Name: Establecimiento de un modelo de ratón de deficiencia acuosa de ojo seco (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-01T14:40:00.000+00:00
Duration: 5 min 21 s
Description: Aprende a establecer un modelo de ratón con deficiencia acuosa de ojo seco mediante la escisión de las glándulas lagrimales extraorbitaria e infraorbitaria. Este método simplificado replica estados patológicos severos como el síndrome de Sjögren.

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Este estudio fue apoyado en parte por los Proyectos Provinciales de Ciencia y Tecnología de Guizhou (QKHJC-ZK[2024]ZD043), el Fondo Provincial de Ciencia de Fujian para Jóvenes Académicos Distinguidos (2023J06053 [a S.O]), la Fundación de Ciencias Naturales de China (No.82101084 [a S.O.] y el Consejo de Becas de China (CSC, 202306310049 [a Y.W.]).

En este estudio se utilizaron ratones hembra C57BL/6 (C57), de 7-8 semanas de edad. Todos los procedimientos se adhirieron a las directrices de ARVO para el uso de animales en la investigación oftálmica y de la visión y fueron aprobados por el Comité de Ética Animal de la Universidad Médica de Guizhou (Aprobación Nº 2305193). No se observaron lesiones en la superficie ocular en el examen con lámpara de hendidura.
1. Pasos preoperatorios
<ol>
	<li>Esterilice los instrumentos con un esterilizador rápido: portaagujas, una aguja de sutura 5-0 con hilo, tijeras quirúrgicas oftálmicas y fórceps.</li>
	<li>Anestesiar al ratón con Avertin al 1,25% mediante inyección intraperitoneal a una dosis de 0,3 mL/100 g.</li>
	<li>Una vez completada la anestesia, coloque el ratón en la posición de decúbito lateral y retire el vello de la zona quirúrgica. Administrar meloxicam 20 mg/kg por vía intraperitoneal 30 min preoperatoriamente, con dosis posteriores cada 8 h postoperatoria.</li>
	<li>Desinfectar el campo quirúrgico con tres aplicaciones alternas de yodóforo y alcohol.</li>
	<li>Establecimiento del modelo de ojo seco
	<ol>
		<li>Coloque el ratón en la posición de decúbito lateral. Exponga el área quirúrgica bajo un microscopio quirúrgico.</li>
		<li>Confirme la profundidad de la anestesia mediante un pellizco en el dedo del pie antes de realizar la incisión. Sujete la piel del lado derecho de la cara del ratón con pinzas dentadas y haga una incisión en el punto medio de la línea que intersecta la aurícula externa y la línea mandibular hasta la esquina interna del ojo. Exponer el tejido muscular; retire el ELG ubicado en el músculo con cuidado.</li>
		<li>Extienda la incisión cutánea hasta la esquina interna del ojo, separe sin rodeos el músculo y ubique la glándula de color rojo claro debajo del músculo. Despegue y retire el ILG.</li>
		<li>Suturar la incisión con una sutura de nailon 5-0 preesterilizada con una aguja adjunta con la ayuda de un portaagujas, tijeras quirúrgicas oftálmicas y fórceps.</li>
		<li>Aplique ungüento de ofloxacino al final de la operación para prevenir la infección.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Después de retirar el ELG y el ILG unilaterales, coloque a los ratones en un entorno con un ciclo rítmico de luz-oscuridad de 12:12 h con libre acceso a alimentos y agua. Esto crea un modelo de ojo seco unilateral, mientras que el ojo contralateral con glándulas lagrimales internas y externas sirve como el grupo de control normal.</li>
</ol>
2. Medición de la producción de lágrimas
<ol>
	<li>Anestesiar al ratón con Avertin al 1,25% por vía intraperitoneal a una dosis de 0,3 mL/100 g.</li>
	<li>Realice la medición de la secreción lagrimal utilizando hilos rojos de fenol bien empaquetados y esterilizados comercialmente bajo anestesia general.</li>
	<li>Tire suavemente hacia abajo del párpado inferior para medirlo. Coloque la parte superior del hilo rojo fenol en los tercios interno y externo del párpado inferior, iniciando el temporizador rápidamente.</li>
	<li>Realice la prueba en un ojo a la vez durante 15 s.</li>
	<li>Después del tiempo asignado, retraiga con cuidado el párpado inferior y retire el hilo rojo fenol hacia abajo con precaución.</li>
	<li>Utilice la escala provista en la bolsa exterior del hilo rojo fenol para medir desde la parte superior del hilo hasta la totalidad de la porción roja.</li>
	<li>Emplee un cronómetro electrónico para registrar con precisión la duración de la prueba.</li>
</ol>
3. Preparación de cortes de tejido congelado
<ol>
	<li>Realizar una luxación cervical rápida en los ratones después de la asfixia con CO2.</li>
	<li>Utilice tijeras y pinzas para extraer cuidadosamente los globos oculares.</li>
	<li>Incruste los globos oculares en un compuesto de temperatura de corte óptima y utilice un micrótomo congelado para obtener cortes de tejido congelado de 5-7 μm de grosor28.</li>
	<li>Guarde todos los portaobjetos en una caja de muestras a temperatura ambiente durante aproximadamente 30 minutos. Posteriormente, transfiéralos a un congelador de temperatura ultrabaja a -80 °C.</li>
</ol>
4. Tinción de hematoxilina y eosina (H&E)
<ol>
	<li>Retire las rodajas de pañuelo congeladas del congelador de temperatura ultrabaja, colóquelas planas en una caja de pañuelos y séquelas en una campana extractora.</li>
	<li>Lave las rodajas con 1x PBS, cubra durante 5 minutos y luego retire el PBS. Cubra la muestra con paraformaldehído al 4%, asegurándose de que la tapa esté cerrada para evitar la evaporación. Después de 15 minutos a temperatura ambiente, enjuague las muestras durante 3 x 5 minutos en 1x PBS.</li>
	<li>Coloque la muestra en una rejilla y sumérjala en colorante de hematoxilina al 0,5% durante 5 min.</li>
	<li>Enjuague la muestra con agua del grifo durante 5 minutos para eliminar el exceso de tinte. Posteriormente, sumergirlo en alcohol de ácido clorhídrico al 0,1% durante 1-2 s para facilitar la diferenciación.</li>
	<li>Coloque el portamuestras en agua del grifo durante 15 minutos para eliminar las manchas inespecíficas.</li>
	<li>Drene el exceso de agua y sumerja la muestra en una solución de tinción de eosina al 0,05% durante 3 min.</li>
	<li>Lave la muestra con agua del grifo y sumérjala secuencialmente en 75%, 80%, 95% y dos rondas de alcohol al 100% durante 2 minutos cada una.</li>
	<li>Sumerja el portamuestras en dos rondas de xileno durante 2 minutos cada una.</li>
	<li>Coloque el soporte en una campana extractora para que se seque y monte la muestra con medio de montaje, evitando daños y burbujas.</li>
	<li>Guarde las muestras teñidas en una caja a temperatura ambiente y fotografíelas con un sistema de biomicrografía.</li>
</ol>
5. Tinción de inmunofluorescencia
<ol>
	<li>Saca la muestra del congelador, colócala en la caja y sécala en la campana.</li>
	<li>Lave la muestra con 1x PBS, cubra durante 5 minutos y aspire el exceso de líquido. Cubra la muestra con paraformaldehído al 4%, agregue agua a la caja húmeda inmunohistoquímica y cierre la tapa para evitar la evaporación. Déjalo reposar a temperatura ambiente durante 15 min; luego, enjuague la muestra 3 x 5 min en 1x PBS. 
	NOTA: Manipule el espécimen con cuidado durante este proceso.</li>
	<li>Retire el exceso de PBS de la superficie de la muestra y limpie suavemente el líquido residual alrededor de la sección de tejido con papel de filtro. Cubra la superficie de la muestra con una solución de permeabilización celular (Triton X-100 al 0,2%) e incube a temperatura ambiente durante 20 minutos para permeabilizar la membrana.</li>
	<li>Retire la solución de permeabilización y enjuague la muestra 3 x 5 min con 1x PBS.</li>
	<li>Vierta el PBS de la superficie de la muestra y limpie suavemente el líquido residual alrededor de la sección de pañuelo con papel de filtro. Cubra la muestra con una solución de bloqueo precalentada (2% BSA). Cierre la tapa para evitar la evaporación e incube a temperatura ambiente durante 1 h.</li>
	<li>Durante el proceso de bloqueo, seleccione el anticuerpo apropiado de acuerdo con las necesidades experimentales, prepare el anticuerpo primario con diluyente de anticuerpos inmunofluorescentes (1% BSA) de acuerdo con la proporción recomendada y centrifugue el anticuerpo primario preparado en una centrífuga de 4 °C a 2,000 × g, 10 min. 
	NOTA: Todos los anteriores se operan en hielo o a bajas temperaturas. Se recomienda utilizar unos 120 μL de anticuerpo primario por muestra.</li>
	<li>Deseche o vierta el anticuerpo primario. Lave la muestra 3 x 10 min con 1x tampón PBS. Después de verter el PBS, enjuague la muestra con 1x PBS fresco. Asegúrese de que el PBS cubra el portaobjetos durante el primer enjuague.</li>
	<li>Mientras se enjuaga el anticuerpo primario, seleccione el anticuerpo secundario adecuado en función de su categoría. Dilúyalo con diluyente BSA al 1% en una proporción de 1:300. Centrifugar el anticuerpo preparado a 4 °C, 2 000 × g durante 10 min. Realice todo el proceso en hielo o a baja temperatura en la oscuridad.</li>
	<li>Enjuague el portaobjetos con PBS, limpie suavemente el líquido alrededor de la muestra con papel de filtro, use una bomba de succión para absorber el líquido restante y agregue rápidamente el anticuerpo secundario preparado a la muestra. Cúbrelo e incuba a temperatura ambiente durante 1 h. Asegúrese de que todos los procesos se lleven a cabo en la oscuridad.</li>
	<li>Deseche el anticuerpo secundario, enjuague con 1 tampón PBS y lave 3 x 10 min. Asegúrese de que el PBS cubra completamente el portaobjetos. Manipule la muestra con cuidado para evitar enjuagarla.</li>
	<li>Vierta el 1x PBS, limpie el exceso de líquido con papel de filtro, use una bomba de succión para eliminar cualquier líquido restante y monte la muestra con un medio de montaje que contenga DAPI. Coloque la tapa en la placa deslizante y guárdela en un congelador a 4° C, protegida de la luz con papel de aluminio. Tenga cuidado de evitar dañar la muestra y crear burbujas de aire.</li>
	<li>Fotografíe la muestra teñida utilizando un sistema de microscopio láser confocal o de fluorescencia vertical. Asegúrese de que las imágenes se realicen dentro de una semana para evitar el apagado de la fluorescencia.</li>
</ol>
6. Extracción de ARNm corneal
<ol>
	<li>Realizar una luxación cervical rápida en los ratones después de la asfixia con CO2. Luego, utilice tijeras y fórceps para extraer cuidadosamente los globos oculares, lávelos 3 veces en 1x PBS y coloque el globo ocular en una placa de Petri que contenga 1x PBS.</li>
	<li>Bajo el microscopio, utilice tijeras y pinzas para cortar el globo ocular desde el polo posterior del globo ocular para separar el cristalino. Limpie el exceso de esclerótica e iris, pero deje la esclerótica blanca de 0,5 mm y toda la córnea. Extraiga el ARNm de los globos oculares del ratón utilizando un kit de extracción de ARN de acuerdo con las instrucciones.</li>
</ol>
7. PCR de transcripción inversa
<ol>
	<li>Antes de realizar la transcripción inversa, determine la concentración de ARN con un espectrofotómetro UV.</li>
	<li>Tome 1 mg de ARN en función de la concentración de ARN medida. Realice la reacción de transcripción inversa utilizando un kit de transcripción inversa.</li>
	<li>Después de agregar los componentes de la reacción, agregue la mezcla a un tubo de centrífuga de 200 μL, mezcle agitando suavemente, centrifugue a baja velocidad para evitar burbujas de aire e inmediatamente colóquelo en un termociclador normal para la reacción.</li>
	<li>Analice el ADNc del proceso de transcripción inversa directamente por PCR en tiempo real o guárdelo en un congelador de -20 °C.</li>
</ol>
8. Reacciones cuantitativas de PCR en tiempo real (qRT-PCR)
<ol>
	<li>Configure un sistema de reacción de 10 μL de acuerdo con las instrucciones proporcionadas con el kit de PCR en tiempo real29: 3,6 μL de agua tratada con DEPC, cebador de sentido 0,2 μM, cebador antisentido 0,2 μM, 1 μL de ADNc, 5 μL de mezcla. Consulte la Tabla 1 para obtener detalles sobre los cebadores.</li>
	<li>Dependiendo del grupo de experimentos, agregue el sistema de reacción a una placa de 96 pocillos o un tubo de ocho tiras dedicado a qRT-PCR. Una vez configurado el sistema qRT-PCR, asegúrese de que la mezcla esté bien mezclada y utilice una centrífuga de mesa para una centrifugación breve para sacudir el líquido de la pared del tubo. Compruebe siempre si hay burbujas de aire en el tubo antes de la qRT-PCR.</li>
	<li>Realice la reacción por triplicado y calcule el Ct medio (umbral de ciclo).</li>
</ol>

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<li>Mcnamara, N. A., Gallup, M., Porco, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishing+pax6+as+a+biomarker+to+detect+early+loss+of+ocular+phenotype+in+human+patients+with+sjogren%27s+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Establishing pax6 as a biomarker to detect early loss of ocular phenotype in human patients with sjogren's syndrome.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (11), 7079-7084 (2014).</li>
<li>Thacker, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Benzalkonium+chloride-induced+dry+eye+disease+animal+models%3A+Current+understanding+and+potential+for+translational+research%5BTitle%5D)+AND+%22Indian+J+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Benzalkonium chloride-induced dry eye disease animal models: Current understanding and potential for translational research.</a> Indian J Ophthalmol. 71 (4), 1256-1262 (2023).</li>
<li>Singh, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developing+a+model+for+aqueous+deficient+dry+eye+secondary+to+periglandular+cicatrizing+conjunctivitis%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Developing a model for aqueous deficient dry eye secondary to periglandular cicatrizing conjunctivitis.</a> Exp Eye Res. 244, 109949(2024).</li>
<li>Singh, S., Sharma, S., Basu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rabbit+models+of+dry+eye+disease%3A+Current+understanding+and+unmet+needs+for+translational+research%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Rabbit models of dry eye disease: Current understanding and unmet needs for translational research.</a> Exp Eye Res. 206, 108538(2021).</li>
</ol>

Los autores no tienen conflictos de intereses que divulgar.

Establecimos con éxito un modelo de ratón de enfermedad del ojo seco por deficiencia acuosa mediante la extirpación quirúrgica tanto del ELG como del ILG, con el objetivo de investigar los cambios en la superficie ocular en condiciones de enfermedad del ojo seco por deficiencia acuosa. Documentamos meticulosamente las alteraciones morfológicas y fisiológicas observadas en este modelo de ratón de ojo seco como resultado de la doble escisión del ELG y el ILG. Dos semanas después del modelado, observamos y muestreamos el mo...

El ojo seco se ha convertido en la enfermedad de la superficie ocular más común en todo el mundo, con un estimado del 5% al 50% de la población que padece la enfermedad1. La sequedad ocular y las molestias causadas por el ojo seco, si persisten, pueden provocar alteraciones visuales y películas lagrimales inestables, lo que provoca daños en la superficie ocular2. Algunos pacientes con ojo seco pueden incluso sufrir de dolor crónico2.
Según el Consenso sobre el Ojo Seco de TFOS DEWS II de 2017, el ojo seco es una afección compleja que involucra múltiples factores y se caracteriza por la alteración del equilibrio natural de la película lagrimal. Esta condición se acompaña de una variedad de síntomas oculares, inestabilidad de la película lagrimal, aumento de la osmolaridad de las lágrimas, inflamación y daño a la superficie ocular y dolor neuropático, que son cruciales para comprender la progresión de la enfermedad3. En este ciclo de retroalimentación, el ojo seco puede causar daño a las células epiteliales de la córnea, disminuir el grosor del estroma corneal y la densidad de las células endoteliales, desencadenar la activación y agregación de las células inmunitarias en la superficie de la córnea, reducir la secreción de mucina por las células caliciformes y causar disfunción inmunitaria en la glándula lagrimal, exacerbando aún más la condición4,5,6,7,8,9,10. El consenso delinea tres formas principales de síndrome de ojo seco: ojo seco por deficiencia acuosa, ojo seco evaporativo y una combinación de ambos, conocida como ojo seco mixto3. La deficiencia acuosa de ojo seco se asocia con cambios estructurales y funcionales en las glándulas lagrimales11. Estas alteraciones incluyen atrofia acinar, oclusión ductal que bloquea el flujo de lágrimas, infiltración de linfocitos que indica una respuesta inmune y una reducción en la secreción de proteínas que son esenciales para mantener la salud y la estabilidad de la película lagrimal12,13.
La glándula lagrimal es una glándula exocrina tubular que es responsable de la producción de componentes de agua en la película lagrimal13,14, incluyendo agua, electrolitos y proteínas, y contribuye al mantenimiento de la estabilidad del microambiente de la superficie ocular15,16. La salud y la claridad visual del ojo dependen de la presencia de la película lagrimal, que forma una capa óptica crítica en la superficie de la córnea, lo que garantiza una lubricación suave de la córnea y la conjuntiva17. La película lagrimal promueve la actividad metabólica de las células de la superficie ocular y actúa como limpiador, eliminando eficazmente las impurezas y los posibles irritantes de la superficie ocular, manteniendo así el equilibrio fisiológico y la comodidad del ojo18,19.
En roedores, como ratas y ratones, las glándulas lagrimales constan de dos lóbulos: el lóbulo orbital interno y externo. El lóbulo orbitario externo se encuentra debajo de la oreja y su parte funcional está conectada al ojo por un conducto extendido. Este conducto se acopla con el lóbulo de la glándula lagrimal en la órbita antes de llegar al ojo y está involucrado en la producción de lágrimas20. El lóbulo orbitario interno, también conocido como glándula lagrimal intraorbitaria, se encuentra debajo de la conjuntiva bulbar del canto externo. El ILG es más pequeño que el ELG. El deterioro de la función de la glándula lagrimal puede provocar un ojo seco por deficiencia acuosa, que, si no se trata, puede progresar a úlceras corneales y pérdida de visión21.
Los modelos animales de ojo seco por deficiencia acuosa se pueden clasificar en tres métodos de intervención: modelos de inducción quirúrgica, modelos inducidos por fármacos y modelos transgénicos. El modelo de inducción quirúrgica consiste en la extirpación del ELG. Sin embargo, este modelo no es estable debido a la presencia de ILG22. La inyección sistémica del bloqueador de receptores colinérgicos escopolamina es común en el modelo inducido por fármacos23. Las aplicaciones tópicas de atropina24 y cloruro de benzalconio25 también pueden reducir la secreción de mucina y lágrimas. La concanavalina-A puede inyectarse localmente en las glándulas lagrimales del conejo para causar adenitis lagrimal inmunitaria, estableciendo así un modelo de deficiencia acuosa de ojo seco26. Además, los animales transgénicos, como NOD, Aly/aly, NFS/sld, IQI/Jic, Id3 KO y otras cepas de ratones, pueden imitar los síntomas y fenotipos del síndrome de Sjögren primario27 para replicar el ojo seco por deficiencia acuosa.
En este estudio, el diseño experimental central implicó un procedimiento quirúrgico para extirpar de forma indolora y precisa el ELG y el ILG del ratón. Estas glándulas lagrimales son esenciales para mantener la humedad y la lubricación de los ojos; Su eliminación da como resultado una reducción significativa de la secreción de lágrimas, imitando la deficiencia acuosa del ojo seco en ratones. Este enfoque permite la observación y el análisis del comportamiento de los ratones, las respuestas fisiológicas y los cambios en el tejido ocular en el estado del ojo seco, proporcionando una base experimental clave para los estudios de patología y la evaluación de las opciones de tratamiento para la enfermedad del ojo seco.

<table><tbody><tr><td>Jeringa de 10 mL</td><td>Zhejiang KDL Medical Devices Co., Ltd. China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>5-0 Aguja de sutura</td><td>Suzhou 66 Vision Co., Ltd. China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Etanol absoluto</td><td>Shanghai Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd., China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488, Burro anti ratón IgG</td><td>Invitrogen</td><td>811493</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594, Burro anti conejo IgG</td><td>Invitrogen</td><td>A21207</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Queratina 12 anticuerpo EPR17882</td><td>Abcam</td><td>ab185627</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo Anti-PAX6</td><td>Abcam</td><td>ab5790</td><td></td></tr><tr><td>Autoclave</td><td>Hirayama. Japón</td><td></td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6 ratón</td><td>Shanghai Slack Laboratory Animal Co., Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga a temperatura ambiente</td><td>Eppendorf. Alemania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ddH2O</td><td>Shanghai Bioengineering Co., Ltd. China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Balanzas electrónicas Shanghai</td><td>Auhaus Biotech Co., Ltd. China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sistema de micrografía de contraste de fase invertida con fluorescencia</td><td>TE-2000U, Nikon. Japón</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Congele el casete</td><td>Jiangsu Shitai Experimental Equipment Co., Ltd. China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Congele la cuchilla de corte</td><td>Xiamen Taijing Biotechnology Co., Ltd. China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>H-1200 con medio de montaje DAPI</td><td>Xiamen Juin Biotechnology Co., Ltd. Medio de montaje de China</td><td></td><td>que contiene DAPI</td></tr><tr><td>H-5000 Vector de montaje de tabletas</td><td>. Medio</td><td>de montaje</td>de EE. UU<td></td></tr><tr><td>. HCl Shanghai</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd., China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kit de tinción de hematoxilina-eosina</td><td>Auragene. Anticuerpo</td> de yodo Ki-67 de EE. UU<td></td><td></td></tr>. <tr><td></td><td>Abcam</td><td>ab16667</td><td></td></tr><tr><td>nitrógeno líquido</td><td>Xiamen Yidong Gas Co., Ltd. China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Soporte de aguja microscópica</td><td>Suzhou 66 Vision Co., Ltd. China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pinzas dentadas microscópicas</td><td>Suzhou 66 Vision Co., Ltd. China</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td> Microscópica <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> pinzas sin dientes</td><td>Suzhou 66 Vision Co., Ltd. China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Modelo 3050 cortadora de hielo</td><td>Leica, Deerfield, IL. EE. UU</td><td></td><td></td>.</tr><tr><td>OCT</td><td>Shanghai Maokang Biotechnology Co., Ltd. China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ungüento</td><td></td><td></td><td></td>de ofloxacina</tr><tr><td>Tiras reactivas de fluoresceína sódica oftálmica</td><td>Tianjin Jingming New Technology Development Co., Ltd. China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehído en polvo</td><td>Sigma. EE. UU</td><td></td><td></td></tr>. <tr><td>PBS Hilo</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>de</td><td></td><td></td><td></td></tr> algodón rojo fenol <tr><td>Esterilizador rápido esterilizador</td><td>Suzhou 66 Vision Co., Ltd. China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Proteína SPRR1b humana recombinante &nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab167925</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga refrigerada de sobremesa</td><td>Eppendorf. Alemania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Soportes</td><td></td><td></td><td></td>deslizantes</tr><tr><td>Lámpara de hendidura</td><td>Topcon. Japón</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Caja</td><td>de muestras Lambolide (Fuzhou) Biotechnology Co., Ltd. China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tert-Amyl alcohol</td><td>Shanghai. Macklin Biochemical, China</td><td>A800283</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>Tribromoetanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma. Congelador</td> de ultra baja temperatura EE. UU<td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>. Thermo Fisher Scientific. USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micrografía de fluorescencia vertical</td><td>Leica DM2500. Sistema</td> de biomicrografía normal vertical de EE. UU<td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>. Eclipse 50i, Nikon. Japón</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Xileno</td><td>Shanghái Sinopharm Reactivo Químico Co., Ltd., China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopio quirúrgico Zeiss VISU150</td><td>, Carl ZEISS. Alemania</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

establecimiento de un modelo de ratón de deficiencia acuosa de ojo seco

Establishment of A Mouse Model of Aqueous Deficiency Dry Eye

La enfermedad del ojo seco es una afección prevalente que afecta al 5%-50% de la población mundial. Las investigaciones de modelos animales desempeñan un papel crucial en la comprensión de sus mecanismos subyacentes. Por lo tanto, desarrollamos un modelo de ratón de enfermedad del ojo seco mediante la extirpación quirúrgica tanto de las glándulas lagrimales extraorbitarias (ELG) como de las glándulas lagrimales intraorbitarias (ILG) para investigar la patología de la superficie ocular en el contexto del ojo seco por deficiencia acuosa. Dos semanas después de la operación, los ratones mostraron manifestaciones graves de ojo seco, incluyendo reducción de la secreción de lágrimas, irregularidades epiteliales corneales, tinción positiva con fluoresceína sódica y neovascularización. El examen histológico mediante tinción con hematoxilina y eosina reveló infiltración de células inflamatorias y displasia del epitelio corneal. La tinción con inmunofluorescencia y la reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa cuantitativa revelaron una disminución de la expresión de los biomarcadores epiteliales corneales normales K12 y Pax6 y un aumento de la expresión de Sprr1b en el epitelio corneal. Estas manifestaciones oculares indicaron una diferenciación epitelial corneal anormal. Además, la tinción con inmunofluorescencia de Ki67 reveló el aumento de la proliferación celular. En conclusión, el modelo de escisión de ELG más ILG demostró ser adecuado para estudiar los cambios en la superficie ocular y dilucidar los mecanismos subyacentes al ojo seco por deficiencia acuosa.

Para investigar los efectos y los mecanismos subyacentes de la sequedad ocular por deficiencia acuosa en la superficie ocular, establecimos un modelo murino de sequedad ocular por deficiencia acuosa mediante la extirpación quirúrgica tanto de la GLP como de la GLI (Figura 1A). Tras un período de 2 semanas posteriores a la resección de las glándulas lagrimales, la secreción lagrimal en los ratones con ojo seco (tras la eliminación de las glándulas lagrimales) disminuyó notablemente en compara...

Aquí, presentamos un método para establecer un modelo de ratón de ojo seco acuoso-deficiente mediante la extirpación de las glándulas lagrimales extraorbitarias e infraorbitarias y evaluar los cambios en la superficie ocular en el ojo seco por deficiencia acuosa.

Establecimiento de un modelo de ratón de deficiencia acuosa de ojo seco

Dry eye disease is a prevalent condition affecting 5%-50% of the global population. Animal model investigations play a crucial role in understanding its ...

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Research

Investigación

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Este video muestra una técnica para inducir la enfermedad crónica experimental autoinmune del ojo seco en ratas. Al inyectar una emulsión adyuvante de antígenos que contiene autoantígenos y antígenos extraños en una rata a intervalos predefinidos, se induce una inflamación ocular crónica en la rata inmunizada inyectando los mismos antígenos en los tejidos de la superficie ocular.

Una técnica para inducir el ojo seco autoinmune crónico experimental en ratas

Sin usar anestesia, inyecte la emulsión por vía subcutánea en la base de las colas de rata. Luego, el día 14 de manera similar, inyecte 200 microlitros del mismo antígeno y el adyuvante de Freund incompleto. El mismo día, inyecte intraperitonealmente 300 nanogramos de toxina pertussis en 100 microlitros de PBS.

Este video muestra un método para evaluar la suavidad de la córnea y la estabilidad de la película lagrimal en un modelo de rata autoinmune. Destaca el impacto de la disfunción de la glándula en la estabilidad de la película lagrimal, crucial para comprender la enfermedad del ojo seco.

Evaluación de la suavidad de la córnea y la lágrima en un modelo autoinmune de rata de ojo seco

El siguiente artículo proporciona una técnica sencilla, reproducible para crear efectivamente un modelo sostenible de ratón de la insuficiencia límbica (SIL). Este modelo animal es útil para probar y comparar la eficacia de los tratamientos para las enfermedades de las células madre del limbo.

Un procedimiento mecánico simple de crear deficiencia de células madre limbares en ratón

Este informe describe un método para inducir ojo seco autoinmune crónico en ratas Lewis mediante inmunización con una emulsión de extracto de glándula lacrimal de rata, ovoalbúmina y adyuvante completo de Freund, seguido de la inyección de extracto de glándula lagrimal y ovoalbúmina en la subconjuntiva forniceal y glándulas lacrimales Seis semanas después.

Un modelo de rata ocular seca autoinmune crónica con aumento de células T de memoria efector en tejido de globo ocular

Este artículo describe el desarrollo de un método para inducir la enfermedad aguda o crónica del ojo seco en conejos mediante la inyección de concanavalina A a todas las porciones del sistema de glándulas lagrimales orbitales. Este método, superior a los ya reportados, genera un modelo reproducible y estable de ojo seco adecuado para el estudio de agentes farmacológicos.

Un modelo de conejo de enfermedad ocular seca acuosa-deficiente inducida por la inyección de Concanavalin A en las glándulas lagrimales: Aplicación a estudios de eficacia de fármacos

Se presenta un enfoque novedoso para inducir la enfermedad crónica del ojo seco en los conejos mediante la extirpación quirúrgica de todas las glándulas lagrimales orbitales. Este método, distinto de los reportados anteriormente, produce un modelo estable y reproducible de ojo seco deficiente acuoso adecuado para estudiar fisiología lagrimal y fisiopatología y terapia ocular.

Establecimiento de un modelo de ojos secos severos mediante dacrioadenectomía completa en conejos

Aquí, establecemos un modelo de rata de disfunción de la glándula lagrimal para proporcionar una base para el estudio del ojo seco con deficiencia acuosa.

Un modelo de ojo seco de rata con disfunción de la glándula lagrimal inducida por escopolamina

La córnea es la única que carece de los tejidos vasculares. Sin embargo, el fuerte crecimiento de los vasos sanguíneos y la supervivencia puede ser inducida en la córnea por potentes factores angiogénicos. Por lo tanto, la córnea puede dar con nosotros en una herramienta valiosa para los estudios de angiogénesis. Este protocolo muestra cómo realizar el modelo de ratón de ensayo de córnea bolsillo y la forma de evaluar la angiogénesis inducida por factores angiogénicos utilizando este modelo.

Un modelo de ratón de la Prueba de bolsillo para el Estudio de la angiogénesis de córnea

Aprende a establecer un modelo de ratón con deficiencia acuosa de ojo seco mediante la escisión de las glándulas lagrimales extraorbitaria e infraorbitaria. Este método simplificado replica estados patológicos severos como el síndrome de Sjögren.

Establecimiento de un modelo de ratón de deficiencia acuosa de ojo seco

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