Name: Análisis microscópico confocal de la clasificación de proteínas a plasmodesmos en Nicotiana benthamiana (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-01T14:55:00.000+00:00
Duration: 5 min 54 s
Description: Aprende a analizar la localización de proteínas en plasmodesmos mediante microscopía confocal en Nicotiana benthamiana. Este método permite estudiar la dinámica de transporte celular durante infecciones virales.

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<meta charset="utf8"></head><body>Exploración de la función de los plasmodesmos: microscopía confocal de proteínas diana

<ol><li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+plasmodesmata-localized+protein+mediates+crosstalk+between+cell-to-cell+communication+and+innate+immunity+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">A plasmodesmata-localized protein mediates crosstalk between cell-to-cell communication and innate immunity in Arabidopsis.</a> The Plant Cell. 23 (9), 3353-3373 (2011).</li>
<li>Benitez-Alfonso, Y., Faulkner, C., Ritzenthaler, C., Maule, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmodesmata+gateways+to+local+and+systemic+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Plant-Microbe+Interact%22%5BJournal%5D)">Plasmodesmata gateways to local and systemic virus infection.</a> Mol Plant-Microbe Interact. 23 (11), 1403-1412 (2010).</li>
<li>Bayer, E. M., Benitez-Alfonso, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmodesmata%3A+Channels+under+pressure%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Plasmodesmata: Channels under pressure.</a> Annu Rev Plant Biol. 75, 21(2024).</li>
<li>Maule, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmodesmata%3A+Structure%2C+function+and+biogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Plasmodesmata: Structure, function and biogenesis.</a> Curr Opin Plant Biol. 11, 680-686 (2008).</li>
<li>Fernandez-Calvino, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+plasmodesmal+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis plasmodesmal proteome.</a> PLoS One. 6 (4), e18880(2011).</li>
<li>Kirk, P., Amsbury, S., German, L., Gaudioso-Pedraza, R., Benitez-Alfonso, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+meta-proteomic+pipeline+for+the+identification+of+plasmodesmata+proteins+and+regulatory+conditions+in+diverse+plant+species%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biol%22%5BJournal%5D)">A comparative meta-proteomic pipeline for the identification of plasmodesmata proteins and regulatory conditions in diverse plant species.</a> BMC Biol. 20, 128(2022).</li>
<li>Levy, A., Erlanger, M., Rosenthal, M., Epel, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+plasmodesmata-associated+%CE%B2-1%2C3-glucanase+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+J%22%5BJournal%5D)">A plasmodesmata-associated β-1,3-glucanase in Arabidopsis.</a> The Plant J. 49 (4), 669-682 (2007).</li>
<li>Kankanala, P., Czymmek, K., Valent, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+for+rice+membrane+dynamics+and+plasmodesmata+during+biotrophic+invasion+by+the+blast+fungus%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Roles for rice membrane dynamics and plasmodesmata during biotrophic invasion by the blast fungus.</a> The Plant Cell. 19 (2), 706-724 (2007).</li>
<li>Aung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenic+bacteria+target+plant+plasmodesmata+to+colonize+and+invade+surrounding+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Pathogenic bacteria target plant plasmodesmata to colonize and invade surrounding tissues.</a> The Plant Cell. 32 (3), 595-611 (2020).</li>
<li>Cui, W., Lee, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+callose+synthases+CalS1%2F8+regulate+plasmodesmal+permeability+during+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Plants%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis callose synthases CalS1/8 regulate plasmodesmal permeability during stress.</a> Nat Plants. 2 (5), 160(2016).</li>
<li>Liu, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phytosphinganine+affects+plasmodesmata+permeability+via+facilitating+PDLP5-stimulated+callose+accumulation+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Plant%22%5BJournal%5D)">Phytosphinganine affects plasmodesmata permeability via facilitating PDLP5-stimulated callose accumulation in Arabidopsis.</a> Mol Plant. 13 (1), 128-143 (2020).</li>
<li>Caillaud, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+plasmodesmal+protein+PDLP1+localizes+to+haustoria-associated+membranes+during+downy+mildew+infection+and+regulates+callose+deposition%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">The plasmodesmal protein PDLP1 localizes to haustoria-associated membranes during downy mildew infection and regulates callose deposition.</a> PLoS Pathog. 10 (11), e1004496(2014).</li>
<li>Li, Z., Su-Ling, L., Christian, M., Walley, J. W., Aung, K. Plasmodesmata-located protein 6 regulates plasmodesmal function in Arabidopsis vasculature. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLi%2C+Z+%22The+Plant+Cell%22">The Plant Cell</a>. , (2024).</li>
<li>Chen, X., et al. Arabidopsis PDLP7 modulated plasmodesmata function is related to BG10-dependent glucosidase activity required for callose degradation. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aChen%2C+X+%22Sci+Bull%22">Sci Bull</a>. , (2024).</li>
<li>Simpson, C., Thomas, C., Findlay, K., Bayer, E., Maule, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Arabidopsis+GPI-anchor+plasmodesmal+neck+protein+with+callose+binding+activity+and+potential+to+regulate+cell-to-cell+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">An Arabidopsis GPI-anchor plasmodesmal neck protein with callose binding activity and potential to regulate cell-to-cell trafficking.</a> The Plant Cell. 21 (2), 581-594 (2009).</li>
<li>Thomas, C. L., Bayer, E. M., Ritzenthaler, C., Fernandez-Calvino, L., Maule, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+targeting+of+a+plasmodesmal+protein+affecting+cell-to-cell+communication%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Specific targeting of a plasmodesmal protein affecting cell-to-cell communication.</a> PLoS Biol. 6 (1), e7(2008).</li>
<li>Lim, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmodesmata+localizing+proteins+regulate+transport+and+signaling+during+systemic+acquired+immunity+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Plasmodesmata localizing proteins regulate transport and signaling during systemic acquired immunity in plants.</a> Cell Host Microbe. 19 (4), 541-549 (2016).</li>
<li>Sheludko, Y. V., Sindarovska, Y. R., Gerasymenko, I. M., Bannikova, M. A., Kuchuk, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+several+Nicotiana+species+as+hosts+for+high-scale+Agrobacterium-mediated+transient+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Comparison of several Nicotiana species as hosts for high-scale Agrobacterium-mediated transient expression.</a> Biotechnol Bioeng. 96 (3), 608-614 (2007).</li>
<li>Walhout, A. J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GATEWAY+recombinational+cloning%3A+Application+to+the+cloning+of+large+numbers+of+open+reading+frames+or+ORFeomes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">GATEWAY recombinational cloning: Application to the cloning of large numbers of open reading frames or ORFeomes.</a> Methods Enzymol. 328, 575-592 (2000).</li>
<li>Huang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((dsRNA-induced+immunity+targets+plasmodesmata+and+is+suppressed+by+viral+movement+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">dsRNA-induced immunity targets plasmodesmata and is suppressed by viral movement proteins.</a> The Plant Cell. 35 (10), 3845-3869 (2023).</li>
<li>Roberts, I. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+changes+in+the+frequency+and+architecture+of+plasmodesmata+during+the+sink-source+transition+in+tobacco+leaves%5BTitle%5D)+AND+%22Protoplasma%22%5BJournal%5D)">Dynamic changes in the frequency and architecture of plasmodesmata during the sink-source transition in tobacco leaves.</a> Protoplasma. 218, 31-44 (2001).</li>
<li>Yuan, C., Lazarowitz, S. G., Citovsky, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+plasmodesmal+localization+signal+of+TMV+MP+is+recognized+by+plant+synaptotagmin+SYTA%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">The plasmodesmal localization signal of TMV MP is recognized by plant synaptotagmin SYTA.</a> mBio. 9 (4), e01314-e01318 (2018).</li>
<li>Ward, S. J., Ramirez, M. D., Neelakantan, H., Walker, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cannabidiol+prevents+the+development+of+cold+and+mechanical+allodynia+in+paclitaxel-treated+female+C57Bl6+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Anesth+Analg%22%5BJournal%5D)">Cannabidiol prevents the development of cold and mechanical allodynia in paclitaxel-treated female C57Bl6 mice.</a> Anesth Analg. 113 (4), 947-950 (2011).</li>
<li>Erkkilä, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widefield+fluorescence+lifetime+imaging+of+protoporphyrin+IX+for+fluorescence-guided+neurosurgery%3A+An+ex+vivo+feasibility+study%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biophotonics%22%5BJournal%5D)">Widefield fluorescence lifetime imaging of protoporphyrin IX for fluorescence-guided neurosurgery: An ex vivo feasibility study.</a> J Biophotonics. 12 (6), e201800378(2019).</li>
<li>Levy, A., Zheng, J. Y., Lazarowitz, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tobamovirus+Turnip+vein+clearing+virus+30-kilodalton+movement+protein+localizes+to+novel+nuclear+filaments+to+enhance+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">The tobamovirus Turnip vein clearing virus 30-kilodalton movement protein localizes to novel nuclear filaments to enhance virus infection.</a> J Virol. 87 (11), 6428-6440 (2013).</li>
<li>Yuan, C., Lazarowitz, S. G., Citovsky, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+functional+plasmodesmal+localization+signal+in+a+plant+viral+cell-to-cell-movement+protein%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Identification of a functional plasmodesmal localization signal in a plant viral cell-to-cell-movement protein.</a> mBio. 7 (1), e2052-e2015 (2016).</li>
<li>Kumar, G., Dasgupta, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variability%2C+functions+and+interactions+of+plant+virus+movement+proteins%3A+what+do+we+know+so+far%5BTitle%5D)+AND+%22Microorganisms%22%5BJournal%5D)">Variability, functions and interactions of plant virus movement proteins: what do we know so far.</a> Microorganisms. 9 (4), 695(2021).</li>
<li>Waigmann, E., Ueki, S., Trutnyeva, K., Citovsky, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ins+and+outs+of+nondestructive+cell-to-cell+and+systemic+movement+of+plant+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Rev+Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">The ins and outs of nondestructive cell-to-cell and systemic movement of plant viruses.</a> Crit Rev Plant Sci. 23 (3), 195-250 (2004).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Motor ABT AC 1 fásico</td><td>BRANDTECH</td><td>&nbsp; ABF63/4C-7RQ</td><td></td></tr><<tr><td>em>Agrobacterium tumefaciens EHA105</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Control de contaminación&nbsp;</td><td>CCI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gateway BP Clonasa II Mezcla de enzimas</td><td>Invitrogen</td><td>#11789020</td><td></td></tr><tr><td>Gateway LR Clonasa II Mezcla de enzimas</td><td>Invitrogen</td><td>#11791020</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prisma 8.0.1.</td><td>Software GraphPad Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Imagen J</td><td>Institutos Nacionales de Salud y el Laboratorio de Instrumentación</td><td></td><td></td>Óptica y Computacional</tr><tr><td>Microscopio confocal de barrido láser</td><td>Zeiss</td><td>LSM 900</td><td></td></tr><tr><td>Nicotiana benthamiana</td><td>Especie</td><td></td><td></td>de planta</tr><tr><td>pDONR207</td><td>Invitrogen</td><td>#12213013</td><td></td></tr><tr><td>Q5 ADN polimerasa de alta fidelidad</td><td>NEB</td><td>#M0491S</td><td></td></tr></tbody></table>

análisis microscópico confocal de la clasificación de proteínas a plasmodesmos en nicotiana benthamiana

Confocal Microscopy Analysis of Protein Sorting to Plasmodesmata in Nicotiana benthamiana

Para facilitar los estudios de la función de la EP en la fisiología de las plantas y las interacciones con los patógenos, se desarrollaron tres proteínas de referencia sencillas y fiables para la localización de la EP. Se seleccionaron dos proteínas PD celulares y una proteína MP derivada del patógeno codificada por el tobamovirus vegetal TVCV. La localización subcelular de estas proteínas se visualizó utilizando un EGFP reportero autofluorescente fusionado con el extremo C-terminal de cada proteína. En un enfoque alternativo, la DP se visualizó mediante la tinción con azul de anilina de los depósitos de callosa asociados a la EP. Los experimentos mostraron que tanto PDLP5 como MP exhibían una localización punteada de la PD, con MP también localizada en el núcleo de la célula (Figura 1A), como se señaló anteriormente25. Por el contrario, PDCB1 parecía particionarse entre PD y ER (Figura 1A). Para los investigadores con menos experiencia en la interpretación de la localización subcelular de las proteínas marcadas con GFP, la Figura 1A también ilustra el patrón nucleocitoplasmático característico de EGFP expresado en células vegetales. Para confirmar la señal ER de PDCB1, coexpresamos PDCB1 con un marcador ER y descubrimos que la señal PDCB1 se superponía a la señal del marcador ER (Figura 1B). Para evaluar la eficiencia de la localización de la PD de las proteínas ensayadas, se calculó el porcentaje de células que expresan la señal fluorescente que exhiben la localización de la PD de esta señal (Tabla 1).
Para la identificación de la localización subcelular mediante el empleo de proteínas de referencia, es útil comprender la escala temporal de la expresión de la proteína de referencia y los posibles cambios de su localización. La Figura 2 muestra dicha cinética para MP, PDLP5 y PDCB1 cuando la DP se visualizó mediante tinción con azul de anilina. Tanto MP como PDLP5 comenzaron a acumularse en PD ya al día post-infiltración (dpi), y esta acumulación alcanzó un máximo aparente a los 2 dpi, permaneciendo estable durante 5 días más, después de los cuales la intensidad de la señal disminuyó, muy probablemente debido a la degradación de la proteína. El curso temporal de la clasificación subcelular de PDCB1 fue más complejo: durante los primeros 3 dpi, PDCB1 exhibió una señal ER comparativamente fuerte, que oscureció casi por completo la localización de la señal específica de PD, mientras que a los 5 dpi, esta última señal se volvió más pronunciada (Figura 2), aunque en menos células. Curiosamente, la aparición del claro patrón de localización de PD de PDCB1 después de 5 dpi coincidió con un número sustancialmente menor de células que mostraban la señal de EGFP (Figura suplementaria 1). Por lo tanto, PDLP5 y MP pueden funcionar como proteínas de referencia de PD con poco fondo en la mayoría de los otros compartimentos celulares, con una ventana de tiempo de visualización óptima de 2-5 dpi. PDCB1, por otro lado, no es tan adecuado como un marcador de DP.
A continuación, se comprobó que los marcadores de EP conservan su especificidad de localización subcelular en presencia de otras proteínas de la EP. Con este fin, MP-EGFP o PDLP5-EGFP se coexpresó con26 MP localizadores de PD de otro virus de la planta, el virus del mosaico del tabaco (TMV) marcado con CFP. La Figura 3 muestra que, en ambos casos, las proteínas coexpresadas mostraron un claro patrón de localización de la EP. De manera similar, la tinción histológica con azul de anilina específica de PD de los tejidos que expresan MP-EGFP o PDLP5-EGFP no detectó interferencia con la localización de PD de las señales de EGFP y azul de anilina (Figura 3).
Los estudios de localización de la EP a menudo se benefician de una estimación más cuantitativa de la expresión general de la proteína de referencia y la señal de la EP. Este enfoque de cuantificación se ilustra en la Figura 4 y la Figura 5. Para la cuantificación de la expresión general, se midió la intensidad de la señal de PDLP5 y MP. Ambas proteínas mostraron señales fuertes en todos los puntos de tiempo de visualización durante el período de 10 dpi, con una intensidad de señal máxima de 3 dpi para PDLP5 y de 2 dpi para MP (Figura 4). No hubo diferencias estadísticamente significativas en la intensidad de la señal entre PDLP5 y MP en ninguno de los puntos temporales de visualización. La intensidad de la señal PDCB1 mostró una mayor fluctuación entre puntos de tiempo, con la señal más fuerte observada a 7 ppp (Figura 4), aunque fue difícil recopilar datos estadísticamente significativos en este punto de tiempo debido a la escasez de células expresivas. Por lo tanto, los primeros 3 ppp representan el momento óptimo para detectar la expresión de PDCB1. Como se esperaba, las muestras de tinción con azul de anilina mostraron una señal más estable que las proteínas expresadas transitoriamente (Figura 4).
A continuación, se cuantificaron los puntos de PD formados por PDLP5 y MP. PDLP5 mostró un número estable de puntos de PD durante todo el período de observación, sin diferencias estadísticamente significativas entre dos de los puntos de tiempo probados (Figura 5). El mayor número de puntos de PD formados por MP se detectó a los 2 dpi, y se mantuvieron relativamente estables hasta el final del período de observación. La comparación del número de puntos de PD entre PDLP5 y MP no reveló diferencias estadísticamente significativas en la mayoría de los momentos de muestreo (Figura 5). El número de puntos de PD teñidos con azul de anilina también se mantuvo estable, aunque disminuyó ligeramente a los 10 dpi. El número de puntos de DP decorados con azul de anilina, PDLP5 o MP fue similar entre sí con significación estadística (Figura 5), lo que concuerda con la especificidad de estos marcadores para la EP. No se analizó el número de puntos de PD para PDCB1 porque, en puntos de tiempo anteriores, la señal de PD estaba oscurecida por la señal de ER, y en puntos de tiempo posteriores, se observó solo en un número relativamente pequeño de células (ver Figura 2).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67378/67378fig01.jpg"> Figura 1: Localización de plasmodesmos (PD) de TVCV MP, PDLP5 y PDCB1 expresada transitoriamente en Nicotiana benthamiana y tinción con azul de anilina de PD. (A) Localización de PD de MP-EGFP, PDLP5-EGFP y PDCB1-EGFP y tinción con anilina. La señal EGFP está en verde, la señal azul de anilina está en azul y la autofluorescencia de plástidos está en rojo. (B) Coexpresión de MP-EGFP, PDLP5-EGFP y PDCB1-EGFP con el marcador de retículo endoplásmico (RE) marcado con mRFP. Las imágenes se registraron a los 2 días después de la infiltración (dpi) y son secciones confocales individuales representativas de dos experimentos independientes (N = 20 imágenes de 2 plantas). La señal EGFP está en verde, la señal mRFP está en púrpura y la autofluorescencia de plástidos está en rojo. Las flechas amarillas indican PDCB1 localizado en el ER. Barras de escala = 5 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67378/67378fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67378/67378fig02.jpg"> Figura 2: Evolución temporal de la localización de la EP de TVCV MP, PDLP5 y PDCB1 expresada transitoriamente en Nicotiana benthamiana y de la tinción con azul de anilina de la EP. Las imágenes se registraron a 2 ppp y son secciones confocales individuales representativas de dos experimentos independientes (N = 20 imágenes de 2 plantas para todos los sistemas, excepto 7 ppp y 10 ppp para PDCB1-EGFP, en los que menos células exhibieron la señal). La señal EGFP está en verde y la señal azul de anilina está en azul. Barras de escala = 5 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67378/67378fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67378/67378fig03.jpg"> Figura 3: TVCV MP y PDLP5 conservan su localización de PD después de la coexpresión con un TMV MP que localiza PD y se cueca con azul de anilina. Las imágenes se registraron a 2 dpi y son secciones confocales individuales representativas de N ≥ 10 imágenes de 4-6 plantas. La señal EGFP está en verde, la señal CFP y la señal azul anilina están en azul y la autofluorescencia del plástido está en rojo. Barras de escala = 5 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67378/67378fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67378/67378fig04.jpg"> Figura 4: Curso temporal de la intensidad de fluorescencia de TVCV MP, PDLP5 y PDCB1 expresada transitoriamente en tinción de Nicotiana benthamiana y PD con azul de anilina. Los datos cuantitativos se recogieron de los experimentos descritos en la Figura 2. Las barras de error representan la desviación estándar de la media de varios experimentos. Los puntos de datos individuales se indican como la media de cada medición. Las diferencias entre los valores medios evaluados por ANOVA de dos factores con la prueba de comparaciones múltiples de Tukey son estadísticamente significativas para los valores P. *P &lt; 0,05, **P &lt; 0,01 y ***P &lt; 0,001, ****P &lt; 0,0001; ns, no estadísticamente significativo. Barras azules, tinción de anilina; barras de color verde claro, MP-EGFP, barras de color verde oscuro, PDLP5-EGFP; barras amarillas, PDCB1-EGFP. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67378/67378fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67378/67378fig05.jpg"> Figura 5: Curso temporal de la formación de PD puncta por TVCV MP y PDLP5 expresados transitoriamente en Nicotiana benthamiana y por tinción con azul de anilina de PD. Los datos cuantitativos se recogieron de los experimentos descritos en la Figura 2. Las barras de error representan la desviación estándar de la media de varios experimentos. Los puntos de datos individuales se indican como la media de cada medición. Las diferencias entre los valores medios evaluados por ANOVA de dos factores con la prueba de comparaciones múltiples de Tukey son estadísticamente significativas para los valores P. *P &lt; 0,05, **P &lt; 0,01, ***P &lt; 0,001, ****P &lt; 0,0001. Barras azules, tinción de anilina; barras de color verde claro, MP-EGFP, barras de color verde oscuro, PDLP5-EGFP. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67378/67378fig05large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td>
			<td colspan="4">Experimento I</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>Total de celdas</td>
			<td>Células con localización de PD</td>
			<td>Células con señal mixta</td>
			<td>Células con localización de PD (%)</td>
		</tr><tr><td>Azul de anilina</td>
			<td>40</td>
			<td>40</td>
			<td>4</td>
			<td>100</td>
		</tr><tr><td>MP-EGFP</td>
			<td>40</td>
			<td>40</td>
			<td>4</td>
			<td>100</td>
		</tr><tr><td>PDCB1-EGFP</td>
			<td>40</td>
			<td>3</td>
			<td>38</td>
			<td>7.5</td>
		</tr><tr><td>PDLP5-EGFP</td>
			<td>40</td>
			<td>40</td>
			<td>0</td>
			<td>100</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td colspan="4">Experimento II</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>Total de celdas</td>
			<td>Células con localización de PD</td>
			<td>Células con señal mixta</td>
			<td>Células con localización de PD (%)</td>
		</tr><tr><td>Azul de anilina</td>
			<td>40</td>
			<td>40</td>
			<td>8</td>
			<td>100</td>
		</tr><tr><td>MP-EGFP</td>
			<td>40</td>
			<td>39</td>
			<td>8</td>
			<td>97.5</td>
		</tr><tr><td>PDCB1-EGFP</td>
			<td>40</td>
			<td>12</td>
			<td>31</td>
			<td>30</td>
		</tr><tr><td>PDLP5-EGFP</td>
			<td>40</td>
			<td>39</td>
			<td>2</td>
			<td>97.5</td>
		</tr></tbody></table>Tabla 1: Eficiencia de la localización de la DP.
Figura suplementaria 1: Localización de PD de TVCV MP, PDLP5 y PDCB1 expresados transitoriamente en Nicotiana benthamiana. Las imágenes se grabaron a 5 ppp (A), 7 ppp (B) y 10 ppp (C). La señal EGFP es verde y la autofluorescencia del plástido es roja. Barras de escala = 20 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67378/Figure%20S1.zip" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>

Análisis microscópico confocal de la clasificación de proteínas a plasmodesmos en Nicotiana benthamiana

Plasmodesmata are membranous nanopores that connect the cytoplasm of adjacent plant cells and enable the cell-to-cell trafficking of nutrients, ...

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

El tráfico de macromoléculas entre las células vegetales se pueden evaluar de forma transitoria que expresa una proteína fluorescente con etiquetas de interés y el análisis de su distribución intra e intercelulares mediante microscopia confocal.

Una célula a célula macromoleculares de transporte de ensayo En la Planta La utilización de bombardeo biolística

Hemos desarrollado una técnica para probar interacciones proteína-proteína en las plantas. Una proteína amarilla fluorescente (YFP) se divide en dos fragmentos que no se superponen. Cada fragmento se clona en el marco de un gen de interés a través del sistema de puerta de enlace, lo que permite la expresión de proteínas de fusión. La reconstitución de la señal de YFP sólo ocurre cuando las proteínas interactúan investigación.

Detección de interacciones de proteínas en la planta mediante un Gateway Compatible Complementación fluorescencia bimoleculares (BiFC) del sistema

Análisis específico de célula de<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Hojas usando citometría de flujo

Formación de complejos de proteínas in vivo puede ser visualizado por complementación de fluorescencia bimolecular. Parejas de interacción se fusionan a partes complementarias de etiquetas fluorescentes y expresados ​​transitoriamente en hojas de tabaco, lo que resulta en una señal fluorescente reconstituido en una estrecha proximidad de las dos proteínas.

Interacciones proteína-proteína se visualizó por fluorescencia Bimolecular Complementación en protoplastos de tabaco y hojas

A nivel subcelular, los eventos de señalización son modulados dinámicamente por señales de desarrollo y ambientales. Aquí describimos un protocolo que emplea el sistema de expresión transitoria del tabaco para monitorear la interacción dinámica proteína-proteína y para revelar la organización espacial de la transducción de señales en células vegetales.

La formación de imágenes reorganización espacial de una vía de señalización MAPK Usando el sistema de expresión transitoria del Tabaco

Planta las conexiones intercelulares, los plasmodesmos (Pd), juegan un papel central en la planta las interacciones planta-virus y fisiología. Crítica para el transporte de Pd son clasificación señales que dirigen las proteínas a Pd. Sin embargo, nuestro conocimiento acerca de estas secuencias es todavía en su infancia. Se describe una estrategia para identificar señales de localización de Pd en proteínas orientada a Pd.

Identificación de secuencias de localización Plasmodesmal en proteínas en Planta

Este manuscrito describe un procedimiento experimental fácil y rápido para la determinación de las interacciones proteína-proteína basadas en la medición de la actividad de luciferasa.

Complementación de luciferase imagen ensayo en hojas de Nicotiana benthamiana para determinar transitoriamente proteínas interacción dinámica

Hemos desarrollado un novedoso método para expresar conjuntamente múltiples proteínas de fusión quimérica de fluorescentes en las plantas a superar las dificultades de los métodos convencionales. Toma ventaja del uso de un plásmido de expresión única que contiene múltiples proteínas funcionalmente independiente expresando cassettes para lograr la expresión de la proteína.

La expresión de múltiples proteínas de fusión quimérica de fluorescente de manera eficiente en las plantas

Este protocolo presenta cómo viven la imagen y analizar los meristemos apicales de brotes de diferentes especies de plantas mediante microscopía confocal de barrido láser.

Proyección de imagen confocal vivo de meristemos apicales de brotes de diferentes especies de plantas

Aquí se describe un método de etiquetado de proximidad para la identificación de socios de interacción del dominio TIR del receptor inmune NLR en el tejido de hoja de Nicotiana benthamiana. También se proporciona un protocolo detallado para la identificación de interacciones entre otras proteínas de interés utilizando esta técnica en Nicotiana y otras especies vegetales.

Etiquetado de proximidad basado en TurboID para la identificación en planta de redes de interacción proteína-proteína

Los primordios de hojas de maíz están profundamente enfundados y enrollados, lo que los hace difíciles de estudiar. Aquí, presentamos métodos para preparar secciones transversales y montajes enteros desenrollados de primordios de hojas de maíz para imágenes fluorescentes y confocales.

Métodos mejorados para preparar secciones transversales y montajes enteros desenrollados de primordios de hojas de maíz para imágenes de fluorescencia y confocales

Aprende a analizar la localización de proteínas en plasmodesmos mediante microscopía confocal en Nicotiana benthamiana. Este método permite estudiar la dinámica de transporte celular durante infecciones virales.

Análisis microscópico confocal de la clasificación de proteínas a plasmodesmos en Nicotiana benthamiana

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