Establecimiento de modelos ortotópicos de xenoinjertos derivados de pacientes para tumores cerebrales utilizando un dispositivo estereotáxico

En mi investigación, nos enfocamos en desarrollar nuevos tratamientos para cánceres cerebrales infantiles agresivos como gliomas difusos de línea media, gliomas de alto grado, ependimomas y ameloblastomas. Nuestro objetivo es encontrar nuevos objetivos farmacológicos y desarrollar terapias que puedan marcar la diferencia en los pacientes, al mismo tiempo que estudiamos cómo estos tumores pueden afectar el entorno cerebral circundante. En la investigación de tumores cerebrales pediátricos, desarrollamos modelos de xenoinjerto derivados de pacientes mediante inyecciones intracraneales, imágenes avanzadas y detección de fármacos de alto rendimiento.

Técnicas como la transcriptómica unicelular y especial nos ayudan a comprender cómo el tumor afecta el entorno cerebral y los efectos del tratamiento, lo que nos permite explorar nuevas terapias. Nuestro grupo de tumores cerebrales en Children's Cancer Institute ha desarrollado muchos modelos pediátricos de pediatría de tumores cerebrales a través del Programa de Medicina Personalizada Zero Childhood Cancer. Se encontró que los gliomas difusos de línea media son resistentes a los tratamientos farmacológicos debido a una barrera hematoencefálica intacta.

Las terapias prometedoras dirigidas a las vías epigenética y oncogénica mejoraron la supervivencia pediátrica y ahora están en desarrollo clínico. Utilizando modelos ortotópicos de tumores cerebrales, nos gustaría comprender cómo los tumores afectan la vasculatura cerebral. Al aplicar técnicas como la transcriptómica especial, nos gustaría identificar las vías afectadas por los tumores cerebrales.

Este conocimiento nos ayudará a identificar moduladores de la barrera hematoencefálica que pueden aflojar la barrera, permitiendo que los tratamientos farmacológicos penetren de manera más efectiva. Para comenzar, descongele las células tumorales cerebrales cultivadas que forman neuroesferas. En una cabina de bioseguridad, pipetee cuidadosamente las células cultivadas y el medio de cultivo del matraz de cultivo de tejidos en un tubo cónico de 50 mililitros con una pipeta serológica.

Centrifugar el tubo cónico a 300 G durante un máximo de cinco minutos a temperatura ambiente. Con una pipeta de 25 mililitros, aspire el medio por encima del gránulo, dejando aproximadamente 0,5 mililitros en el tubo. Pipetea suavemente las células hacia arriba y hacia abajo 10 veces con una pipeta de un mililitro para disociar el sedimento celular.

Agregue azul de tripano a la suspensión celular y cuente con un hemocitómetro. Suspensión de células alícuotas que contiene dos millones de células en un tubo nuevo. Agregue 0,5 mililitros de PBS a la suspensión celular.

Luego centrifugar a 300 G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados. Deseche el sobrenadante y lávese nuevamente. Después del lavado final, aspire la mayor cantidad posible de PBS.

Luego coloque el gránulo celular y 50 microlitros de hidrogel de matriz extracelular en hielo. Mezcle el gránulo celular con el hidrogel de matriz extracelular rápidamente para prepararlo para la inyección intracraneal. Para comenzar, monte un mouse anestesiado en un dispositivo estereotáxico.

Asegúrese de que los dientes frontales estén fijados en la barra incisiva y que el cono de la nariz asegure al animal en su lugar. Desinfecte la cabeza del ratón con una punta de algodón empapada en yodo, seguida de una toallita de isopropanol. Luego aplique ungüento corneal para los ojos en ambos ojos para evitar que se sequen.

Haga una incisión en la base del cerebelo y extiéndala a través del cráneo hasta el punto medio para crear un corte de un centímetro de largo a lo largo de la cara superior del cráneo. Apriete la piel entre las orejas para exponer el cráneo y luego apriete las orejas para asegurar la cabeza. Limpia la superficie del cráneo y sécala bien con un bastoncillo de algodón.

Asegure el taladro en el marco estereotáxico y localice la estructura bregma o lambdoidea con el taladro. Una vez que se establezcan las coordenadas, taladre con cuidado un pequeño orificio en el hueso en el sitio designado. Vuelva a suspender la suspensión celular de inyección de tumor cerebral preparada varias veces con una pipeta, asegurándose de evitar las burbujas de aire.

Extraiga dos microlitros de la mezcla de células en una microjeringa de vidrio frío prelavada y conecte la jeringa al marco estereotáxico. Ajuste la aguja a la punta del cráneo para prepararse para la inyección. Dentro de los 30 segundos, inyecte las celdas en la región perforada.

Limpie cualquier suspensión celular de reflujo con una toallita de isopropanol durante la inyección. Deje la jeringa en su lugar durante un minuto para evitar el reflujo y permitir que el hidrogel de la matriz extracelular se asiente. Luego retire la jeringa y limpie la herida con una toallita de isopropanol.

Selle la incisión con pegamento para la piel o clips para heridas si es necesario. Coloque el ratón en posición recostada en una jaula de recuperación limpia con una lámpara de calor o una almohadilla térmica para mantener el calor. Monitoree al animal continuamente hasta que comience a moverse de forma independiente y normal.

Después de la inyección intracraneal, monitoree a los ratones cinco días a la semana para evaluar su bienestar general. Registre parámetros como la pérdida de peso, el nivel de actividad, la postura, los signos de deshidratación y la condición del pelaje en una hoja de control designada. Los animales exhibieron síntomas distintos según el tipo de tumor y el lugar de inyección, como inclinación de la cabeza en tumores de tronco encefálico y agrandamiento del prosencéfalo para gliomas corticales o ependimomas.

Las inyecciones intracraneales de células del meduloblastoma D425 a diferentes densidades revelaron una correlación directa entre la densidad celular y la velocidad de injerto tumoral con 100.000 células, lo que condujo a la mediana de supervivencia más corta de 15 días. Las células de glioma de alto grado inyectadas en la corteza dieron como resultado una mediana de supervivencia de aproximadamente 25,5 días con un análisis inmunohistoquímico que reveló una gran masa tumoral altamente nucleada y una mayor vascularización, así como abundantes células proliferativas positivas para Ki-67. Las inyecciones en el tronco encefálico de células de glioma de alto grado dieron como resultado una mediana de supervivencia de aproximadamente 26 días con análisis inmunohistoquímicos que indicaron una masa tumoral en la protuberancia superior e infiltración leptomeníngea, así como células proliferativas positivas para Ki-67 en áreas infiltradas.