Realización de un cribado de knockout CRISPR en todo el genoma in vitro en células T receptoras de antígenos quiméricos

La terapia de células T con CAR es un tipo innovador de inmunoterapia contra el cáncer que ha llevado a remisiones que duran más de una década. Sin embargo, las tasas de respuestas duraderas siguen siendo limitadas. Con este protocolo, nuestro objetivo es mejorar nuestra comprensión de los mecanismos detrás de la resistencia y crear herramientas para mejorar la respuesta a la terapia de células T con CAR.

Actualmente se están empleando muchos enfoques para mejorar la terapia de células T con CAR, incluidas las terapias combinadas y la optimización del diseño de CAR. Sin embargo, debido a la creciente evidencia de que el perfil epigenético de los productos de células T con CAR antes de la infusión es una respuesta determinante importante, las tecnologías de edición genética se han convertido en herramientas populares.

La edición genómica de las células T con CAR ha demostrado éxito en la prevención de toxicidades y el aumento de la expansión y persistencia de las células T con CAR en estudios preclínicos y clínicos. Nuestro protocolo para una pantalla de eliminación de CRISPR en todo el genoma proporciona un enfoque eficiente e imparcial para determinar las mejores ediciones genéticas para mejorar la función de las células T con CAR.

Las perturbaciones genéticas de todo el genoma requieren condiciones de selección adecuadas y a gran escala para ser efectivas. Para estudiar el desarrollo del agotamiento de las células T con CAR, aprendimos que debemos estimular más de 80 millones de células T con CAR durante dos semanas para seleccionar las ediciones genéticas óptimas.

Si bien nuestro protocolo fue diseñado para evaluar el desarrollo del agotamiento, este protocolo se puede ajustar para evaluar el desarrollo de otros mecanismos de resistencia. Al completar las pruebas de detección de todo el genoma en diferentes entornos, es posible que eventualmente determinemos las mejores ediciones para mejorar las respuestas generales a la terapia de células T con CAR.

[Narrador] Después de transducir las células T con CAR con la biblioteca CRISPR, centrifugar las muestras a 300 g durante cinco minutos a 4 grados centígrados para lavarlas. Aspirar el sobrenadante y resuspender las muestras en 20 mililitros de medio de células T. Para preservar las muestras para la secuenciación de próxima generación, alícuotas suficientes células T con CAR en un tubo cónico de 50 mililitros para mantener una representación de ARN guía de 500 células por ARN guía. Centrifugar la muestra a 300 g durante cinco minutos a 4 grados centígrados. Luego vuelva a suspender el gránulo celular en un mililitro de PBS y transfiéralo a un tubo de microcentrífuga de dos mililitros. Lave el tubo cónico de 50 mililitros con un mililitro de PBS y transfiera el lavado al mismo tubo de microcentrífuga. A continuación, centrifugar las muestras a 500 g durante cinco minutos a 4 grados centígrados. Retire el sobrenadante y almacene los gránulos celulares a -20 grados centígrados. Para iniciar el cocultivo, agregue células T con CAR a células JeKo-1 CD19 positivas en una proporción de uno a uno. Lleve el volumen total del cocultivo a 160 mililitros con medio de células T y almacene las muestras en una incubadora a 37 grados centígrados con 5% de dióxido de carbono. Para volver a estimular las células T con CAR, recoja los cocultivos en tubos cónicos de 50 mililitros y centrifugue las muestras a 300 g durante cinco minutos a 4 grados centígrados. Vuelva a suspender cada muestra en 80 mililitros de medio de células T y agregue 80 veces 10 a la potencia de seis células JeKo-1 en 80 mililitros de medio de células T. Almacene las muestras en una incubadora a 37 grados centígrados con dióxido de carbono al 5%. El día 15, para aislar las células T con CAR del cocultivo, primero cuente las células. Combine un kit de selección positiva para células T CD4 positivas con un kit de selección positiva para células T CD8 positivas para aislar células T de los cocultivos CAR T JeKo-1. Luego cuente las células T aisladas. Para preservar las muestras para la secuenciación de próxima generación, alícuotas 33 veces 10 a la potencia de seis células T con CAR en un tubo cónico de 50 mililitros y centrifugue la muestra a 300 g durante cinco minutos a 4 grados Celsius. Vuelva a suspender el sedimento celular en un mililitro de PBS y transfiéralo a un tubo de microcentrífuga de dos mililitros. Luego lave el tubo cónico de 50 mililitros con un mililitro de PBS y transfiera el lavado al mismo tubo de microcentrífuga. Después de centrifugar las muestras y eliminar el sobrenadante, almacene los gránulos celulares a -20 grados centígrados. Para comenzar, aísle el ADN genómico de los gránulos de células T con CAR congelados utilizando un kit de aislamiento de ADN genómico. Purifique el ADN genómico aislado a través de la precipitación de etanol enfriando primero el etanol al 100% a -20 grados Celsius. Alícuota el ADN eluido por igual en varios tubos de microcentrífuga, asegurándose de que cada alícuota sea de 200 a 250 microlitros. Agregue dos volúmenes de etanol 100% preenfriado, 0,1 volumen de acetato de sodio de tres molares y un microlitro de 20 miligramos por mililitro de glucógeno. Incube las muestras durante la noche a -20 grados centígrados. El segundo día, centrifugar las muestras a 13.000 g durante 20 minutos para granular el ADN precipitado. Retire el sobrenadante y lave los gránulos con un mililitro de etanol al 70% centrifugando a 7.500 g durante 10 minutos. Después de secar completamente los gránulos, vuelva a suspenderlos en 50 microlitros de agua estéril. Para preparar el ADN genómico para la secuenciación de próxima generación, configure una PCR con la mezcla de reacción especificada que se muestra aquí. A continuación, realice la PCR utilizando las siguientes condiciones de ciclo. Extraiga las reacciones de PCR para cada muestra y purifique el producto de PCR con un kit de purificación de PCR de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Ejecute tres microgramos del producto de PCR para cada muestra en un gel de agarosa al 2%. Retire el producto de PCR del gel extrayendo el ADN con un kit de extracción de gel de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Almacene las muestras extraídas a -20 grados centígrados.