETs y la adhesión leucocitaria en tiempo real.

Visualización de trampas extracelulares de neutrófilos en vénulas mesentéricas después de una lesión por isquemia-reperfusión mesentérica mediante microscopía intravital (Video) | JoVE Journal

Visualización de trampas extracelulares de neutrófilos en vénulas mesentéricas después de una lesión por isquemia-reperfusión mesentérica mediante microscopía intravital

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