Name: Realización de un cribado de knockout CRISPR en todo el genoma in vitro en células T receptoras de antígenos quiméricos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-01-31T12:50:00.000+00:00
Duration: 7 min 37 s
Description: Aprende a realizar un cribado de knockout CRISPR en todo el genoma in vitro en células T CAR para investigar mecanismos de resistencia en inmunoterapia contra el cáncer. Este protocolo permite identificar ediciones genéticas óptimas.

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<meta charset="utf8"></head><body>Cribado CRISPR de todo el genoma en células CART para investigar la resistencia a la terapia

<ol><li>Neelapu, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-year+follow-up+supports+curative+potential+of+axicabtagene+ciloleucel+in+refractory+large+B-cell+lymphoma+%28zuma-1%29%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">5-year follow-up supports curative potential of axicabtagene ciloleucel in refractory large B-cell lymphoma (zuma-1).</a> Blood. 141 (19), 2307-2315 (2023).</li>
<li>Neelapu, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axicabtagene+ciloleucel+CAR+T-cell+therapy+in+refractory+large+B-cell+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Axicabtagene ciloleucel CAR T-cell therapy in refractory large B-cell lymphoma.</a> N Engl J Med. 377 (26), 2531-2544 (2017).</li>
<li>Locke, F. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+safety+and+activity+of+axicabtagene+ciloleucel+in+refractory+large+B-cell+lymphoma+%28zuma-1%29%3A+A+single-arm%2C+multicentre%2C+phase+1-2+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Oncol%22%5BJournal%5D)">Long-term safety and activity of axicabtagene ciloleucel in refractory large B-cell lymphoma (zuma-1): A single-arm, multicentre, phase 1-2 trial.</a> Lancet Oncol. 20 (1), 31-42 (2019).</li>
<li>Maude, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tisagenlecleucel+in+children+and+young+adults+with+B-cell+lymphoblastic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Tisagenlecleucel in children and young adults with B-cell lymphoblastic leukemia.</a> N Engl J Med. 378 (5), 439-448 (2018).</li>
<li>Schuster, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tisagenlecleucel+in+adult+relapsed+or+refractory+diffuse+large+B-cell+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Tisagenlecleucel in adult relapsed or refractory diffuse large B-cell lymphoma.</a> N Engl J Med. 380 (1), 45-56 (2018).</li>
<li>Bai, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+antigen-specific+landscape+of+CAR+T+infusion+product+identifies+determinants+of+CD19-positive+relapse+in+patients+with+all%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Adv%22%5BJournal%5D)">Single-cell antigen-specific landscape of CAR T infusion product identifies determinants of CD19-positive relapse in patients with all.</a> Sci Adv. 8 (23), eabj2820(2022).</li>
<li>Fraietta, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determinants+of+response+and+resistance+to+CD19+chimeric+antigen+receptor+%28CAR%29+T+cell+therapy+of+chronic+lymphocytic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Determinants of response and resistance to CD19 chimeric antigen receptor (CAR) T cell therapy of chronic lymphocytic leukemia.</a> Nat Med. 24, 563-571 (2018).</li>
<li>Gennert, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+chromatin+regulatory+landscape+of+human+CAR+T+cell+exhaustion%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Dynamic chromatin regulatory landscape of human CAR T cell exhaustion.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 118 (30), e2104758118(2021).</li>
<li>Deng, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristics+of+anti-CD19+CAR+T+cell+infusion+products+associated+with+efficacy+and+toxicity+in+patients+with+large+B+cell+lymphomas%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Characteristics of anti-CD19 CAR T cell infusion products associated with efficacy and toxicity in patients with large B cell lymphomas.</a> Nat Med. 26 (12), 1878-1887 (2020).</li>
<li>Sterner, R. M., Cox, M. J., Sakemura, R., Kenderian, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+CRISPR%2FCAS9+to+knock+out+GM-CSF+in+CAR-T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Using CRISPR/CAS9 to knock out GM-CSF in CAR-T cells.</a> J Vis Exp. (149), e59629(2019).</li>
<li>Sterner, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GM-CSF+inhibition+reduces+cytokine+release+syndrome+and+neuroinflammation+but+enhances+CAR-T+cell+function+in+xenografts%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">GM-CSF inhibition reduces cytokine release syndrome and neuroinflammation but enhances CAR-T cell function in xenografts.</a> Blood. 133 (7), 697-709 (2019).</li>
<li>Cox, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GM-CSF+disruption+in+CART+cells+modulates+T+cell+activation+and+enhances+CART+cell+anti-tumor+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">GM-CSF disruption in CART cells modulates T cell activation and enhances CART cell anti-tumor activity.</a> Leukemia. 36 (6), 1635-1645 (2022).</li>
<li>Ottaviano, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+1+clinical+trial+of+CRISPR-engineered+CAR19+universal+T+cells+for+treatment+of+children+with+refractory+B+cell+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Phase 1 clinical trial of CRISPR-engineered CAR19 universal T cells for treatment of children with refractory B cell leukemia.</a> Sci Transl Med. 14 (668), eabq3010(2022).</li>
<li>Joung, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-scale+CRISPR-CAS9+knockout+and+transcriptional+activation+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Genome-scale CRISPR-CAS9 knockout and transcriptional activation screening.</a> Nat Protoc. 12, 828-863 (2017).</li>
<li>Mccutcheon, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+and+epigenetic+regulators+of+human+CD8%2B+T+cell+function+identified+through+orthogonal+CRISPR+screens%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Transcriptional and epigenetic regulators of human CD8+ T cell function identified through orthogonal CRISPR screens.</a> Nat Genet. 55, 2211-2223 (2023).</li>
<li>Zhu, W., Kelly, C., Dagur, P., Dunbar, C. E., Cordes, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR+activation+screen+to+optimize+chimeric+antigen+receptor+%28CAR%29+T+cell+immunophenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">CRISPR activation screen to optimize chimeric antigen receptor (CAR) T cell immunophenotype.</a> Blood. 142 (Supplement 1), 4820-4820 (2023).</li>
<li>Wang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR+screening+of+CAR+T+cells+and+cancer+stem+cells+reveals+critical+dependencies+for+cell-based+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discov%22%5BJournal%5D)">CRISPR screening of CAR T cells and cancer stem cells reveals critical dependencies for cell-based therapies.</a> Cancer Discov. 11 (5), 1192-1211 (2021).</li>
<li>Shifrut, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+CRISPR+screens+in+primary+human+T+cells+reveal+key+regulators+of+immune+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Genome-wide CRISPR screens in primary human T cells reveal key regulators of immune function.</a> Cell. 175 (7), 1958-1971.e15 (2018).</li>
<li>Belk, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+crispr+screens+of+T+cell+exhaustion+identify+chromatin+remodeling+factors+that+limit+T+cell+persistence%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Genome-wide crispr screens of T cell exhaustion identify chromatin remodeling factors that limit T cell persistence.</a> Cancer Cell. 40 (7), 768-786.e7 (2022).</li>
<li>Jiang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+ATAC-seq+maps+the+comprehensive+and+dynamic+chromatin+accessibility+landscape+of+CAR-T+cell+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Single-cell ATAC-seq maps the comprehensive and dynamic chromatin accessibility landscape of CAR-T cell dysfunction.</a> Leukemia. 36 (11), 2656-2668 (2022).</li>
<li>Rossi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preinfusion+polyfunctional+anti-CD19+chimeric+antigen+receptor+T+cells+are+associated+with+clinical+outcomes+in+NHL%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Preinfusion polyfunctional anti-CD19 chimeric antigen receptor T cells are associated with clinical outcomes in NHL.</a> Blood. 132 (8), 804-814 (2018).</li>
<li>Beider, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+and+functional+signatures+associated+with+CAR+T+cell+exhaustion+and+impaired+clinical+response+in+patients+with+B+cell+malignancies%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Molecular and functional signatures associated with CAR T cell exhaustion and impaired clinical response in patients with B cell malignancies.</a> Cells. 11 (7), 1140(2022).</li>
<li>Wherry, E. J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((cell+exhaustion%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">cell exhaustion.</a> Nat Immunol. 12, 492-499 (2011).</li>
<li>Prinzing, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deleting+DNMT3A+in+CAR+T+cells+prevents+exhaustion+and+enhances+antitumor+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Deleting DNMT3A in CAR T cells prevents exhaustion and enhances antitumor activity.</a> Sci Transl Med. 13, eabh0272(2021).</li>
<li>Lynn, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C-jun+overexpression+in+CAR+T+cells+induces+exhaustion+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">C-jun overexpression in CAR T cells induces exhaustion resistance.</a> Nature. 576, 293-300 (2019).</li>
<li>Tang, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-beta+inhibition+via+CRISPR+promotes+the+long-term+efficacy+of+CAR+T+cells+against+solid+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">TGF-beta inhibition via CRISPR promotes the long-term efficacy of CAR T cells against solid tumors.</a> JCI Insight. 5 (4), e133977(2020).</li>
<li>Joung, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-scale+CRISPR-CAS9+knockout+and+transcriptional+activation+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Genome-scale CRISPR-CAS9 knockout and transcriptional activation screening.</a> Nat Protoc. 12 (4), 828-863 (2017).</li>
<li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quality+control%2C+modeling%2C+and+visualization+of+CRISPR+screens+with+MAGeCK-VISPR%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Quality control, modeling, and visualization of CRISPR screens with MAGeCK-VISPR.</a> Genome Biol. 16, 281(2015).</li>
<li>Sakemura, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+cancer-associated+fibroblasts+in+the+bone+marrow+prevents+resistance+to+CART-cell+therapy+in+multiple+myeloma%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Targeting cancer-associated fibroblasts in the bone marrow prevents resistance to CART-cell therapy in multiple myeloma.</a> Blood. 139 (26), 3708-3721 (2022).</li>
<li>Stewart, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-4+drives+exhaustion+of+CD8%2B+CART+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">IL-4 drives exhaustion of CD8+ CART cells.</a> Nat Commun. 15 (1), 7921(2024).</li>
<li>FastQC: A quality control tool for high throughput sequence data. , Babraham Bioinformatics. 
 <a target="_blank" href=" https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/"> https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/</a> (2010).</li>
<li>Bbmerge. , 
 <a target="_blank" href=" https://github.com/BioInfoTools/BBMap/blob/master/sh/bbmerge.sh"> https://github.com/BioInfoTools/BBMap/blob/master/sh/bbmerge.sh</a> (2019).</li>
<li>Pattanayak, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+profiling+of+off-target+DNA+cleavage+reveals+RNA-programmed+CAS9+nuclease+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">High-throughput profiling of off-target DNA cleavage reveals RNA-programmed CAS9 nuclease specificity.</a> Nat Biotechnol. 31 (9), 839-843 (2013).</li>
<li>Doench, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rational+design+of+highly+active+sgRNAs+for+CRISPR-CAS9-mediated+gene+inactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Rational design of highly active sgRNAs for CRISPR-CAS9-mediated gene inactivation.</a> Nat Biotechnol. 32 (12), 1262-1267 (2014).</li>
<li>Dong, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+immunotherapy+target+discovery+using+genome-scale+in+vivo+CRISPR+screens+in+CD8+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Systematic immunotherapy target discovery using genome-scale in vivo CRISPR screens in CD8 T cells.</a> Cell. 178 (5), 1189-1204.e23 (2019).</li>
<li>Zhou, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+CRISPR+screens+in+vivo+map+T+cell+fate+regulomes+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single-cell CRISPR screens in vivo map T cell fate regulomes in cancer.</a> Nature. 624 (7990), 154-163 (2023).</li>
<li>Sutra Del Galy, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+genome-wide+CRISPR+screens+identify+SOCS1+as+intrinsic+checkpoint+of+CD4%2B+TH1+cell+response%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Immunol%22%5BJournal%5D)">In vivo genome-wide CRISPR screens identify SOCS1 as intrinsic checkpoint of CD4+ TH1 cell response.</a> Sci Immunol. 6 (66), eabe8219(2021).</li>
<li>Ramos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukemia-intrinsic+determinants+of+CAR-T+response+revealed+by+iterative+in+vivo+genome-wide+CRISPR+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Leukemia-intrinsic determinants of CAR-T response revealed by iterative in vivo genome-wide CRISPR screening.</a> Nat Commun. 14 (1), 8048(2023).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Células 293T</td><td>ATCC</td><td>CRL-3216</td><td>Células utilizadas para la producción de lentivirus</td></tr><tr><td>Proteína de biotinaL Anticuerpo</td><td>GenScript</td><td>M00097</td><td>anticuerpo anti-cadena kappa para la detección de CAR</td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina</td><td>Millipore Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Carbenicilina sal disódica</td><td>Millipore Sigma</td><td>C1389-1G</td><td>Antibiótico carbenicilina</td></tr><tr><td>Aislamiento CD4 Perlas</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-045-101&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Perlas de aislamiento CD8</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-045-201</td><td></td></tr><tr><td>CTS (Sistemas de terapia celular) Dynabeads CD3/CD28</td><td>Gibco</td><td>40203D</td><td></td></tr><tr><td>Cytoflex</td><td>Beckman Coulter</td><td>NC2279958</td><td></td></tr><tr><td>Invitrogen</td><td>de agua libre de ADNasa</td><td>AM9937</td><td></td></tr><tr><td>Medio de águila modificado de Dulbecco (DMEM)</td><td>Corning</td><td>10-017-CV</td><td></td></tr> Kit de aislamiento de células T humanas <tr><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td></td>EasySep de <td>Dulbecco's</td></tr><tr><td></td><td>Buffered</td> Saline Technologies <td>17951RF</td><td>Kit de aislamiento negativo</td></tr><tr><td>Células electrocompetentes Endura&nbsp;</td><td>Biosearch Technologies</td><td>60242-1</td><td>Células electrocompetentes con medio de recuperación</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Millipore Sigma</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino (FBS)</td><td>Corning</td><td>35-010-CV</td><td></td></tr><tr><td>GeCKO v2 CRISPR Knockout Pooled Library A</td><td>AddGene</td><td>1000000048</td><td>CRISPR library plásmido</td></tr><tr><td>Gene Pulser II</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2105</td><td>Electroporator</td></tr><tr><td></td><td>Glucógeno Millipore Sigma</td><td>10901393001</td><td></td></tr><tr><td>JeKo-1</td><td>ATCC</td><td>CRL-3006</td><td>CD19+ células diana&nbsp;</td></tr><tr><td>Reactivo de transfección Lipofectamine 3000</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>L3000075</td><td>Kit de reactivos de transfección con un reactivo de transfección (reactivo Lipofectamine 3000) y un reactivo colipídico neutro (p3000)</td></tr><tr><td>VIVO/MUERTO Aqua</td><td>Invitrogen</td><td>L34966</td><td></td></tr><tr><td>Lymphoprep</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>7851</td><td>Medio de gradiente de densidad</td></tr><tr><td>Machery-Nagel NucleoBond Xtra Maxi Kits</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12748412</td><td>kit de preparación maxi</td></tr><tr><td>NEBNext Alta fidelidad 2X PCR MasterMix</td><td>New England BioLabs</td><td>M0541S</td> Mezcla <td>maestra de PCR de alta fidelidad</td></tr><tr><td>Opti-MEM I Medio sérico reducido</td><td>Gibco</td><td>31985-070</td><td>Medio sérico reducido</td></tr><tr><td>pCMVR8.74</td><td>AddGene</td><td>22036</td><td>Plásmido de empaquetado lentiviral</td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina-glutamina (100X)</td><td>Life Technologies</td><td>10378-016</td><td></td></tr><tr><td>pMD2.G</td><td>AddGene</td><td>12259</td><td>VSV-G que expresa la envoltura del plásmido</td></tr><tr><td>Pooled Human AB Serum&nbsp;</td><td>Investigación innovadora</td><td>ISERABHI</td><td></td></tr><tr><td>Puromicina</td><td>Millipore Sigma</td><td>P8833</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick Kit de extracción de gel</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td>Kit de extracción de Gek</td></tr><tr><td>Qucik-DNA Midiprep Plus Kit</td><td>Zymo Research</td><td>D4075</td><td>Kit utilizado para aislar el ADNg</td></tr><tr><td>RoboSep-S</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>21000</td><td>Separador</td></tr> <tr><td>celular automatizadoRoswell Park Memorial Institute 1640 Medio (RPMI)</td><td>Gibco</td><td>21870092</td><td></td></tr><tr><td>SepMate-50</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>85450</td><td>Tubo de separación de gradiente de densidad</td></tr><tr><td>Acetato de sodio</td><td>Invitrogen</td><td>AM9740</td><td></td></tr><tr><td>Azida de sodio</td><td>Fisher Scientific</td><td>71448-16</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo de estreptavidina (PE)</td><td>BioLegend</td><td>405203</td><td>Anticuerpo secundario utilizado para la detección de CAR</td></tr><tr><td>Termociclador T100</td><td>Ultracentrífuga 1861096</td><td></td><td></td>Bio-Rad</tr><tr><td>(Optima XPN-80)Sistemas de filtro de</td> vacío <td>BeckmanCoulter</td><td>A99839</td><td></td></tr><tr><td>, 0.22 &micro; m</td> Sistemas de filtro de vacío <td>ThermoFisher Scientific</td><td>567-0020</td><td></td></tr><tr><td>, 0.45 &micro; m</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>165-0045</td><td></td></tr><tr><td>X-VIVO 15 Medio de células hematopoyéticas sin suero</td><td>Lonza</td><td>04-418Q</td><td>Medio de células hematopoyéticas</td></tr></tbody></table>

realización de un cribado de knockout crispr en todo el genoma in vitro en células t receptoras de antígenos quiméricos

Performing an In Vitro Genome-Wide CRISPR Knockout Screen in Chimeric Antigen Receptor T Cells

Para interrogar los genes y las vías que se pueden editar para mejorar la actividad de las células CART de manera imparcial, diseñamos una pantalla CRISPR knockout in vitro de todo el genoma (Figura 1). Esta criba tiene dos fases: una fase de producción de celdas CART y una fase de presión selectiva. En la fase de producción de células CART, al menos 110 × 106 células T se aíslan primero de las PBMC de donantes sanos y se activan con perlas CD3+/CD28+</sup...

Realización de un cribado de knockout CRISPR en todo el genoma in vitro en células T receptoras de antígenos quiméricos

Chimeric antigen receptor T (CART) cell therapy is an innovative form of targeted immunotherapy that has revolutionized the treatment of cancer. However, ...

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Research

Investigación

JoVE Journal

Cancer Research

Investigación del cáncer

Este video muestra una técnica para fabricar células T con receptor de antígeno quimérico (CAR) ex vivo. Las células T humanas se incuban con perlas magnéticas recubiertas con anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28, junto con un medio suplementado con interleucina-2 (IL-2), lo que conduce a la activación y proliferación de las células T. Se introducen vectores lentivirales transgénicos, lo que permite que el ARN transgénico se integre en el genoma del huésped y exprese el transgén. Esto da como...

Una técnica ex vivo para fabricar linfocitos T receptores de antígenos quiméricos

Este video muestra una técnica para la generación ex vivo de células T con receptor de antígeno quimérico (CAR) específico de antígeno tumoral. Los vectores retrovirales portadores de ARN transgénico se mezclan con células de bazo en un medio suplementado con interleucina-2 para promover la supervivencia y proliferación de las células T. A continuación, la mezcla se transfiere a una placa recubierta con fragmentos de fibronectina humana recombinante y se centrifuga para facilitar la fusión del...

Una técnica ex vivo para generar células T receptoras de antígenos quiméricos específicos de tumores

Aquí, describimos un método de cultivo in vitro de co para recurrentemente desafío orientada a tumor las células T, que permite el análisis fenotípico y funcional de la actividad de las células T antitumorales.

En Vitro Tumor celular Rechallenge de evaluación predictiva de antígeno quimérico del Receptor de la célula T función antitumoral

La tecnología CRISPR-Cas9 proporciona un método eficiente para editar con precisión el genoma de mamíferos en cualquier tipo de célula y representa un medio novedoso para realizar pantallas genéticas en todo el genoma. Aquí se proporciona un protocolo detallado que analiza los pasos necesarios para el buen rendimiento de las pantallas CRISPR-Cas9 agrupadas para todo el genoma.

Pantallas genéticas basadas en CRISPR en células de mamíferos

Aquí describimos una metodología de detección CRISPR/Cas9 rápida y directa in vivo utilizando inyecciones lentivirales embrionarias de tero guiadas por ultrasonido para evaluar simultáneamente las funciones de varios genes en la piel y la cavidad oral de ratones inmunocompetentntes.

In Vivo CRISPR/Cas9 Screening para evaluar simultáneamente la función génica en la piel del ratón y la cavidad oral

Aquí, presentamos un protocolo para la edición de genes en células T humanas primarias utilizando la tecnología CRISPR Cas para modificar las células CAR-T.

Producción de células CAR-T humanas diseñadas por CRISPR

Este protocolo agiliza la producción de vectores retrovirales y la transducción de células T murinas, lo que facilita la generación eficiente de células CAR-T de ratón.

Generación eficiente de células T con receptor de antígeno quimérico (CAR) murino

Este protocolo proporciona un flujo de trabajo optimizado para generar y probar células T reguladoras del receptor de antígeno quimérico humano (CAR Tregs).

Generación de linfocitos T reguladores del receptor de antígeno quimérico humano

Aquí, describimos un método para crear gotas de doble emulsión que encapsulan una célula T y una célula diana cancerosa para examinar la muerte celular a nivel de una sola célula. Este método permite la cuantificación dual de las moléculas citotóxicas y la apoptosis de las células diana dentro de una gran población de células T.

Ensayo de citotoxicidad basado en gotas para evaluar las células T receptoras de antígenos quiméricos a nivel de una sola célula

Desarrollamos un protocolo optimizado de cribado knockout CRISPR-Cas9 para células CAR T primarias. Al reducir la retención de ADNgDNA mediante la digestión enzimática y la reducción de la extracción de casetes de ARNg, este enfoque minimiza los artefactos de PCR, asegurando una detección precisa de ARNsgDNA y una identificación robusta de dianas génicas funcionales.

Mejorando las pantallas CRISPR-Cas9 en células CAR T: un método refinado para la preparación de bibliotecas

Aprende a realizar un cribado de knockout CRISPR en todo el genoma in vitro en células T CAR para investigar mecanismos de resistencia en inmunoterapia contra el cáncer. Este protocolo permite identificar ediciones genéticas óptimas.

Realización de un cribado de knockout CRISPR en todo el genoma in vitro en células T receptoras de antígenos quiméricos

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