Name: Evaluación de la liberación de LC3-II a través de vesículas extracelulares en relación con la acumulación de vesículas intracelulares LC3 positivas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-18T14:40:00.000+00:00
Duration: 6 min 58 s
Description: Aprende a evaluar la liberación de LC3-II mediante vesículas extracelulares en células HeLa. Este método permite estudiar la regulación de la autofagia en enfermedades neurodegenerativas como ELA y FTLD-TDP.

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<meta charset="utf8"></head><body>Evaluación de la liberación de EV positivo para LC3-II en la autofagia con alteración de la fusión de lisosomas

<ol><li>Tanaka, Y., Hasegawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profilin+1+mutants+form+aggregates+that+induce+accumulation+of+prion-like+tdp-43%5BTitle%5D)+AND+%22Prion%22%5BJournal%5D)">Profilin 1 mutants form aggregates that induce accumulation of prion-like tdp-43.</a> Prion. 10 (4), 283-289 (2016).</li>
<li>Mehta, P. R., Brown, A. L., Ward, M. E., Fratta, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+era+of+cryptic+exons%3A+Implications+for+als-ftd%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Neurodegener%22%5BJournal%5D)">The era of cryptic exons: Implications for als-ftd.</a> Mol Neurodegener. 18 (1), 16(2023).</li>
<li>Kawakami, I., Arai, T., Hasegawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+basis+of+clinicopathological+heterogeneity+in+tdp-43+proteinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">The basis of clinicopathological heterogeneity in tdp-43 proteinopathy.</a> Acta Neuropathol. 138 (5), 751-770 (2019).</li>
<li>Chatterjee, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+extracellular+vesicle+tau+and+tdp-43+as+diagnostic+biomarkers+in+ftd+and+als%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Plasma extracellular vesicle tau and tdp-43 as diagnostic biomarkers in ftd and als.</a> Nat Med. 30 (6), 1771-1783 (2024).</li>
<li>Kasai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+use+of+csf+nfl+and+csf+tdp-43+improves+diagnostic+performance+in+als%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Clin+Transl+Neurol%22%5BJournal%5D)">Combined use of csf nfl and csf tdp-43 improves diagnostic performance in als.</a> Ann Clin Transl Neurol. 6 (12), 2489-2502 (2019).</li>
<li>Iguchi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosome+secretion+is+a+key+pathway+for+clearance+of+pathological+tdp-43%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Exosome secretion is a key pathway for clearance of pathological tdp-43.</a> Brain. 139 (Pt 12), 3187-3201 (2016).</li>
<li>Ding, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exposure+to+als-ftd-csf+generates+tdp-43+aggregates+in+glioblastoma+cells+through+exosomes+and+tnts-like+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Exposure to als-ftd-csf generates tdp-43 aggregates in glioblastoma cells through exosomes and tnts-like structure.</a> Oncotarget. 6 (27), 24178-24191 (2015).</li>
<li>Mizushima, N., Levine, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+in+human+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Autophagy in human diseases.</a> N Engl J Med. 383 (16), 1564-1576 (2020).</li>
<li>Sasaki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+in+spinal+cord+motor+neurons+in+sporadic+amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuropathol+Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Autophagy in spinal cord motor neurons in sporadic amyotrophic lateral sclerosis.</a> J Neuropathol Exp Neurol. 70 (5), 349-359 (2011).</li>
<li>Ling, S. C., Polymenidou, M., Cleveland, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Converging+mechanisms+in+als+and+ftd%3A+Disrupted+rna+and+protein+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Converging mechanisms in als and ftd: Disrupted rna and protein homeostasis.</a> Neuron. 79 (3), 416-438 (2013).</li>
<li>Nguyen, D. K. H., Thombre, R., Wang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+as+a+common+pathway+in+amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Lett%22%5BJournal%5D)">Autophagy as a common pathway in amyotrophic lateral sclerosis.</a> Neurosci Lett. 697, 34-48 (2019).</li>
<li>Tanaka, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Possible+involvement+of+lysosomal+dysfunction+in+pathological+changes+of+the+brain+in+aged+progranulin-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol+Commun%22%5BJournal%5D)">Possible involvement of lysosomal dysfunction in pathological changes of the brain in aged progranulin-deficient mice.</a> Acta Neuropathol Commun. 2, 78(2014).</li>
<li>Tanaka, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysregulation+of+the+progranulin-driven+autophagy-lysosomal+pathway+mediates+secretion+of+the+nuclear+protein+tdp-43%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Dysregulation of the progranulin-driven autophagy-lysosomal pathway mediates secretion of the nuclear protein tdp-43.</a> J Biol Chem. 299 (11), 105272(2023).</li>
<li>Tanaka, Y., Ito, S., Suzuki, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TDP-43+secretion+via+extracellular+vesicles+is+regulated+by+macroautophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy+Rep%22%5BJournal%5D)">TDP-43 secretion via extracellular vesicles is regulated by macroautophagy.</a> Autophagy Rep. 3 (1), (2024).</li>
<li>Ratajczak, M., Ratajczak, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+microvesicles%2Fexosomes%3A+discovery%2C+disbelief%2C+acceptance%2C+and+the+future%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Extracellular microvesicles/exosomes: discovery, disbelief, acceptance, and the future.</a> Leukemia. 34 (12), 3126-3135 (2020).</li>
<li>Tanaka, Y., Kozuma, L., Hino, H., Takeya, K., Eto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abemaciclib+and+vacuolin-1+decrease+aggregate-prone+tdp-43+accumulation+by+accelerating+autophagic+flux%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Rep%22%5BJournal%5D)">Abemaciclib and vacuolin-1 decrease aggregate-prone tdp-43 accumulation by accelerating autophagic flux.</a> Biochem Biophys Rep. 38, 101705(2024).</li>
<li>Dingjan, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endosomal+and+phagosomal+snares%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Endosomal and phagosomal snares.</a> Physiol Rev. 98 (3), 1465-1492 (2018).</li>
<li>Tanaka, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progranulin+regulates+lysosomal+function+and+biogenesis+through+acidification+of+lysosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Progranulin regulates lysosomal function and biogenesis through acidification of lysosomes.</a> Hum Mol Genet. 26 (5), 969-988 (2017).</li>
<li>Kanda, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+the+freely+available+easy-to-use+software+%27EZR%27+for+medical+statistics%5BTitle%5D)+AND+%22Bone+Marrow+Transpl%22%5BJournal%5D)">Investigation of the freely available easy-to-use software 'EZR' for medical statistics.</a> Bone Marrow Transpl. 48 (3), 452-458 (2013).</li>
<li>Cookson, N. A., Cookson, S. W., Tsimring, L. S., Hasty, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+cycle-dependent+variations+in+protein+concentration%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Cell cycle-dependent variations in protein concentration.</a> Nucleic Acids Res. 38 (8), 2676-2681 (2010).</li>
<li>Plate, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+molecule+proteostasis+regulators+that+reprogram+the+ER+to+reduce+extracellular+protein+aggregation%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Small molecule proteostasis regulators that reprogram the ER to reduce extracellular protein aggregation.</a> eLife. 5, e15550(2016).</li>
<li>Mizushima, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+mammalian+autophagy+in+protein+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Jpn+Acad+Ser+B+Phys+Biol+Sci%22%5BJournal%5D)">The role of mammalian autophagy in protein metabolism.</a> Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 83 (2), 39-46 (2007).</li>
<li>Nanayakkara, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagic+lysosome+reformation+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Autophagic lysosome reformation in health and disease.</a> Autophagy. 19 (5), 1378-1395 (2023).</li>
<li>Nozawa, T., Minowa-Nozawa, A., Aikawa, C., Nakagawa, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+STX6-VTI1B-VAMP3+complex+facilitates+xenophagy+by+regulating+the+fusion+between+recycling+endosomes+and+autophagosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">The STX6-VTI1B-VAMP3 complex facilitates xenophagy by regulating the fusion between recycling endosomes and autophagosomes.</a> Autophagy. 13 (1), 57-69 (2017).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>0.25 % Tripsina EDTA</td><td>Fujifilm Wako</td><td>201-16945</td><td></td></tr><tr><td>10 cm Plato</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>150464</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Tubo</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>339650</td><td></td></tr><tr><td>200 &mu; L Punta de pipeta</td><td>Nippon Genetics</td><td>FG-301</td><td>pipeteo</td></tr><tr><td>2-Mercaptoetanol</td><td>Nacalai Tesque</td><td>21417-52</td><td>un material para solución tampón</td></tr><tr><td>de muestra 3,3'-Diaminobenzidina tetraclorhidrato Nacalai</td><td>Tesque</td><td>11009-41</td><td>un material para solución DAB</td></tr><tr><td>3,5 cm Plato&nbsp;</td><td>Plato Thermo Fisher Scientific</td><td>150460</td><td></td></tr><tr><td>6 cm&nbsp;</td><td>TrueLine</td><td>TR4001</td><td></td></tr><tr><td>Baños termostáticos de bloque de aluminio (termobaños secos)</td><td>EYELA</td><td>273860</td><td></td></tr><tr><td>Aspirador</td><td>SANSYO</td><td>SAP-102</td><td>solución inhalatoria</td></tr><tr><td>Avanti JXN-30</td><td>Beckman Coulter</td><td>B34193</td><td></td></tr><tr><td>Bafilomycin A1</td><td>Adipogen</td><td>BVT-0252</td><td></td></tr><tr><td>Vector de anticuerpos IgG anti-conejo de cabra conjugada con biotina</td><td> Laboratorios&nbsp;</td><td>BA-1000</td><td>2º anticuerpo para inmunotransferencia</td></tr><tr><td>Laboratorio de vectores de anticuerpos IgG antiratón de caballo conjugado con biotina</td><td>&nbsp;</td><td>BA-2000</td><td>2º anticuerpo para el bloqueo de inmunotransferencia</td></tr><tr><td>Un</td><td>Nacalai Tesque</td><td>03953-95</td><td>un material para inmunotransferencia</td></tr><tr><td>Azul de bromofenol</td><td>Nacalai Tesque</td><td>05808-61</td><td>un material para solución tampón de muestra</td></tr><tr>de<td>ternera Suero de ternera</td><td>cytiva</td><td>SH30073.03</td><td></td></tr><tr><td>CanoScan LiDE 220</td><td>Canon</td><td>CSLIDE220</td><td>Scanner</td></tr><tr><td>centrífuga 5702 R</td><td>eppendolf</td><td>5703000039</td><td></td></tr><tr><td>portaobjetos de recuento de doble cámara</td><td>Bio-Rad</td><td>1450015J</td><td></td></tr><tr><td>recuento de células Sonificador digital 450</td><td>BRANSON</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido</td><td>Nacalai Tasque</td><td>09659-14</td><td>vehículo</td></tr><tr><td>DMEM Alta glucosa</td><td>Nacalai Tesque</td><td>08458-45 medio de</td><td>cultivo</td></tr><tr><td>DMEM sin Rojo Fenol</td><td>Nacalai Tesque</td><td>08489-45 medio de</td><td>cultivo</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Dojindo&nbsp;</td><td>348-01311</td><td>un material para la solución A68</td></tr><tr><td>Excel</td><td>Microsoft</td><td>versión 16.16.27</td><td>análisis estadístico</td></tr><tr><td>EZR</td><td>Referencia Nº 24</td><td>versión 1.68</td><td>análisis estadístico</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Sigma</td><td>173012</td><td>medio de cultivo</td></tr><tr><td>Fiji</td><td>NIH</td><td></td><td>Herramienta de análisis de imágenes</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Nacalai Tesque</td><td>09886-05</td><td>un material para solución tampón de muestra</td></tr><tr><td>Hoehst33342</td><td>Dojindo&nbsp;</td><td>Peróxido de hidrógeno H342</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Fujifilm Wako</td><td>080-0186</td><td>un material para solución DAB</td></tr><tr><td>Kimwipe S-200</td><td>NIPPON PAPER CRECIA</td><td>62011</td><td>toallita de limpieza</td></tr><tr><td>Tubo de baja retención</td><td>Nippon Genetics</td><td>FG-MCT015CLB</td><td>transfección de siRNA y ADN</td></tr><tr><td>LSM780 Microscopio láser confocal</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ratón monoclonal Anti-LC3 Anticuerpo</td><td>MBL</td><td>M186-3</td><td>1er anticuerpo para inmunotransferencia</td></tr><tr><td>Cloruro de níquel (II) hexahidratado</td><td>Fujifilm Wako</td><td>149-01041</td><td>un material para solución de DAB</td></tr><tr><td>N-Lauroilsarcosina Sal de sodio</td><td>Nacalai Tesque</td><td>20117-12</td><td></td></tr><tr><td>Optima XE-90 Ultracentrífuga</td><td>Beckman Coulter</td><td>A94471</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I Medio de suero reducido</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31985-070</td><td>transfección de siRNA y ADN</td></tr><tr><td>pEGFP-C1-hAtg13</td><td>Addgene</td><td>22875</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina</td><td>Nacalai Tesque</td><td>26253-84 Medio de</td><td>cultivo</td></tr><tr><td>Pierce BCA Kits de ensayo</td><td>de proteínas Thermo Fisher Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo policlonal anti-PCNA de conejo</td><td>BioAcademia</td><td>70-080</td><td>1er anticuerpo para inmunoblotting</td></tr><tr><td>Conejo policlonal Anticuerpo anti-sintaxina 6</td><td>ProteinTech</td><td>10841-1-AP 1er</td><td>anticuerpo para inmunoblotting</td></tr><tr><td>Conejo policlonal Anticuerpo anti-TSG101</td><td>ProteinTech</td><td>28283-1-AP</td><td>1er anticuerpo para inmunotransferencia</td></tr><tr><td>Conejo policlonal Anticuerpo anti-ULK1</td><td>ProteinTech</td><td>20986-1-AP</td><td>1er anticuerpo para inmunoblotting</td></tr><tr><td>Difluoruro de polivinilideno Milliore de membrana</td><td></td><td>IPVH00010</td><td>un material para el inmunoblot</td></tr><tr><td>Equipo</td><td>central de desarrollo</td> de R R <td>versión 4.4.1</td><td>análisis estadístico</td></tr><tr><td>RNAiMAX</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13778</td><td>siRNA reactivo de transfección</td></tr><tr><td>siRNA STX6</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>HSS115604 siRNA para la transfección</td></tr><tr><td>Cloruro de sodio</td><td>Nacalai Tesque</td><td>31320-05</td><td>un material para tampón Tris y solución A68</td></tr><tr><td>Sulfato de dodecilo sódico</td><td>Fujifilm Wako</td><td>192-13981</td><td>un material para solución tampón de muestra</td></tr><tr><td>SPARK Lector de microplacas</td><td>TECAN</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stealth RNAi Dúplex de control negativo, Med GC</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12935300</td><td>transfección de siRNA</td></tr><tr><td>Sacarosa</td><td>Fujifilm Wako</td><td>193-00025</td><td>un material para la solución A68</td></tr><tr><td>TC20 Contador de células automatizado con impresora térmica</td><td>Bio-Rad</td><td>1450109J1</td> Recuento <td>de células</td></tr><tr><td>Termobaño</td><td>TOKYO RIKAKIKAI</td><td>MG-3100</td><td>incubación</td></tr><tr><td>TransIT-293</td><td>Mirus Bio</td><td>MIR 2700</td><td>reactivo de transfección</td></tr><tr><td>de ADN TransIT-LT1</td><td>Mirus Bio MIR2300</td><td></td><td>reactivo</td></tr> <tr><td>de transfección de ADNTris(hidroximetil)aminometano</td><td>Nacalai Tesque</td><td>35406-75</td><td>un material para tampón Tris, tampón de muestra y solución A68</td></tr><tr><td>Tinte azul de tripano 0,40%</td><td>Bio-Rad</td><td>1450021</td><td>recuento</td></tr><tr><td>de células Tubo abierto ultratransparente, 16 x 96 mm&nbsp;</td>Recogida de <td>361706</td> <td>Beckman Coulter</td><td>para la fracción P1</td></tr><tr><td>EV Ultra-Clear Tube, 14 x 89 mm</td><td>Beckman Coulter</td><td>344059</td><td>recogida para la fracción P2</td></tr><tr><td>EV Vectastain ABC Standard Kit</td><td>Vector Laboratories&nbsp;</td><td>PK-4000</td><td>immunoblotting</td></tr><tr><td>Botella de lavado</td><td>como uno</td><td>1-4640-02</td><td>membrana de lavado</td></tr><tr><td>&mu;-Slide 8 Well High</td><td>ibidi</td><td>80806</td><td></td></tr></tbody></table>

evaluación de la liberación de lc3-ii a través de vesículas extracelulares en relación con la acumulación de vesículas intracelulares lc3 positivas

Evaluation of LC3-II Release via Extracellular Vesicles in Relation to the Accumulation of Intracellular LC3-positive Vesicles

Como se demostró en estudios previos, el tratamiento con Baf aumentó los niveles de TSG101 (P1: P &lt; 0,01, P2: P = 0,012, según lo determinado por ANOVA de dos factores en EZR19) y LC3-II (P1: P &lt; 0,01, P2: P &lt; 0,01, según lo determinado por ANOVA de dos vías en EZR19) en la fracción rica en EV. En particular, el tratamiento con Baf también aumentó los niveles de STX6 (P1: P &lt; 0,01, P2: P &lt; 0,01, según lo determinado por ANOVA de dos vías en EZR19) en la fracción EV (Figura 1A), lo que sugiere que STX6 puede ser un componente de los EV. No se observó antígeno nuclear de células proliferantes (PCNA) en la fracción EV. La inmunotransferencia de STX6 en la fracción celular reveló que los niveles de STX6 disminuyeron a la mitad con su eliminación de siRNA (Figura 1B). La caída de STX6 no afectó los niveles de TSG101 en las fracciones de celda y EV en condiciones tratadas con vehículo y Baf (Figura 1C). Sin embargo, la eliminación de STX6 aumentó los niveles de LC3-II en la fracción celular en la condición tratada con vehículo, pero no en la condición tratada con Baf. El knockdown de STX6 también aumentó los niveles de LC3-II en la fracción EV bajo la condición tratada con Baf (Figura 1D). Estos hallazgos sugieren que los métodos utilizados para detectar LC3-II en VE mediante inmunotransferencia son suficientemente sensibles, incluso si la eficiencia de derribo no es sustancial. Además, estos resultados indican que la eliminación de STX6 aumenta el número de autofagosomas intracelulares y aumenta la liberación extracelular de vesículas asociadas a autofagosomas bajo el tratamiento con Baf.
Para investigar más a fondo si la reducción de STX6 influye en el número de autofagosomas y autolisosomas intracelulares, se visualizaron autofagosomas y lisosomas utilizando el marcador de autofagosomas mCherry-LC3 y el marcador de lisosoma LAMP1-GFP. Las imágenes confocales de células vivas revelaron vesículas positivas para GFP y mCherry en células HeLa que expresaban LAMP1-GFP y mCherry-LC3 (Figura 2A). Los autolisosomas se identificaron como vesículas GFP y mCherry positivas, mientras que los autofagosomas se identificaron como vesículas GFP negativas y mCherry positivas. La eliminación de STX6 aumentó el número de autofagosomas y autolisosomas en la condición tratada con el vehículo (Figura 2B, C). Sin embargo, la reducción de STX6 no afectó los números de autofagosomas y autolisosomas en la condición tratada con Baf (Figura 2B, C).
Para determinar si el aumento en el número de autofagosomas intracelulares debido a la eliminación de STX6 se debía a una mayor formación de autofagosomas, se examinó la formación de omegasomas, un proceso necesario para la formación de autofagosomas, utilizando la intensidad de la señal del marcador de omegasomas GFP-ATG13. Las imágenes confocales de células vivas proporcionaron una imagen ensamblada de GFP-ATG13, lo que indica la formación de omegasomas (Figura 3A). La caída de STX6 disminuyó la intensidad de la señal GFP-ATG13 (P = 0,023, según lo determinado por el ANOVA de dos vías en EZR19). Si bien la caída de STX6 no influyó significativamente en la intensidad de la señal GFP-ATG13 en la condición tratada con el vehículo, disminuyó significativamente la señal en condiciones tratadas con Baf (Figura 3B). En conjunto, estos hallazgos indican que el knockdown de STX6 aumenta la liberación de vesículas positivas para LC3-II relacionadas con la acumulación de vesículas asociadas al autofagosoma.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67385/67385fig01.jpg"> 
Figura 1: Resultados de inmunotransferencia de las fracciones celulares, P1 y P2 de células HeLa transfectadas con siRNA de control o STX6 bajo tratamiento con vehículo o Baf. Las células HeLa se trataron con vehículo (DMSO) o 100 nM Baf durante 24 h después de la transfección con control o siRNA STX6 . Se aislaron las fracciones de celda P1 (pellet de 20.000 × g ) y P2 (pellet de 110.000 × g ). (A) Imágenes representativas de inmunotransferencia de cada fracción que muestran STX6, TSG101, LC3 y PCNA. (B-D) El análisis densitométrico para (B) STX6, (C) TSG101 y (D) LC3-II se realizó a partir de las imágenes de inmunotransferencia. Las intensidades de la señal se normalizaron a las células de control o transfectadas con siRNA STX6 tratadas con vehículo o Baf. Los gráficos de barras representan valores medios ± S.E.M. (N = 3). * indica P &lt; 0.05 mediante una prueba t desapareada de dos colas en Excel. Abreviaturas: STX6 = sintaxina 6; Baf = bafilomicicina A1; DMSO = sulfóxido de dimetilo; TSG101 = gen de susceptibilidad tumoral 101; LC3 = proteínas asociadas a microtúbulos 1A/1B cadena ligera 3B; PCNA = antígeno nuclear de células proliferantes; S.E.M. = error estándar de la media. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67385/67385fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67385/67385fig02.jpg"> 
Figura 2: Análisis de imagen confocal de células HeLa que coexpresan Lamp1-GFP y mCherry-LC3 transfectadas con siRNA de control o STX6 en la condición tratada con vehículo y Baf. (A) Las imágenes confocales de las células HeLa que expresan de manera estable LAMP1-GFP y mCherry-LC3 se transfectaron con siRNA de control o STX6 durante 48 h, seguidas de exposición a DMSO o 400 nM Baf durante 4 h. Barra de escala = 20 μm. (B,C) La quenatación de (B) autofagosomas (LAMP1-GFP puntos negativos y mCherry-LC3 positivos) y (C) autolisosomas (LAMP1-GFP y mCherry-LC3 puntos dobles positivos) se realizó utilizando software Fiji. Los datos de los gráficos de barras se presentan como valores medios ± S.E.M. (N = 3). * indica P &lt; 0.05, basado en una prueba t no apareada de dos colas en Excel. Abreviaturas: Lamp1 = proteína de membrana 1 asociada a lisosomas; LC3 = proteínas asociadas a microtúbulos 1A/1B cadena ligera 3B; STX6 = sintaxina 6; Baf = bafilomicicina A1; GFP = proteína verde fluorescente; S.E.M. = error estándar de la media. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67385/67385fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67385/67385fig03.jpg"> 
Figura 3: Imagen confocal de células HeLa que expresan GFP-ATG13, transfectadas con siRNA de control o STX6 , y sometidas a tratamiento con vehículo o Baf. (A) Las células HeLa se transfectaron con siRNA de control o STX6 , seguidas de transfección con pEGFP-C1-hAtg13 y se trataron con DMSO o 400 nM Baf durante 4 h. Barra de escala = 20 μm. (B) Las intensidades relativas de la señal se determinaron normalizando la señal en cada condición a la de las células de control transfectadas con siRNA tratadas con Baf. El gráfico de barras muestra los datos como medias ± S.E.M. (N = 3). * indica P &lt; 0.05 por la prueba t no apareada de dos colas en Excel. Abreviaturas: hAtg13 = gen 13 relacionado con la autofagia humana; STX6 = sintaxina 6; Baf = bafilomicicina A1; DMSO = sulfóxido de dimetilo; S.E.M. = error estándar de la media. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67385/67385fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Figura suplementaria S1: Análisis de inmunotransferencia de las fracciones celulares, P1 y P2 de células HeLa transfectadas con siRNA de control y tratadas con Baf. Las células HeLa se transfectaron con siRNA de control y se expusieron a 100 nM Baf durante 24 h. A continuación, se prepararon las fracciones: celda, P1 (pellet de 20.000 × g ) y P2 (pellet de 110.000 × g). Imágenes representativas de inmunotransferencia de ULK1 y PCNA, que muestran sus niveles en cada fracción para su comparación. Abreviaturas: Baf = bafilomicicina A1; ULK1 = unc-51 como la quinasa activadora de autofagia 1; PCNA = antígeno nuclear de células proliferantes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67385/67385_Supplementary%20Figure%201.zip" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>

Evaluación de la liberación de LC3-II a través de vesículas extracelulares en relación con la acumulación de vesículas intracelulares LC3 positivas

(Macro)autophagy represents a fundamental cellular degradation pathway. In this process, double-membraned vesicles known as autophagosomes engulf ...

evaluation-lc3-ii-release-via-extracellular-vesicles-relation-to

Research

Investigación

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

En este sentido, se utilizó la citometría de flujo de imágenes multiespectrales con una característica analítica que compara imágenes detalladas de 3 marcadores de autofagia y cuantifica su co-localización, junto con el recuento de puntos LC3, para medir la autofagia de una manera objetiva, cuantitativa y estadísticamente robusta.

Evaluación del flujo autofágico midiendo la co-localización de LC3, p62 y LAMP1 usando citometría de flujo de imágenes multiespectrales

Mitofagia, el proceso de claro dañaado las mitocondrias, es necesario para el mantenimiento de la homeostasis y salud mitocondrial. Este artículo presenta algunas de la mitofagia últimos métodos de detección en células humanas, Caenorhabditis elegansy los ratones.

In Vitro e In Vivo la detección de la mitofagia en células humanas, C. Elegansy los ratones

Estrés osmótico afecta la exocitosis y la cantidad de neurotransmisor liberado durante este proceso. Demostramos cómo la combinación de métodos electroquímicos junto con microscopia electrónica de transmisión se puede utilizar para estudiar el efecto de la presión osmótica extracelular sobre la actividad de la exocitosis, tamaño cuántico de la vesícula y la cantidad de neurotransmisor liberado durante la exocitosis.

El efecto del estrés osmótico en vesículas secretoras y exocitosis de monitoreo

Aquí se describe un protocolo simple y bien validado para medir la actividad de autofagia secuestro a granel en células de mamíferos. El método se basa en cuantificar la proporción de lactato deshidrogenasa (LDH) en fracciones celulares de sedimentables en comparación con los niveles de LDH celulares total.

El ensayo de secuestro del lactato deshidrogenasa, Es un método Simple y confiable para determinar la actividad de autofagia secuestro a granel en células de mamíferos

El presente informe destaca los requisitos cronológicos para el aislamiento de vesículas extracelulares (EV) de la microglia o de los macrófagos sanguíneos. Los vehículos eléctricos derivados de la microglia se evaluaron como reguladores del crecimiento de la neurita, mientras que los vehículos eléctricos derivados de macrófagos sanguíneos se estudiaron en el control de la invasión de células de glioma C6 en ensayos in vitro. El objetivo es comprender mejor estas funciones EV como mediadores...

Caracterización de vesículas extracelulares derivadas de células inmunes y estudio del impacto funcional en el entorno celular

Aquí, presentamos un protocolo para etiquetar las vesículas extracelulares derivadas del lisado plaquetario para monitorear su migración y absorción en los explantes de cartílago utilizados como modelo para la osteoartritis.

Etiquetado de vesículas extracelulares para monitorear la migración y absorción en explantes de cartílago

Las vesículas extracelulares (EV) contribuyen a la biología celular y las comunicaciones intercelulares. Existe la necesidad de ensayos prácticos para visualizar y cuantificar la absorción de EV por las células. El protocolo actual propone el ensayo de captación de EV mediante la utilización de imágenes de fluorescencia tridimensional a través de microscopía confocal, después del aislamiento de EV por un dispositivo microfluídico basado en nanofiltración.

Ensayo de captación de vesículas extracelulares mediante análisis de imágenes con microscopio confocal

La inactivación láser asistida por cromóforo (CALI) mediada por AlPcS2a es una poderosa herramienta para estudiar el daño espaciotemporal de vesículas intracelulares (IV) en células vivas.

Un enfoque fotodinámico para estudiar la función de la ruptura de vesículas intracelulares

El objetivo de este protocolo es determinar los niveles autofágicos en el cáncer de páncreas y las células acinares pancreáticas a través de la inmunofluorescencia LC3 y la cuantificación de puntos LC3.

Evaluación de los niveles de autofagia en dos modelos diferentes de células pancreáticas utilizando inmunofluorescencia LC3

El protocolo propuesto incluye pautas sobre cómo evitar la contaminación con endotoxinas durante el aislamiento de vesículas extracelulares de sobrenadantes de cultivos celulares y cómo evaluarlas adecuadamente.

Aislamiento de vesículas extracelulares de bajo contenido de endotoxinas derivadas de líneas celulares cancerosas

Aquí, presentamos un protocolo para la microscopía correlativa de luz-electrónica optimizada en sección basada en el marcaje endógeno y fluorescente como herramienta para investigar la localización de proteínas raras en relación con la ultraestructura celular. El poder de este enfoque se demuestra mediante la localización ultraestructural de LC3 endógena en células hambrientas sin tratamiento con bafilomycina.

Localización ultraestructural de LC3 endógena mediante microscopía óptica correlativa en sección

Aprende a evaluar la liberación de LC3-II mediante vesículas extracelulares en células HeLa. Este método permite estudiar la regulación de la autofagia en enfermedades neurodegenerativas como ELA y FTLD-TDP.

Evaluación de la liberación de LC3-II a través de vesículas extracelulares en relación con la acumulación de vesículas intracelulares LC3 positivas (Video) | JoVE Journal

Evaluación de la liberación de LC3-II a través de vesículas extracelulares en relación con la acumulación de vesículas intracelulares LC3 positivas

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