Tinción viva/muerta para cuantificar células viables pero no cultivables en bacterias causantes de heridas tratadas con miel de Manuka

Este proyecto de investigación tiene como objetivo investigar el impacto de la miel de Manuka en la fisiología bacteriana. Estudios recientes han proporcionado más información sobre los efectos antimicrobianos de la miel de Manuka en la fisiología bacteriana. Nuestros hallazgos preliminares indican que las bacterias de la miel de Manuka entran en un estado de latencia resistente a los antibióticos, viable pero no cultivable, pero en menor medida que las tratadas con antibióticos convencionales.

Sobre la base de nuestros experimentos, sería interesante comparar los perfiles de expresión de la miel de Manuka y los VBNC convencionales inducidos por antibióticos. Para empezar, tome los viales que contienen cepas bacterianas congeladas. Abra cada uno secuencialmente y use un palito estéril para raspar una pequeña cantidad de bacterias congeladas en la placa de agar Luria-Bertani o LB debidamente etiquetada.

Vuelva a colocar la tapa del vial y colóquelo rápidamente en el congelador. Incubar los cultivos bacterianos durante 18 a 24 horas a 37 grados centígrados. Al día siguiente, utilice una pipeta serológica para transferir dos mililitros de caldo LB a dos tubos de ensayo estériles.

Esterilice el asa de inoculación en la llama del mechero Bunsen. A continuación, transfiera un cuarto de bucle de bacterias de la placa de agar LB al tubo de ensayo debidamente etiquetado que contiene caldo LB. Incubar el tubo de ensayo en condiciones aeróbicas en una incubadora agitadora a aproximadamente 250 RPM a 37 grados Celsius durante 18 a 24 horas.

Para la configuración de la miel de Manuka y los tratamientos antibióticos de bacterias, agregue 10 microlitros de cultivo bacteriano a 10 mililitros de caldo Mueller Hinton para obtener la dilución 1:1, 000 del cultivo bacteriano, que tiene aproximadamente de 10 a la sexta unidad formadora de colonias por mililitro. Utilice los cultivos diluidos para preparar tres muestras para cada especie bacteriana, un control sin tratar, una muestra tratada con miel de Manuka y una muestra tratada con antibióticos. Agregue la miel de Manuka y el antibiótico a los tubos apropiados.

Transfiera 0,1 mililitros y 0,5 mililitros de la muestra no tratada a tubos de microcentrífuga estériles para obtener el recuento de placas viables y la tinción viva/muerta para las muestras T es igual a cero. A continuación, incubar las muestras de control no tratadas, tratadas con miel de Manuka y tratadas con antibióticos en condiciones aeróbicas a 37 grados centígrados en una incubadora agitadora a 250 RPM durante 24 horas. Prepare una dilución en serie diez veces mayor de la muestra T igual a cero sin tratar en caldo LB para obtener un número contable de células para el recuento de placas viables.

Extienda 50 microlitros de cada muestra diluida en la mitad de una placa de agar LB. Incubar las placas de agar en condiciones aeróbicas a 37 grados centígrados durante 24 horas. Al día siguiente, retire las placas de agar LB de la incubadora.

Identifique la placa de dilución que contiene aproximadamente de 25 a 150 colonias y cuente el número exacto de colonias. Utilice la fórmula de la unidad formadora de colonias para determinar el número de células cultivables por mililitro. En el tercer día, agregue 0,5 mililitros de cloruro de sodio al 0,85% a 0,5 mililitros de T igual a cero muestra de control de tinción viva/muerta sin tratar.

Combine 1,5 microlitros de SYTO 9 y 1,5 microlitros de yoduro de propidio por muestra. A continuación, añada tres microlitros de la mezcla a cada muestra. Incubar las muestras a 21 grados centígrados en la oscuridad durante 15 minutos.

Transfiera seis microlitros de la muestra teñida y mezclada suavemente a un hemocitómetro desechable y observe bajo un microscopio fluorescente utilizando un filtro de isotiocianato de fluoresceína o FITC y una lente de objetivo 40X. Capture una imagen que muestre las líneas de la cuadrícula del hemocitómetro y las celdas verdes. Cuente las celdas verdes en seis campos por muestra, anotando las dimensiones de la cuadrícula para calcular el número de celdas verdes por volumen.

Por último, calcule el número de células viables pero no cultivables restando el número de células cultivables por mililitro obtenido mediante el recuento de placas viables del número de células viables por mililitro obtenido mediante tinción viva/muerta. Al cuarto día, después de eliminar los cultivos bacterianos no tratados, tratados con miel de Manuka y tratados con antibióticos de la incubadora, recoja 0,1 mililitros y 0,5 mililitros de cada muestra en tubos de microcentrífuga para el recuento de placas viables y la tinción de vivos / muertos. Esta figura muestra el número de células cultivables y viables determinado utilizando el recuento de placas viables y la tinción viva/muerta para los cultivos de S. aureus y P. aeruginosa.

Los resultados muestran que el número de células viables y cultivables detectadas en los cultivos no tratados y tratados con miel de Manuka no fue significativamente diferente. Los cultivos de S. aureus tratados con tobramicina tenían menos células cultivables que células viables, pero esta diferencia no fue significativa. Solo P. aeruginosa tratada con meropenem mostró una reducción estadísticamente significativa en las células cultivables en comparación con las células viables.