Name: Marcaje final fluorescente y encapsulación de ARN largos para microscopía FRET-TIRF de molécula única (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-18T14:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 59 s
Description: Aprende a realizar marcaje dual de ARN largos y encapsulación en vesículas de fosfolípidos para microscopía TIRF de molécula única. Este protocolo permite visualizar la dinámica del plegamiento del ARN en tiempo real.

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<meta charset="utf8"></head><body>Marcaje final de doble color y encapsulación de vesículas de ARN para estudios smFRET-TIRF

<ol><li>Eitan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FRET-based+dynamic+structural+biology%3A+Challenges%2C+perspectives+and+an+appeal+for+open-science+practices%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">FRET-based dynamic structural biology: Challenges, perspectives and an appeal for open-science practices.</a> Elife. 10, e60416(2021).</li>
<li>Taekjip, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+resonance+energy+transfer+at+the+single-molecule+level%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Methods+Primers%22%5BJournal%5D)">Fluorescence resonance energy transfer at the single-molecule level.</a> Nat Rev Methods Primers. 4, 22(2024).</li>
<li>Ahunbay, E., Steffen, F. D., Zelger-Paulus, S., Sigel, R. K. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+dual+end-labeling+of+large+ribozymes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Chemical dual end-labeling of large ribozymes.</a> Methods Mol Biol. 2439, 191-204 (2022).</li>
<li>Ahunbay, E., Zelger-Paulus, S., Sigel, R. K. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Group+II+Introns%3A+Highly+structured+yet+dynamic%5BTitle%5D)+AND+%22Chimia+%28Aarau%29%22%5BJournal%5D)">Group II Introns: Highly structured yet dynamic.</a> Chimia (Aarau). 77 (4), 235-241 (2023).</li>
<li>Steiner, M., Karunatilaka, K. S., Sigel, R. K. O., Rueda, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+studies+of+group+II+intron+ribozymes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Single-molecule studies of group II intron ribozymes.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 105 (37), 13853-13858 (2008).</li>
<li>Karunatilaka, K. S., Solem, A., Pyle, A. M., Rueda, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+analysis+of+Mss116-mediated+group+II+intron+folding%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single-molecule analysis of Mss116-mediated group II intron folding.</a> Nature. 467 (7318), 935-939 (2010).</li>
<li>Paudel, B. P., Fiorini, E., Börner, R., Sigel, R. K. O., Rueda, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+molecular+crowding+accelerates+group+II+intron+folding+and+maximizes+catalysis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Optimal molecular crowding accelerates group II intron folding and maximizes catalysis.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 115 (47), 11917-11922 (2018).</li>
<li>Saha, R., Verbanic, S., Chen, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+vesicles+chaperone+an+encapsulated+RNA+aptamer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Lipid vesicles chaperone an encapsulated RNA aptamer.</a> Nat Commun. 9 (1), 2313(2018).</li>
<li>Boukobza, E., Sonnenfeld, A., Haran, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immobilization+in+surface-tethered+lipid+vesicles+as+a+new+tool+for+single+biomolecule+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Phys+Chem+B%22%5BJournal%5D)">Immobilization in surface-tethered lipid vesicles as a new tool for single biomolecule spectroscopy.</a> J Phys Chem B. 105 (48), 12165-12170 (2001).</li>
<li>Cisse, I., Okumus, B., Joo, C., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fueling+protein+DNA+interactions+inside+porous+nanocontainers%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Fueling protein DNA interactions inside porous nanocontainers.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 104 (31), 12646-12650 (2007).</li>
<li>Zelger-Paulus, S., Hadzic, M. C. A. S., Sigel, R. K. O., Börner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Encapsulation+of+fluorescently+labeled+RNAs+into+surface-tethered+vesicles+for+single-molecule+FRET+studies+in+TIRF+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Encapsulation of fluorescently labeled RNAs into surface-tethered vesicles for single-molecule FRET studies in TIRF microscopy.</a> Methods Mol Biol. 2331, 1-16 (2020).</li>
<li>Okumus, B., Wilson, T. J., Lilley, D. M. J., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vesicle+encapsulation+studies+reveal+that+single+molecule+ribozyme+heterogeneities+are+intrinsic%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Vesicle encapsulation studies reveal that single molecule ribozyme heterogeneities are intrinsic.</a> Biophys J. 87 (4), 2798-2806 (2004).</li>
<li>Ishitsuka, Y., Okumus, B., Arslan, S., Chen, K. H., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature-independent+porous+nanocontainers+for+single-molecule+fluorescence+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Temperature-independent porous nanocontainers for single-molecule fluorescence studies.</a> Anal Chem. 82 (23), 9694-9701 (2010).</li>
<li>Liu, B., Mazouchi, A., Gradinaru, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trapping+single+molecules+in+liposomes%3A+surface+interactions+and+freeze-thaw+effects%5BTitle%5D)+AND+%22J+Phys+Chem+B%22%5BJournal%5D)">Trapping single molecules in liposomes: surface interactions and freeze-thaw effects.</a> J Phys Chem B. 114 (46), 15191-15198 (2010).</li>
<li>Chandradoss, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+passivation+for+single-molecule+protein+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Surface passivation for single-molecule protein studies.</a> J Vis Exp. (86), e50549(2014).</li>
<li>Paul, T., Myong, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+generation+and+regeneration+of+PEG-passivated+slides+for+single-molecule+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Protocol for generation and regeneration of PEG-passivated slides for single-molecule measurements.</a> STAR Protoc. 3 (1), 101152(2022).</li>
<li>Hadzic, M. C. A. S., Kowerko, D., Börner, R., Zelger-Paulus, S., Sigel, R. K. O. Detailed analysis of complex single molecule FRET data with the software MASH. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHadzic%2C+MCAS+%22Imaging%2C+Manipulation%2C+and+Analysis+of+Biomolecules%2C+Cells%2C+and+Tissues+IX%22">Imaging, Manipulation, and Analysis of Biomolecules, Cells, and Tissues IX</a>. Farkas, D. L., Nicolau, D. V., Leif, R. C. SPIE 971119, (2016).</li>
<li>Chu, B. C., Wahl, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Le+Orgel.+Derivatization+of+unprotected+polynucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Le Orgel. Derivatization of unprotected polynucleotides.</a> Nucleic Acids Res. 11 (18), 6513-6529 (1983).</li>
<li>Qin, P. Z., Pyle, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-specific+labeling+of+RNA+with+fluorophores+and+other+structural+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Site-specific labeling of RNA with fluorophores and other structural probes.</a> Methods. 18 (1), 60-70 (1999).</li>
<li>Whitfeld, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+the+determination+of+nucleotide+sequence+in+polyribonucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">A method for the determination of nucleotide sequence in polyribonucleotides.</a> Biochem J. 58 (3), 390-396 (1954).</li>
<li>Zamecnik, P. C., Stephenson, M. L., Scott, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Partial+purification+of+soluble+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Partial purification of soluble RNA.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 46 (6), 811-822 (1960).</li>
<li>Proudnikov, D., Mirzabekov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+methods+of+DNA+and+RNA+fluorescent+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Chemical methods of DNA and RNA fluorescent labeling.</a> Nucleic Acids Res. 24 (22), 4535-4542 (1996).</li>
<li>Wang, P. Y., Sexton, A. N., Culligan, W. J., Simon, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carbodiimide+reagents+for+the+chemical+probing+of+RNA+structure+in+cells%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Carbodiimide reagents for the chemical probing of RNA structure in cells.</a> RNA. 25 (1), 135-146 (2019).</li>
<li>Mitchell, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+RNA+structural+probing+of+uracil+and+guanine+base-pairing+by+1-ethyl-3-%283-dimethylaminopropyl%29carbodiimide+%28EDC%29%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">In vivo RNA structural probing of uracil and guanine base-pairing by 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide (EDC).</a> RNA. 25 (1), 147-157 (2019).</li>
<li>Rinaldi, A. J., Suddala, K. C., Walter, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Native+purification+and+labeling+of+RNA+for+single+molecule+fluorescence+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Native purification and labeling of RNA for single molecule fluorescence studies.</a> Methods Mol Biol. 1240, 63-95 (2015).</li>
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<li>Fiorini, E., Börner, R., Sigel, R. K. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mimicking+the+in+vivo+Environment--The+Effect+of+Crowding+on+RNA+and+Biomacromolecular+Folding+and+Activity%5BTitle%5D)+AND+%22Chimia%22%5BJournal%5D)">Mimicking the in vivo Environment--The Effect of Crowding on RNA and Biomacromolecular Folding and Activity.</a> Chimia. 69 (4), 207-212 (2015).</li>
<li>Peng, H., Lelievre, A., Landenfeld, K., Müller, S., Chen, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vesicle+encapsulation+stabilizes+intermolecular+association+and+structure+formation+of+functional+RNA+and+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Vesicle encapsulation stabilizes intermolecular association and structure formation of functional RNA and DNA.</a> Curr Biol. 32 (1), 86-96.e6 (2022).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td><marcado > ARN fuerte</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5&nbsp; mL de tubos LoBind de ADN&nbsp;</td><td>Eppendorf&nbsp;</td><td></td><td></td>30108035</tr><tr><td>Clorhidrato de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC-HCl o EDC)</td><td>Thermo Scientific</td><td>11844071</td><td>Pierce EDC, formato sin pesaje. Tienda en&nbsp; -20 &deg; C</td></tr><tr><td>3-morfolinopropano-1-ácido sulfónico (MOPS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>69947</td><td>BioUltra, para biología molecular, &ge; 99,5% (valoración)</td></tr><tr><td>Ácido acético (glacial)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1.00063</td><td>100%, anhidro para análisis EMSURE ACS,ISO,Reag. Ph Eur</td></tr><tr><td>Unidad de filtración centrífuga&nbsp;</td><td>Sartorius</td><td>VS0132</td><td>Vivaspin 500, MWCO 50.000, PES, 500 &mu; L</td></tr><tr><td>Hidrazida de cianina 5 (Cy5-hidrazida)</td><td>Lumiprobe</td><td>23070</td><td>5 mg, número CAS 1427705-31-4&nbsp;</td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido (DMSO)</td><td>New England Biolabs</td><td>12611P</td><td>Etanol de grado de biología molecular</td></tr><tr><td></td><td>VWR Chemicals</td><td>20821.296P</td><td>Absoluto &ge; 99,8%</td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td>para biología molecular, &ge; 99.0%</td></tr><tr><td>Ácido clorhídrico (HCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1.00317</td><td>fumante 37%, para análisis EMSURE ACS,ISO,Reag. Ph Eur</td></tr><tr><td>N-hidroxisuccinimida (NHS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>130672</td><td>98%</td></tr><tr><td>Acetato de sodio (NaOAc)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8750</td><td>anhidro, ReagentPlus, &ge; 99,0 %</td></tr><tr><td>Metaperiodato de sodio (NaIO4)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Life Technologies</td><td>20504</td><td>Línea de productos Pierce</td></tr><tr><td>Sulfo-Cianina3 amina (sCy3-amina)</td><td>Lumiprobe</td><td>213C0</td><td>5 mg, número CAS 2183440-43-7</td></tr><tr><td>Tris(hidroximetil)aminometano (Tris)</td><td>Biosolve</td><td>200923</td><td></td></tr> <tr><td>Grado <fuerte>Preparación de cámara</ trietoxisilano fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3-aminopropil) (APTES)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>440140</td><td>99%</td></tr><tr><td>Acetona</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1.00014</td><td>para análisis EMSURE ACS,ISO,Reag. Ph Eur</td></tr><tr><td>Biotina-Polietilenglicol-Valerato de succinimidilo (biotina-PEG-SVA, bPEG) y Valerato de metoxipolietilenglicol-succinimidilo (mPEG-SVA)</td><td>Laysan Bio, Inc.</td><td></td><td>BIO-PEG-SVA, MW 5.000 y MPEG-SVA, MW 5.000 - Cubreobjetos Combo</td></tr><tr><td>Kit Carl</td><td>Roth</td><td>H876.2</td><td>24 x 24 mm, 0.13-0.16&nbsp; mm de espesor</td></tr><tr><td>Deconex 11 perforador universal</td><td>Chemie AG</td><td>17416492</td><td>Solución de limpieza de cristalería de laboratorio</td></tr><tr><td>Broca de núcleo recubierta de diamante</td><td>Crystalite corporation</td><td></td><td>1 mm de espesor</td></tr><tr><td>Perforadora</td><td></td><td></td><td></td>de diamante</tr><tr><td>Etanol</td><td>VWR Chemicals</td><td>20821.296P</td><td>Absolute &ge; 99,8%</td></tr><tr><td>Tarro de tinción Coplin de vidrio con tapa</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Espaciador</td><td>de imagen Grace Bio-Labs</td><td>654008</td><td>SecureSeal, 8 pocillos,&nbsp; 9&nbsp; mm y tiempos; 0.12 y nbsp; mm</td></tr><tr><td>Limpiador de plasma de oxígeno</td><td>Zepto One</td><td></td><td>Diener</td></tr><tr><td>Hidróxido de potasio (KOH)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td>para biología molecular, &ge; 99.0%</td></tr><tr><td>Correderas de cuarzo</td><td>G. Finkenbeiner, Inc.</td><td></td><td>7.5 y nbsp; x&nbsp; 2.5&nbsp; cm, 1 mm de espesor</td></tr><tr><td>Bicarbonato de sodio (NaHCO3)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6297</td><td>BioXtra, 99,5-100,5%</td></tr><tr><td><fuerte>Preparación de tortas de lípidos</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>16:0 Biotinyl Cap PE, bPE (1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-(tapa biotinil) (sal sódica), C53H98N4O11PNaS)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>870277P</td><td>Estable durante 1 año a -20 &deg; C</td></tr><tr><td>14:0 PC, DMPC (1,2-ditetradecanoyl-sn-glicero-3-fosfocolina o 1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfocolina, C36H72NO8P)</td>Tubos de microcentrífuga <td>Avanti Polar Lipids</td><td>850345P</td><td></td></tr><tr><td>2.0 mL, Safe-Lock</td><td>Eppendorf</td><td>0030120094</td><td>Autoclave para esterilizar</td></tr><tr><td>500&nbsp; matraz</td><td></td><td></td><td></td>mL Schlenk</tr><tr><td>Chloroform Merck</td><td></td><td>1.02445</td><td>para análisis EMSURE ACS, ISO, Reag. Ph Eur</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inmovilización de superficie mediante encapsulación</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>(&plusmn;)-Ácido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcromano-2-carboxílico (Trolox&reg;)</td><td>Thermo Fischer</td><td>53188-07-1</td><td>97%</td></tr><tr><td>3-morfolinopropano-1-ácido sulfónico (MOPS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>69947</td><td>BioUltra, para biología molecular, &ge; 99,5% (valoración). Tienda en +4 &deg; C en la oscuridad.</td></tr><tr><td>Lengüetas de sellado adhesivo</td><td>Grace Bio-Labs&nbsp;</td><td>629200</td><td></td></tr><tr><td>Catalasa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9001-05-2, C30</td><td>de hígado bovino, suspensión acuosa, 10.000-40.000 unidades/mg proteína</td></tr><tr><td>D-glucosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7528</td><td>&ge; 99.5% (GC),</td></tr><tr><td>Membrana de policarbonato (PC) BioXtra Extruder</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>610005-1EA</td><td>0.1 &mu; m, 19 mm</td></tr><tr><td>Juego de extrusoras con bloque calefactor</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>610000</td><td></td></tr><tr><td>Glucosa oxidasa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9001-37-0</td><td>de Aspergillus niger, Tipo VII,&nbsp; polvo liofilizado, &ge; 100.000 unidades/g sólido (sin oxígeno añadido)</td></tr><tr><td>Cloruro de magnesio (MgCl2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7786-30-3, M1028</td><td>para biología molecular, 1,00 M &plusmn; 0,01 M solución</td></tr><tr><td>Disco de drenaje de poliéster (PE), membrana</td><td>Whatman, Cytiva</td><td>230300</td><td>10 mm</td></tr><tr><td>Cloruro de potasio (KCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60128</td><td>BioUltra, para biología molecular, &ge; 99,5% (AT)</td></tr><tr><td>Hidróxido de potasio (KOH)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td>para biología molecular, &ge; 99.0%</td></tr><tr><td>Estreptavidina</td><td>Thermo Fischer</td><td>434301</td><td></td></tr></tbody></table>

marcaje final fluorescente y encapsulación de arn largos para microscopía fret-tirf de molécula única

Fluorescent End-Labeling and Encapsulation of Long RNAs for Single-Molecule FRET-TIRF Microscopy

Presentamos el marcaje fluorescente simple y doble específico del ARN 915-nt de interés, el intrón mitocondrial Sc.ai5γ grupo II de levadura, flanqueado por secuencias exónicas. El par de fluoróforos FRET se posiciona en los extremos del ARN a través de la activación EDC/NHS del 5'-fosfato y la oxidación periodada de la 3'-ribosa, seguida de los respectivos aditivos al colorante. A continuación, verificamos los conjugados ARN-colorante mediante electroforesis en gel fluorescente, como se presenta en la Figura 4A. La comigración del ARN y los fluoróforos en el gel de agarosa confirma el éxito del etiquetado. A continuación, como se muestra en la Figura 4B, se utilizó espectroscopía de fluorescencia de conjunto para caracterizar el intrón del grupo II de doble marcado. La transferencia de energía, es decir, FRET, se observó tras la excitación del colorante donante, lo que demuestra el doble marcaje del ARN. En particular, en consonancia con la naturaleza dependiente de la distancia de FRET, el plegamiento del ARN del intrón del grupo II en presencia de iones metálicos condujo a un aumento en la eficiencia de FRET, como lo demuestra la disminución de la emisión del donante (flecha verde) y un aumento correspondiente en la emisión del aceptor (flecha roja). Esto indica que este etiquetado FRET rastrea los cambios conformacionales de la ribozima.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67391/67391fig04.jpg"> 
Figura 4: Caracterización de los conjugados ARN-colorante. (A) El análisis analítico basado en gel de ARN marcado con fluorescencia simple y doble muestra la comigración de los colorantes con el ARN en un gel de agarosa al 2%. La colocalización de los fluoróforos en la muestra de doble marcado se indica mediante la banda amarilla en la imagen fusionada (abajo) de los canales Cy3 (arriba, verde) y Cy5 (medio, rojo), visualizados bajo iluminación de 532 nm y 635 nm, respectivamente. Carril 1: 5'-sCy3 solo ARN marcado, carril 2: 3'-Cy5 solo ARN marcado y carril 3: ARN marcado de doble extremo (5'-sCy3 y 3'-Cy5). (B) La espectroscopia de fluorescencia de conjunto confirma el doble marcaje. La transferencia de energía tras la excitación del donante (λex = 515 nm, λem = 670 nm) verifica que ambos colorantes se acoplan con éxito al ARN. La curva gris representa el perfil de emisión del ARN precatalítico, mientras que la curva negra demuestra una mayor eficiencia de FRET en el ARN intrón del grupo II plegado (incubado con 500 mM de KCl a 70 °C durante 3 min, enfriado a 42 °C durante 5 min, seguido de la adición de 100 mM de MgCl2). Esta figura fue adaptada de Ahunbay et al.3 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67391/67391fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Con el intrón del grupo II de tipo salvaje de doble marca fluorescente en la mano, ahora estamos posicionados para explorar su dinámica a nivel de una sola molécula. Una vez encapsulado en vesículas de fosfolípidos, el ARN marcado se inmoviliza en una superficie de microscopía a densidades superficiales muy bajas para lograr una resolución de una sola molécula para smFRET-TIRF. Como se ve en la Figura 5A, se pueden rastrear varias moléculas individuales simultáneamente. La microscopía TIRF permite el monitoreo en tiempo real de la eficiencia de FRET y sus cambios a lo largo del tiempo. La Figura 5B ejemplifica las trazas FRET estáticas y dinámicas de una sola molécula del ARN marcado y encapsulado. Un rastro dinámico típico exhibe anticorrelación entre las señales del donante y del aceptor que fluctúan la eficiencia de FRET. Cuando la emisión del aceptor al excitar el donante aumenta, la emisión del donante disminuye correspondientemente, lo que indica un cambio dinámico en la distancia entre colorantes. Esta anticorrelación sugiere cambios conformacionales en la molécula de ARN.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67391/67391fig05.jpg"> 
Figura 5: Comportamiento altamente dinámico del ARN del intrón del grupo II revelado por smFRET. El ARN del intrón del grupo II marcado con doble extremo se encapsula en una vesícula de fosfolípidos y se inmoviliza en la superficie para obtener imágenes con un microscopio TIRF basado en objetivos. (A) Imagen combinada de moléculas de ARN marcadas individuales que exhiben emisión donante (sCy3, verde) y emisión aceptora (Cy5, rojo) tras la excitación a 532 nm. (B) Las trayectorias típicas de smFRET de (izquierda) una molécula de ARN estática donde las intensidades del donante y del aceptor no fluctúan con el tiempo y (derecha) una molécula de ARN dinámica, donde las intensidades del donante y del aceptor se anticorrelacionan, con las eficiencias de FRET en amarillo. Las moléculas individuales se localizan y analizan utilizando MASH-FRET17. Se aplican correcciones de excitación directa, sangrado y factor de γ. Abreviaturas: smFRET = transferencia de energía de resonancia de Förster de molécula única. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67391/67391fig05large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Marcaje final fluorescente y encapsulación de ARN largos para microscopía FRET-TIRF de molécula única

Single-molecule F&#246;rster Resonance Energy Transfer (smFRET) excels in studying dynamic biomolecules by allowing precise observation of their ...

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

En este artículo se describe cómo obtener FRET rastros de moléculas individuales de ADN inmovilizado en una superficie utilizando un microscopio confocal de barrido automático.

Sistema Automatizado de Soltero mediciones de fluorescencia de la molécula de superficie inmovilizada Biomoléculas

Este estudio presenta un procedimiento experimental detallado para medir la dinámica de bucle de ADN de doble cadena utilizando una sola molécula de transferencia de energía de resonancia fluorescente (FRET). El protocolo también se describe cómo extraer la densidad de probabilidad de bucle llamado factor J.

El estudio de ADN Looping por FRET sola molécula

Los estudios de biomoléculas in vivo son cruciales para comprender la función molecular en un contexto biológico. Aquí describimos un método novedoso que permite la internalización de biomoléculas fluorescentes, como el ADN o las proteínas, en microorganismos vivos. También se presenta y discute el análisis de datos in vivo registrados por microscopía de fluorescencia.

Internalización y Observación de fluorescente Biomoléculas en microorganismos que viven a través de electroporación

Este manuscrito describe un método para etiquetar las transcripciones de los ARN mensajero (ARNm) con sonda de ADN marcada con fluorescencia, para el uso en experimentos de fluorescencia de una sola molécula en situ hibridación (smFISH) en e. coli. smFISH es un método de visualización que permite la detección simultánea, localización y cuantificación de moléculas individuales de ARNm en células individuales fijas.

Método para el etiquetado de las transcripciones en los Escherichia coli las células para una sola molécula de la fluorescencia In Situ hibridación experimentos

Aquí, presentamos un protocolo para la localización de varios color de proteínas de membrana único en organelos de células vivas. Para colocar fluoróforos, se usan proteínas auto etiquetadas. Proteínas, situadas en compartimientos diferentes membranas de la mismo orgánulo, se pueden localizar con una precisión de ~ 18 nm.

Microscopía de localización de varios colores solo de proteínas de membrana en organelos de células mamíferas vivas

Aquí presentamos una guía práctica de la construcción de un sistema de microscopía integrado, que combina la proyección de imagen de epi-fluorescente convencional, proyección de imagen de una sola molécula basada en la detección de súper resolución y detección de una sola molécula de varios color, incluyendo transferencia de energía de resonancia de la fluorescencia de una sola molécula la proyección de imagen, en una puesta en marcha de una manera costo-eficiente.

Realización de múltiples modos de la proyección de imagen con un microscopio de fluorescencia

La transferencia de energía de fluorescencia de molécula única es un método que rastrea la dinámica del ARNt durante la síntesis de proteínas ribosómicas. Al rastrear ribosomas individuales, se identifican poblaciones no homogéneas, lo que arroja luz sobre los mecanismos. Este método se puede utilizar para rastrear cambios biológicos conformacionales en general para revelar relaciones de función dinámica en muchos otros biosistemas complejados. Los métodos de molécula única pueden observar...

Estudio de transferencia de energía de fluorescencia de molécula única de síntesis de proteínas ribosómicas

Este estudio presenta un procedimiento detallado para realizar experimentos de transferencia de energía de resonancia de fluorescencia de molécula única (smFRET) en receptores acoplados a proteínas G (GPCR) utilizando el etiquetado específico del sitio a través de la incorporación de aminoácidos no naturales (UAA). El protocolo proporciona una guía paso a paso para la preparación de muestras smFRET, experimentos y análisis de datos.

Visualización de la dinámica conformacional de los receptores de membrana utilizando FRET de molécula única

Las funciones de las proteínas de la superfamilia de la dinamina dependen de los cambios conformacionales junto con la hidrólisis de GTP. Se describe un sistema utilizando la técnica FRET de molécula única (smFRET) para monitorizar la dinámica conformacional de la atlastina GTPasa similar a la dinamina en diferentes estados de carga de nucleótidos.

Imágenes FRET de una sola molécula para observar la dinámica conformacional de la atlastina GTPasa similar a la dinamina

El objetivo de este protocolo es permitir la medición cuantitativa de la vida útil de fluorescencia de sondas Riboglow para flujos de trabajo de imagen de ARN reproducible in vitro, en células vivas de mamíferos y en modelos celulares tridimensionales. Detallamos los flujos de trabajo de preparación de la muestra, entrega de la sonda, adquisición de datos y análisis cuantitativo para extraer mediciones de vida útil de fluorescencia sesgadas.

Caracterización de las sondas de Riboglow in vitro como base para la imagen de vida por fluorescencia en células vivas de mamíferos y modelos celulares tridimensionales

Aprende a realizar marcaje dual de ARN largos y encapsulación en vesículas de fosfolípidos para microscopía TIRF de molécula única. Este protocolo permite visualizar la dinámica del plegamiento del ARN en tiempo real.

Marcaje final fluorescente y encapsulación de ARN largos para microscopía FRET-TIRF de molécula única

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