Visualización de trampas extracelulares de neutrófilos en vénulas mesentéricas después de una lesión por isquemia-reperfusión mesentérica mediante microscopía intravital

El papel de genes particulares en la aparición y el desarrollo de la trombosis, en este caso, investigamos la expresión endotelial de PAR1 en la lesión por isquemia-reperfusión. Intentamos precisar el efecto del endotelio en la respuesta, tanto después de la isquemia como durante la reperfusión. Un aspecto realmente importante que está poco estudiado hasta ahora es identificar el papel de los comensales intestinales en la lesión por isquemia-reperfusión mesentérica.

Para estudiar esta cuestión, nuestro grupo combinó la microscopía intravital con un modelo de lesión por isquemia-reperfusión mesentérica, y lo combinamos con modelos de ratón libres de gérmenes. La aplicación de modelos de trombosis a ratones transgénicos en combinación con microscopía intravital, estas tecnologías permiten la observación in vivo de los comportamientos celulares durante el inicio de la enfermedad. Realizar modelos experimentales en un organismo vivo siempre es un desafío, ya que el experimento está influenciado por muchos factores, incluido el sexo, la edad, el tratamiento de anestesia, los cambios en las regulaciones de bienestar animal, etc.

Además, la investigación en trombosis comenzó en el siglo pasado. Muchos de los factores que contribuyen a ello siguen sin resolverse. Mi grupo estudia el papel de la microbiota intestinal en la trombosis, la aterosclerosis, la función plaquetaria y la vascularización.

Para comenzar, coloque al ratón afeitado anestesiado en decúbito dorsal sobre una almohadilla térmica. Conecte el mouse al sistema de oxígeno a través de un cono nasal. Asegure las extremidades del ratón a la almohadilla térmica con cinta quirúrgica.

Para la implantación del catéter en la vena yugular, se realiza una incisión transversal sobre la tráquea. Retire la piel que cubre el cuello y aísle la vena yugular derecha. Luego, usando un hilo de seda de cinco centímetros, cierre el extremo distal de la vena y fíjelo con pinzas quirúrgicas.

Coloque tres hilos de seda aproximadamente dos centímetros por debajo de la vena, uno cerca del extremo distal y dos cerca del extremo proximal de la vena yugular. Haga un nudo quirúrgico, pero no cierre el vaso. Llene un catéter de polietileno con cloruro de sodio al 0,9%.

Retire las burbujas de aire y conéctelo en una jeringa de un mililitro. Use unas tijeras para cortar un orificio entre el segundo y el tercer nudo e implantar el catéter en la vena yugular. Aspire la jeringa para asegurarse de que haya sangre en el catéter.

Ata el hilo de seda para asegurar el catéter en la vena. Luego, use una cinta médica para asegurar la jeringa. Llene jeringas de un mililitro con naranja de acridina a una concentración final de 0,5 miligramos por mililitro y colorante de ácido nucleico con una concentración de cinco micromolares.

Inyecte 50 microlitros de SYTOX Orange para trampas extracelulares de neutrófilos, o NET. Desinfecta la piel abdominal del ratón alternando rondas de exfoliantes a base de yodo y alcohol. Luego, con un bisturí, realice una laparotomía de tres a cinco centímetros a lo largo del alba lineal.

Coloque suavemente el intestino fuera de la cavidad abdominal con dos puntas de algodón humedecidas con solución salina e identifique un lugar con una cobertura mínima de grasa. Coloque pequeñas ramas del intestino sobre una masa negra para reducir la señal de fondo. Inyectar 50 microlitros de naranja de acridina a través del catéter de la vena yugular para visualizar los leucocitos teñidos.

Adquirir el video del intestino antes de la reperfusión por isquemia. Prepare una compresa humedecida con cloruro de sodio y coloque el intestino en ella. Ocluir la arteria mesentérica superior con una pequeña pinza vascular.

Empuje suavemente el intestino hacia la cavidad abdominal con hisopos de algodón humedecidos con solución salina. Utilice una sutura 7-0 para cerrar la pared abdominal y evitar la pérdida de humedad y temperatura. Después de una hora, retire la sutura.

Después del período isquémico, aplique unas gotas de solución salina en el área recortada. A continuación, retire suavemente las pinzas microvasculares con un aplicador de pinzas. Con puntas de algodón humedecidas con solución salina, vuelva a colocar suavemente el intestino fuera de la cavidad abdominal y coloque las pequeñas ramas de la vena sobre una masa negra.

Inyecte 50 microlitros de naranja de acridina y capture el video post-isquémico de la vena. Encienda el microscopio de fluorescencia de campo amplio de alta velocidad equipado con un condensador de larga distancia, un monocromador, un objetivo de inmersión en agua de 10 veces y una cámara de dispositivo de carga acoplada. Establezca el tiempo de exposición en 30 milisegundos y seleccione el canal 5B con los filtros Alexa Fluor 488 y Rhodamine Red instalados para visualizar los leucocitos y los NET.

Cuantifique el reclutamiento de células dentro de una región de interés de 0,06 milímetros cuadrados. Luego, cuantifique los leucocitos adheridos mediante el recuento de las células que permanecieron estacionarias o adheridas al revestimiento endotelial durante un período de observación de 20 segundos. Identifique los NET marcados con colorantes fluorescentes de leucocitos y ácidos nucleicos.

La adhesión de los leucocitos al endotelio mesentérico isquémico aumentó tanto en el grupo de EC delta de tipo salvaje como en el F2r después de la lesión por isquemia-reperfusión, con una adhesión notablemente menor observada en el grupo de EC delta F2r, lo que implica un papel de PAR1 endotelial en el reclutamiento de leucocitos. Después de la lesión por isquemia-reperfusión, solo se observaron TNE en el grupo de tipo natural que expresaba niveles normales de PAR1 en las células endoteliales, lo que indica un papel regulador de PAR1 en la NETosis.