Un modelo murino de transformación hemorrágica inducida por hiperglucemia aguda combinada con isquemia focal transitoria

En la presente investigación, nuestro objetivo es proporcionar un protocolo completo y detallado para establecer un modelo animal altamente reproducible de transformación radical humana utilizando la reperfusión de oclusión de la arteria cerebral media en ratones C57BL / 6 con hiperglucemia aguda.

En comparación con otras técnicas, nuestro protocolo demuestra una buena repetibilidad, alta estabilidad y baja mortalidad animal, lo que lo hace adecuado para su uso generalizado en la investigación preclínica de la transformación hemorrágica.

En el futuro, nuestro enfoque será investigar el impacto de la transformación hemorrágica en la neurología y explorar el mecanismo subyacente.

[Instructor] Para comenzar, limpie la plataforma quirúrgica y el área de trabajo circundante con etanol al 75%. Encienda el interruptor de calefacción y ajuste la temperatura a 37 grados centígrados. Mueva el ratón anestesiado a la plataforma quirúrgica en posición supina y asegure sus extremidades con cinta adhesiva. Luego, 15 minutos antes del procedimiento quirúrgico, administre intraperitonealmente glucosa al 30% o solución salina normal a los ratones. Con un bisturí, haga una incisión horizontal con una abertura de 1,5 centímetros a lo largo de la línea media del cuello. Realice una disección roma dentro del área del triángulo invertido para identificar y separar la arteria carótida común izquierda. Con fórceps oftálmicos, diseccionar el nervio vago adyacente a la arteria carótida común y el tejido mucoso que rodea los vasos sanguíneos. Con una sutura absorbible de ácido poliglicólico 5-0, haga un timbre en la arteria carótida común, manteniendo la sutura sin tensión. Luego, separe hacia arriba a lo largo de la arteria carótida común. Ahora, separe la bifurcación para exponer completamente la arteria carótida externa e interna. Enrolle y ate firmemente una sutura absorbible de ácido poliglicólico 5-0 alrededor de la arteria carótida externa distalmente de la bifurcación. A continuación, con dos pinzas ligeras de micro serrafina para la arteria arterial, pinza temporalmente tanto la arteria carótida común como la arteria carótida interna para bloquear el flujo sanguíneo. Luego, estire la sutura en la arteria carótida externa distal y la arteria carótida común para enderezar el segmento de la arteria carótida externa. Ahora, use microtijeras para hacer una pequeña incisión entre las dos suturas en la arteria carótida externa. Inserte una sutura de monofilamento recubierta de silicona de 30 milímetros de largo en la arteria carótida externa. Enrolle y ate ligeramente una segunda sutura absorbible de ácido poliglicólico 5-0 en la arteria carótida externa cerca de la bifurcación para evitar que la sutura de monofilamento retroceda. Luego, corte completamente la arteria carótida externa distal a la ligadura permanente y retire la pinza de la arteria de la arteria carótida interna. A continuación, retire la sutura a la bifurcación de la arteria carótida común. Retraiga y gire con cuidado el muñón de la arteria carótida externa. Ajuste la dirección de la sutura e insértela de 9 a 10 milímetros desde la bifurcación de la arteria carótida común hacia la arteria carótida interna para bloquear la arteria cerebral media. Luego, apriete la segunda sutura absorbible de ácido poliglicólico alrededor de la arteria carótida externa y retire la pinza de la arteria de la arteria carótida común. Después de volver a anestesiar al ratón, usando una pinza de arteria de microclip, pinza la arteria carótida común. Retraiga parcialmente el monofilamento de la arteria carótida interna hasta que la punta recubierta de silicona se haga visible a través de la arteria carótida interna. Luego, coloque otra pinza de arteria microclip en la arteria carótida interna por encima de la punta recubierta de silicona. Retire completamente el monofilamento y legue firmemente el muñón de la arteria carótida externa. Finalmente, retire la pinza de la arteria microclip de la arteria carótida interna y la arteria carótida común, respectivamente. Para comenzar, limpie la cola del ratón con una bola de algodón empapada en alcohol para que la vena de la cola sea completamente hiperémica. Con unas tijeras quirúrgicas, corte la punta de la cola de uno a dos milímetros. Apriete suavemente a lo largo de la raíz de la cola hasta la punta para facilitar el flujo sanguíneo fuera de la incisión. Luego, coloque el tanque de absorción de muestras del papel de prueba en el borde de la gota de sangre. Lea la lectura del medidor de glucosa en sangre y registre el resultado. Para medir el flujo sanguíneo cerebral, sostenga la punta de la sonda de flujometría láser doppler perpendicular a la superficie del cráneo parietal izquierdo hasta que se lea un flujo estable y registre este valor. Después de extraer el cerebro del ratón MCAO sacrificado, coloque el tejido cerebral en una matriz cerebral de roedor y córtelo en rodajas coronales de dos milímetros. Transfiera las rodajas a una placa de 24 pocillos e incube con una solución de cloruro de 2,3,5-trifeniltetrazolio al 2% a 37 grados centígrados durante 15 minutos. Luego, corte las secciones de tejido de la placa de 24 pocillos con pinzas curvas y colóquelas en la placa de escaneo de vidrio. Tiñe el corte de cerebro fijo con solución de hematoxilina durante tres minutos. Diferéncialo sumergiendo la loncha en alcohol de ácido clorhídrico al 5% durante cinco segundos. Luego, deshidrate e hialinice la rebanada con soluciones de etanol en gradiente y xileno. Montar la sección con resinas neutras. 23 horas después de MCAO, inyecte una solución de Evans Blue al 2% en el ratón y extraiga el cerebro. Después de homogeneizar y centrifugar el tejido, transfiera el líquido sobrenadante a otro tubo de centrífuga y dilúyalo cuatro veces con etanol. Mida la absorbancia del líquido sobrenadante a 620 nanómetros usando un espectrofotómetro. Inyecte FITC-dextrano en la vena de la cola 24 horas después de la MCAO y déjelo circular en la sangre durante 10 minutos. Después de fijar el tejido cerebral, incruste el tejido cerebral con un compuesto de temperatura de corte óptima y córtelo en secciones de 30 micrómetros de grosor. Transfiera las secciones a un portaobjetos de microscopio utilizando un asa de inoculación, asegurándose de que se adhieran a la superficie del portaobjetos. Monte las secciones de tejido cerebral utilizando un medio de montaje que contenga 4',6-diamidino-2-fenilindol. Los niveles de glucosa en sangre aumentaron significativamente después de MCAO en ratones inyectados con glucosa en comparación con los grupos de solución salina. No se observó infarto visible en cortes de cerebro en el grupo simulado con solución salina o simulado con glucosa. El grupo MCAO con glucosa mostró un volumen de infarto cerebral significativamente mayor en comparación con el grupo MCAO con solución salina. Se observaron múltiples hemorragias punteadas en el hemisferio isquémico del MCAO con el grupo de glucosa, que estuvieron ausentes en los otros grupos. Se observó una infiltración significativa de células sanguíneas en las regiones de infarto de la corteza y el cuerpo estriado en el grupo MCAO con glucosa. La permeabilidad con azul de Evans y la fuga de FITC-dextrano fueron notablemente mayores en el grupo MCAO con glucosa en comparación con el grupo MCAO con solución salina.