Registro de las corrientes de K⁺ rectificadoras hacia adentro en células musculares lisas de la arteria basilar recién aisladas mediante la técnica de patch clamp

Mi investigación se centra principalmente en la electrofisiología cardio cerebrovascular. Este estudio describe un método para aislar las células musculares vasculares primarias y utilizar la tecnología de pinza de pellizco de célula completa para ayudar a sus propiedades electrofisiológicas. El aislamiento de células frescas tiene limitaciones, como el impacto de la temperatura en la separación de enzimas, los diferentes tiempos de digestión para diferentes vasos sanguíneos y la capacidad instantánea en el entorno nativo de las células.

Además, la tecnología de abrazadera de pellizco presenta desafíos en la ruptura del techo y la membrana que requiere una operación calificada. La investigación de las instalaciones de este protocolo consiste en la adquisición rápida de células primarias activas de las arterias manuales y debe sonar rápidamente la aplicación de la técnica de pinza de pellizco. Para comenzar, llene una placa de Petri con solución salina fisiológica fría saturada con un 95% de oxígeno y un 5% de dióxido de carbono.

Coloca un cerebro de rata aislado en la placa de Petri. Coloque el cerebro ventralmente hacia arriba en la placa de Petri y asegúrelo con agujas. Bajo un microscopio óptico, localice la arteria basilar.

Con autoclave, pinzas y tijeras, retire con cuidado el pañuelo circundante. A continuación, inserte un alambre de dos centímetros de largo con un diámetro de 25 micrómetros en la arteria basilar aislada. Frote suavemente la pared interna de la arteria con el alambre para extirpar eficazmente el endotelio vascular.

Para aislar las células del músculo liso, primero, precaliente las soluciones en tubos de ensayo de uno a tres. Transfiera la arteria basilar aislada al tubo de ensayo dos. Incubar la mezcla a 37 grados centígrados durante 30 minutos mientras se inyecta continuamente una mezcla de 95% de oxígeno y 5% de dióxido de carbono en el tubo.

A continuación, transfiera la arteria basilar del tubo de ensayo dos al tubo de ensayo tres e incube. Transfiera un mililitro de solución de separación de células precalentada del tubo de ensayo uno al tubo de ensayo tres. Continúe inyectando 95% de oxígeno y 5% de dióxido de carbono mientras mantiene el tratamiento enzimático durante tres minutos.

Triturar la preparación de la arteria basilar para liberar las células. A continuación, pipetee cuatro mililitros de solución de separación en frío en el tubo de ensayo tres para finalizar el proceso enzimático. Centrifugar la mezcla a 59 g durante seis minutos.

Con una pipeta, deseche el sobrenadante. A continuación, vuelva a añadir la solución de separación en frío. Después del último lavado, retire el sobrenadante.

Deja un mililitro de la célula en suspensión. Guarde la suspensión celular a cuatro grados centígrados durante seis a ocho horas. Transfiera 100 microlitros de la suspensión celular a un baño.

Añade un mililitro de líquido extracelular al baño y déjalo reposar. Para empezar, encienda un polar de micropipeta. Coloque un tubo de vidrio en el polar.

En el panel de control, seleccione el programa uno. Haga clic en entrar y acceda al programa uno. Ahora realice una prueba de rampa haciendo clic en rampa en el panel de control para medir el valor calorífico del tubo de vidrio.

Inserte un nuevo tubo de vidrio. A continuación, seleccione el programa uno y haga clic en Intro para fabricar la micropipeta. Para registrar la atención actual, primero inicie el software de adquisición de datos.

Seleccione archivo, luego haga clic en establecer nombres de archivos de datos para establecer una ruta de almacenamiento de datos. Habilite la función de prueba de membrana en el menú de herramientas. Coloque una muestra de células de músculo liso aisladas de la arteria basilar de una rata en el centro de la vista de la cámara del microscopio.

Sumerja la punta del alambre de referencia en la solución del baño. A continuación, llene el 20% de la micropipeta fabricada con la solución intracelular. Fije la micropipeta cargada en el soporte del electrodo de registro.

Ahora, con una jeringa, aplique presión positiva. Mueva la punta de la pipeta a la solución de baño y ajuste el desplazamiento de la pipeta en el software del amplificador de señal para establecer la línea de base actual en cero picoamperios. Presione suavemente la pipeta contra la membrana celular.

Observe un aumento en la resistencia del sello a al menos un magomo. Elimine la presión positiva y aplique presión negativa. Para establecer una alta resistencia, con una resistencia de sellado de al menos un giggome, ajuste el voltaje de retención a menos 60 milivoltios y compense la capacitancia del electrodo usando CP FAST y CP slow.

Aplique una breve presión negativa para romper la membrana celular, formando una configuración celular completa. Seleccione la celda completa en el software del amplificador de señal. A continuación, haga clic en automático para la compensación de la capacitancia de la membrana.

Cargue el protocolo kir y comience el registro de datos. Se aislaron células de músculo liso recién aisladas con morfología fusiforme. Las células estaban sanas y eran adecuadas para los experimentos de pinza de parche.

Una corriente de curado típica exhibió una rectificación hacia adentro a voltajes negativos con un flujo de corriente de iones de potasio mínimo o nulo a voltajes positivos. El cloruro de bario en concentraciones de 100 a 300 micromoles por litro inhibió eficazmente la actividad del canal kir, confirmando la corriente como kir. El nitroprusiato de sodio aumentó la corriente de kir, lo que indica el papel de los canales de kir en la vasodilatación inducida por SNP.

La comparación de las relaciones de corriente y voltaje demostró una disminución en la densidad de corriente en presencia de cloruro de bario y un aumento con SNP.