Evaluación de la liberación de LC3-II a través de vesículas extracelulares en relación con la acumulación de vesículas intracelulares LC3 positivas
18 de octubre de 2024
En este trabajo se presenta la metodología para evaluar de forma concisa los niveles de LC3-II del marcador autofagosoma en vesículas extracelulares (VE) mediante inmunotransferencia. El análisis de los niveles de LC3-II en EV, la formación de autolisosomas y la formación de omegasomas sugiere el nuevo papel de STX6 en la liberación de EV positivos para LC3-II cuando se inhibe la fusión autofagosoma-lisosoma.
Nuestra investigación se centra en enfermedades neurodegenerativas progresivas caracterizadas por la acumulación de la proteína nuclear TDP-43 en el citoplasma, como la ELA o la FTLD-TDP. Nuestro objetivo es comprender cómo las patologías de TDP-43 se propagan a través del cerebro de una manera similar a un prión. Previamente encontramos que la liberación de TDP-43 a través de vesículas extracelulares está mediada por la desregulación de la autofagia.
La progranulina de FTLD-TDP facilita este proceso. El siguiente reto es esclarecer cómo la autofagia regula la producción y liberación de vesículas extracelulares que contienen TDP-43, lo que podría conducir al descubrimiento de dianas terapéuticas para la ELA o FTLD-TDP. Para comenzar, tome las células HeLa cultivadas, cuéntelas usando un contador de células y siembre una vez diez a la potencia de seis células en una placa de seis centímetros que contenga un medio de cultivo.
Incubar las celdas a 37 grados centígrados con 5% de dióxido de carbono y humedad controlada durante 24 horas. A continuación, prepare una solución de siRNA de 20 micromolares. Mezcle 100 microlitros de medio sérico reducido y tres microlitros de siRNA en un tubo de baja retención para preparar la solución A. Luego, mezcle 100 microlitros de medio sérico reducido y cinco microlitros de reactivo de transfección en un tubo de baja retención para preparar la solución B. Después de eso, mezcle la solución A y la solución B, luego incube la mezcla a temperatura ambiente durante cinco minutos.
Ahora agregue la mezcla de soluciones A y B al medio utilizado para cultivar células HeLa e incube durante 24 horas. Al día siguiente, lavar las células con PBS y exponerlas a 500 microlitros de tripsina al 0,25% y una solución de EDTA milimolar a 37 grados centígrados con dióxido de carbono al 5% y humedad controlada durante cinco minutos. A continuación, añada 2,5 mililitros del medio de cultivo a las células y, con una pipeta de transferencia Pasteur con una punta de pipeta de 20 microlitros acoplada, prepare una suspensión unicelular.
Después de contar las células, siembre una por diez a la potencia de seis células en un plato de diez centímetros e incube, como se demostró anteriormente. Al final de la incubación, prepare el medio de cultivo que contenga bafilomicicina A1 vehículo o 100 nanomolares. A continuación, exponga las células al medio que contenga bafilomycina A1 de 100 nanomolares e incube durante 24 horas. Al día siguiente, recoja todo el medio de cultivo de la placa de 10 centímetros.
Transfiera el medio recolectado a un tubo de 15 mililitros y centrifuérrelo a 3.000 g durante 10 minutos a cuatro grados centígrados para eliminar los restos celulares. Para aislar la fracción de vesícula extracelular P1, transfiera el sobrenadante después de la centrifugación a 3.000 G a un tubo de centrifugación. Centrifugar el tubo a 20.000 g a cuatro grados centígrados durante una hora.
Para el aislamiento de la fracción de vesícula extracelular P2, transfiera el sobrenadante después de la centrifugación a 20.000 G a un tubo ultracentrífugo. Centrifugar a 110.000 g a cuatro grados centígrados durante una hora. Después de limpiar el exceso de humedad dentro del tubo con una toallita de laboratorio, vuelva a suspender los gránulos restantes en el tubo de centrifugación en 50 microlitros de tampón de muestra de dos tiempos para preparar la fracción de vesícula extracelular P1.
A continuación, retire el sobrenadante por decantación. Limpie el exceso de humedad dentro del tubo con una toallita de laboratorio y vuelva a suspender los gránulos restantes en el tubo de ultracentrifugación en 50 microlitros de tampón de muestra de dos tiempos para preparar la fracción de vesícula extracelular P2. Incubar las fracciones de vesículas extracelulares P1 y P2 a 100 grados centígrados en un bloque de calor durante 10 minutos.
Después de transferir el medio de cultivo de la placa de 10 centímetros a un tubo de 15 mililitros, lave las células en el plato de 10 centímetros con PBS. A continuación, exponga las células a dos mililitros de tripsina al 0,25% y una solución de EDTA milimolar a 37 grados centígrados con 5% de dióxido de carbono y humedad controlada durante cinco minutos. Agregue ocho mililitros de medio de crecimiento a las células.
Con una pipeta de transferencia Pasteur con una punta de pipeta de 200 microlitros acoplada, pipetee las células para preparar una suspensión unicelular. Transfiera la suspensión celular a un tubo de 15 mililitros y centrifugue a 1.000 g durante 10 minutos a cuatro grados centígrados. A continuación, retire el sobrenadante con un aspirador.
Añadir PBS al pellet de la célula y centrifugar a 1.000 g durante cinco minutos a cuatro grados centígrados. Después de eliminar el PBS, sonique el pellet de la célula en un mililitro de tampón A68 que contenga 1% de sarcosil. Mezcle 300 microlitros del lisado celular con 100 microlitros de tampón de muestra de cuatro veces.
Incubar la mezcla a 100 grados centígrados en un bloque de calor durante 10 minutos para preparar la fracción celular.
Descripción general
Este estudio investiga el papel de la TDP-43 en las enfermedades neurodegenerativas y su liberación mediante vesículas extracelulares (EV). La investigación destaca la participación de la autofagia en la regulación de la liberación de la TDP-43, lo que podría conducir a dianas terapéuticas para la ELA y la FTLD-TDP.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biología celular
- Enfermedades neurodegenerativas
Antecedentes
- La TDP-43 es una proteína nuclear asociada con enfermedades neurodegenerativas.
- La ELA y la DTFT-TDP se caracterizan por la acumulación de TDP-43 en el citoplasma.
- Comprender la patología de la TDP-43 podría revelar mecanismos de diseminación de la enfermedad.
- Las vesículas extracelulares desempeñan un papel en la liberación de TDP-43.
Objetivo del estudio
- Clarificar cómo la autofagia regula la producción y liberación de EV que contienen TDP-43.
- Explorar posibles dianas terapéuticas para la ELA y la FTLD-TDP.
- Investigar el papel de la progranulina en la liberación de TDP-43.
Métodos Utilizados
- Cultivo celular de células HeLa.
- Conteo de células utilizando un contador celular.
- Siembra de células en medio de cultivo para experimentación.
- Inmunotransferencia para evaluar los niveles de marcadores de autofagosomas.
Resultados principales
- Identificación del papel de STX6 en la liberación de EV positivos para LC3-II.
- Análisis de los efectos de la inhibición de la fusión entre autofagosoma y lisosoma.
- Evidencia de la disregulación de la autofagia en la liberación de TDP-43.
- La facilitación por parte de la progranulina de la liberación de TDP-43 mediante EVs.
Conclusiones
- La autofagia es crucial para la regulación de la liberación de TDP-43.
- El enfoque en la autofagia podría proporcionar nuevas vías terapéuticas para la ELA y la FTLD-TDP.
- Se necesita más investigación para comprender completamente los mecanismos implicados.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La evaluación cuantitativa de la liberación de LC3-II mediante vesículas extracelulares (VE) proporciona una ventana mecanicista hacia el tráfico proteico dependiente de la autofagia, un proceso implicado en la progresión de enfermedades neurodegenerativas. Este protocolo permite a los equipos de biofármacos investigar los determinantes moleculares de la diseminación patológica de proteínas, apoyando la validación de dianas y el avance ajustado al riesgo en carteras de neurodegeneración. El enfoque fortalece la confianza predictiva en la intersección entre la modulación de la autofagia y la liberación de biomarcadores mediada por VE.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite la evaluación funcional de genes relacionados con la autofagia en la exportación de proteínas mediada por vesículas extracelulares.
- Apoya la desactivación mecanicista de riesgos al aislar el impacto de dianas candidatas, como STX6, en el tráfico de LC3-II.
- Facilita la interrogación basada en hipótesis de vías relevantes para enfermedades en neurodegeneración.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Proporciona un protocolo reproducible basado en inmunotransferencia para cuantificar LC3-II en fracciones celulares y de EV.
- Establece controles de ensayo mediante bafilomicina A1 para evaluar la inhibición de la fusión autofagosoma-lisosoma.
- Permite la estandarización del aislamiento de EV y la cuantificación de marcadores para aplicaciones de cribado posteriores.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Se alinea con estrategias traslacionales de biomarcadores al cuantificar la LC3-II asociada a vesículas extracelulares bajo perturbaciones relevantes para la enfermedad.
- Apoya la continuidad desde el descubrimiento mecanicista hasta la validación preclínica de intervenciones que modulan la autofagia.
- Proporciona una plataforma para evaluar la diseminación extracelular de proteínas patológicas en modelos de enfermedades neurodegenerativas.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
Este protocolo se integra en la continuidad desde el descubrimiento hasta la fase preclínica al permitir lecturas cuantitativas y mecanicistas de la autofagia y la biología de las vesículas extracelulares.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la prueba de hipótesis nula para genes diana que regulan la exportación de LC3-II mediante EVs.
- Tamizaje: Proporciona resultados cuantitativos estandarizados de inmunotransferencia para análisis comparativo entre condiciones.
- Análisis: Permite la medición de LC3-II y TSG101 como marcadores independientes para la especificidad de la vía y de las vesículas.
- Investigación Traducional: Conecta hallazgos mecanicistas con modelos relevantes para enfermedades de agregación y diseminación proteica.
- Reutilización Empresarial: Ofrece un flujo de trabajo modular adaptable a diversos programas de investigación sobre autofagia y EVs.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva en la validación de dianas para las vías de autofagia y de vesículas extracelulares (EV).
- Valor operativo: Estandariza el aislamiento de EV y la cuantificación de LC3-II para estudios reproducibles y escalables.
- Valor estratégico: Informa decisiones de avance o interrupción de dianas en neurodegeneración al aclarar sus roles mecanicistas en la diseminación de proteínas.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de candidatos que modulan la autofagia en las líneas de desarrollo para enfermedades neurodegenerativas.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en cultivo celular, transfección con siRNA y técnicas de inmunotransferencia.
- Exige acceso a infraestructura de centrifugación de alta velocidad y ultracentrífugos para el aislamiento de EV.
- Necesita una estandarización rigurosa entre equipos en la preparación de muestras y la cuantificación de marcadores.
- Es adaptable a diversos modelos celulares, pero puede requerir optimización en sistemas primarios o relevantes para enfermedades.
- La interpretación de los resultados de LC3-II y TSG101 debe considerar la especificidad de la vía y los controles experimentales.
