In vitro Modelado de la neurogénesis del síndrome de Down utilizando células madre pluripotentes inducidas por humanos

La investigación a largo plazo se centra en encontrar posibles terapias para los trastornos neurológicos del síndrome de Down. Y nuestro enfoque actual es la neurogénesis deteriorada por el síndrome de Down, una de las principales causas de discapacidad intelectual. Descubrimos que la neurogénesis deteriorada del síndrome de Down es causada por un defecto del ciclo celular bifásico, contrariamente a la creencia popular de que solo se debe a la senescencia de las células progenitoras neurales del síndrome de Down.

La identificación del defecto del ciclo celular bifásico utilizando el protocolo basado en IPSC humano descrito en este manuscrito impulsará estrategias terapéuticas potenciales para el desarrollo teniendo en cuenta tanto el estado del ciclo celular que es la proliferación reducida en la fase temprana, como la incapacidad de salir del ciclo celular en la fase tardía. Para comenzar, agregue 10 micromolares de inhibidor de roca en el medio de iPCS humano completo, DPBS, solución de desprendimiento de células y medio acondicionado para el alimentador suplementado con 25 nanogramos por mililitro de factor de crecimiento básico de fibroblastos. Calentar todos los reactivos a 37 grados centígrados.

Tome una placa de seis pocillos de iPSC en los alimentadores. Pipetear las colonias diferenciadas y añadir medio iPSC humano completo y fresco. Coloque la placa a 37 grados centígrados en una incubadora de dióxido de carbono durante dos horas.

Después de la incubación, lave los pocillos una vez con DPBS sin calcio ni magnesio. Luego, agregue un mililitro de solución de desprendimiento de celdas a cada pocillo. Coloque la placa a 37 grados centígrados en una incubadora de dióxido de carbono durante 12 a 14 minutos.

Observe las células bajo un microscopio invertido. Si la mayoría de las células se están desprendiendo, pero si algunas permanecen adheridas, golpee suavemente la placa desde los lados. Agregue tres mililitros de DPBS suplementado con calcio y magnesio en cada pocillo para diluir la solución de desprendimiento de células.

Con una pipeta de cinco mililitros, realice un pipeteo suave dos o tres veces para romper los grumos, evitando las burbujas. Pase las células a través de un colador de 40 micrómetros a una centrífuga de 50 mililitros 2. Centrifugar la suspensión a temperatura ambiente durante cinco minutos a 200 G. Utilice un sistema de aspiración al vacío para aspirar el medio suavemente.

Ahora, vuelva a suspender las células en 10 mililitros de medio iPSC humano. Transfiera todas las células en suspensión a un plato de 15 centímetros cubierto con gelatina al 0,1% e incube en una incubadora de dióxido de carbono. Recoja los medios con las células en una centrífuga 2.

Centrifugar a temperatura ambiente durante cinco minutos a 200 G. A continuación, aspire el medio suavemente con el sistema de aspiración al vacío. Vuelva a suspender las células en un mililitro de medio acondicionado para el alimentador, suplementado con 25 nanogramos por mililitro de BFGF y 10 micromolares de inhibidor de roca. Después del recuento de células, prepare una suspensión de 30.000 a 50.000 células por mililitro.

Siembre la suspensión en una placa de pozo. Después de dos días, reemplace el medio acondicionado por la célula progenitora neural o el medio NPC. Cambie los medios en los días dos y 18 como se indica.

El día 28, reemplace el medio en la placa con medio NPC suplementado con 10 micromolares de inhibidor de roca. A continuación, incubar la placa a 37 grados centígrados en una incubadora de dióxido de carbono durante dos horas. Después de la incubación, aspire el sobrenadante y lave los pocillos una vez con DPBS sin calcio ni magnesio.

Agregue un mililitro de solución de desprendimiento de celdas en cada pocillo. A continuación, observe las células bajo un microscopio invertido con un aumento de 4x. A continuación, pipetee tres mililitros de DPBS suplementado con calcio y magnesio en cada pocillo de la placa.

Con una pipeta de cinco mililitros, pipetea suavemente la suspensión y rompe los grumos. Cuele la suspensión celular a través de un colador de 40 micrómetros colocado sobre una centrífuga de 50 mililitros 2. Centrifugar y aspirar como se demostró anteriormente, luego vuelva a suspender el pellet en un mililitro de medio de diferenciación definido suplementado con B 27 con vitamina A. Cuente las células vivas con azul de tripán y un hemocitómetro.

A continuación, siembre 50.000 células en cada pocillo de una placa de 48 pocillos recubierta de matriz. En el día 33, reemplace el medio en los pocillos de cultivo con medio de diferenciación neuronal. Se observó una reducción significativa de las neuronas TUBB3 positivas en los cultivos con síndrome de Down, en comparación con las células euploides isogénicas, con una disminución de aproximadamente el doble evidente a los 85 días.

Se observó una proporción significativamente menor de células KI67 positivas en cultivos con síndrome de Down durante la etapa neurogénica temprana, en comparación con las células euploides isogénicas, mostrando una reducción de aproximadamente cuatro veces. En la etapa neurogénica tardía, la mayoría de las células euploides isogénicas salieron del ciclo celular con una tinción mínima de KI67, mientras que la mayoría de las células con síndrome de Down permanecieron positivas para KI67, mostrando un aumento de cinco veces. Un segundo par de iPSC humanas con síndrome de Sown y euploides isogénicas confirmaron niveles reducidos de neuronas TUBB3 positivas y células progenitoras neuronales PAX6 positivas elevadas en cultivos de síndrome de Down al final de la diferenciación neuronal, con una reducción del doble en las neuronas positivas para TUBB3 y un aumento de más del doble en las células PAX6 positivas.