Name: Avances en células asesinas naturales que expresan receptores de antígenos quiméricos derivados de células madre pluripotentes humanas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-02-14T14:10:00.000+00:00
Duration: 11 min 8 s
Description: Aprende a generar células CAR-NK a partir de iPSCs humanas mediante integración génica no viral y CRISPR-Cas9. Este protocolo mejora la actividad antitumoral y la persistencia in vivo para terapias contra cáncer.

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<table><tbody><tr><td>aAPC&nbsp;</td><td>Laboratorio del decano A. Lee&nbsp;</td><td>N/A a-MEM</td><td></td></tr><tr><td>medio de cultivo&nbsp;</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>Cat#12634</td><td></td></tr><tr><td>APC anti-DYKDDDDK (Etiqueta FLAG)</td><td>BD Biosciences&nbsp;</td><td>Cat#637308</td><td></td></tr><tr><td>APC-anti-humano TRA-1-81&nbsp;</td><td>ThermoFisher</td><td>17-8883-42&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>APC-CD16</td><td>BD Biociencias&nbsp;</td><td>Cat#302015</td><td></td></tr><tr><td>APC-CD43&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>Cat# 560198&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>APC-CD45&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>Cat# 555485&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>APC-GPC3</td><td>BD Biociencias&nbsp;</td><td>Cat#DB100B</td><td></td></tr><tr><td>APC-NKG2D&nbsp;</td><td>BD Biociencias&nbsp;</td><td>Gato# 558071&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>CellEvent Caspasa-3/7 Reactivo de detección verde&nbsp;</td><td>Termo pescador&nbsp;</td><td>Cat#C10423</td><td></td></tr><tr><td>CellTrace Kit de Proliferación de Células Violetas&nbsp;</td><td>Termo pescador&nbsp;</td><td>Cat#C34571</td><td>Tinte fluorescente de rastreo celular &nbsp;</td></tr><tr><td>Solución CryoStor &nbsp;</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>https://www.stemcell.com/products/cryostor-cs10.html</td><td>Medio de criopreservación</td></tr><tr><td>CTS NK Xpander</td><td>Gibco</td><td>A5019001</td><td></td></tr><tr><td>CTS NK-Xpander Medium</td><td>Life Technologies</td><td>Cat#A5019001</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco 11965084</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM, alto contenido de glucosa, suplemento GlutaMAX, piruvato</td><td>Gibco</td><td>10569010</td><td></td></tr><tr><td>Kit de enriquecimiento de células NK humanas EasySep &nbsp;</td><td>Tecnologías de células madre, Inc.&nbsp;</td><td>Cat#19055</td><td></td></tr><tr><td>Etanolamina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E9508</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino&nbsp;</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>Cat# 10437010</td><td></td></tr><tr><td>FITC-CD94&nbsp;</td><td>BD Biociencias&nbsp;</td><td>Cat#555888</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX Suplemento</td><td>Gibco 35050061</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GolgiPlug&nbsp;</td><td>BD Biociencias&nbsp;</td><td>Cat#555029</td><td></td></tr><tr><td>GolgiStop&nbsp;</td><td>BD Biociencias&nbsp;</td><td>Cat#554724</td><td></td></tr><tr><td>Ham's F-12 Nutrient Mix, GlutaMAX Supplement</td><td>Gibco</td><td>31765035</td><td></td></tr><tr><td>Horse serum&nbsp;</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>Cat#16050130</td><td></td></tr><tr><td>Suero Humano&nbsp;</td><td>AB Sigma-Aldrich</td><td>Cat#BP2525100</td><td></td></tr><tr><td>Kit de Nucleofector de Células Madre Humanas&nbsp;</td><td>Lonza&nbsp;</td><td>Gato# VPH-5012</td><td></td></tr><tr><td>Humano: Células HePG2&nbsp;</td><td>ATCC&nbsp;</td><td>Gato#HB-8065</td><td></td></tr><tr><td>Humano: Células HePG2-td-tomate-luc&nbsp;</td><td>Dan S. Kaufman lab</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Humano: células iPS&nbsp;</td><td>Dan S. Kaufman lab&nbsp;</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Humano: Células SNU-449&nbsp;</td><td>ATCC</td><td>Cat#CRL-2234</td><td></td></tr><tr><td>Humano: SNU-449-td-tomato-luc cells&nbsp;</td><td>Dan S. Kaufman lab</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>IncuCyte Caspasa-3/7 Ensayo de apoptosis verde&nbsp;</td><td>Essenbioscience&nbsp;</td><td>Cat#4440</td><td></td></tr><tr><td>Ácido L-ascórbico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A5960</td><td></td></tr><tr><td>MP Biomedicals&nbsp; Suero humano, tipo AB</td><td>MP Biomedicals</td><td>ICN2938249</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR plus</td><td>StemCell Technologies, Inc.&nbsp;</td><td>100-0276</td><td></td></tr><tr><td>Software NovoExpress&nbsp;</td><td>ACEA Biociencias&nbsp;</td><td></td><td></td>https://www.agilent.com/en/product/research-flow-cytometry/flow-cytometry-software/novocyte-novoexpress-software-1320805</tr><tr><td>PE/Cy7 anticuerpo SSEA-4 humano&nbsp;</td><td>Biolegend</td><td>330420</td><td></td></tr><tr><td>PE-CD16&nbsp;</td><td>BD Biociencias&nbsp;</td><td>Gato#560995&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>PE-CD226</td><td>BD Biociencias&nbsp;</td><td>Cat#559789</td><td></td></tr><tr><td>PE-CD34&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>Cat# 555822&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>PE-CD45&nbsp;</td><td>BD Biociencias&nbsp;</td><td>Gato# 555483&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>PE-CD94&nbsp;</td><td>BD Biociencias&nbsp;</td><td>Gato#555888&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>PE-cy7-CD56&nbsp;</td><td>BioLegend</td><td>Gato# 318318&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Ligando PE-FAS&nbsp;</td><td>BD Biociencias&nbsp;</td><td>Gato#564261&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>PE-NKp30</td><td>BD Biosciences</td><td>Cat# 558407</td><td></td></tr><tr><td>PE-NKp44&nbsp;</td><td>BD Biociencias&nbsp;</td><td>Gato#558563&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>PE-NKp46</td><td>BD Biociencias&nbsp;</td><td>Cat#331908</td><td></td></tr><tr><td>PE-NKp46&nbsp;</td><td>BD Biociencias&nbsp;</td><td>Gato#557991&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Pelaje leucocitario de sangre periférica&nbsp;</td><td>Banco de Sangre de San Diego (https://www. sandiegobloodbank.org/)&nbsp;</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>PE-TRAIL&nbsp;</td><td>BD Biociencias&nbsp;</td><td>Gato#565499&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>pKT2-mCAG-IRES-GFP-ZEO&nbsp;</td><td>Branden Moriarity lab&nbsp;</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>PMAX-GFP plásmido</td><td>Lonza N</td><td>/A</td><td>GFP control positivo&nbsp;</td></tr><tr><td>Prisma 9</td><td>Graphpad&nbsp;</td><td>Versión 9</td><td></td></tr><tr><td>pSpCas9&nbsp;</td><td>GenScript</td><td>PX165</td><td></td></tr><tr><td>RBC Lysis Buffer (10x)</td><td>Biolegend</td><td>Cat#420301</td><td></td></tr><tr><td>bFGF humano recombinante básico&nbsp;</td><td>R& D Sistemas&nbsp;</td><td>Cat#4114-TC</td><td></td></tr><tr><td>BMP-4 humano recombinante&nbsp;</td><td>PeproTech</td><td>Cat#120-05</td><td></td></tr><tr><td>Ligando FLT-3 humano recombinante&nbsp;</td><td>PeproTech</td><td>Cat# 300-19 IL-15</td><td></td></tr><tr><td>humano recombinante&nbsp;</td><td>PeproTech</td><td>Cat# 200-15</td><td></td></tr><tr><td>IL-2 humano recombinante&nbsp;</td><td>PeproTech</td><td>Cat# 200-02</td><td></td></tr><tr><td>IL-3 humano recombinante&nbsp;</td><td>PeproTech</td><td>Cat#200-03</td><td></td></tr><tr><td>IL-7 humano recombinante&nbsp;</td><td>PeproTech</td><td>Cat# 200-07</td><td></td></tr><tr><td>Proteína nodal humana recombinante</td><td>R& D Sistemas&nbsp;</td><td>Cat#3218-ND-025</td><td></td></tr><tr><td>SCF humano recombinante;</td><td>PeproTech</td><td>Cat# 300-07</td><td></td></tr><tr><td>TGF-&beta humano recombinante; 1</td><td>PeproTech</td><td>Cat#100-21</td><td></td></tr><tr><td>VEGF humano recombinante;</td><td>PeproTech</td><td>Cat# 100-20</td><td></td></tr><tr><td>RPMI1640</td><td>Gibco</td><td>11875093</td><td></td></tr><tr><td>Selenito de sodio</td><td>Sigma Aldrich 214485</td><td></td><td></td></tr><tr><td>STEMdiff APEL 2 Medio</td><td>StemCell Technologies, Inc.&nbsp;</td><td>5270</td><td>EB medio de formación</td></tr><tr><td>STEMdiff APEL2 Medium&nbsp;</td><td>Tecnologías de células madre, Inc.&nbsp;</td><td>Cat#05270</td><td></td></tr><tr><td>Super piggyBac Vector de expresión de transposasa</td><td>SBI</td><td>Cat#PB210PA-1</td><td></td></tr><tr><td>SYTOX AADvanced Dead Cell Stain Kit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>S10274, S10349</td><td>Kit de solución de tinción de células</td></tr> <tr><td>muertas&beta;-mercaptoetanol</td><td>Gibco</td><td>21985023</td><td></td></tr></tbody></table>

avances en células asesinas naturales que expresan receptores de antígenos quiméricos derivados de células madre pluripotentes humanas

Advances in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Chimeric Antigen Receptor-Expressing Natural Killer Cells

Diagrama esquemático de la diferenciación y expansión de las células NK derivadas de iPSC anti-GPC3-CAR El diagrama esquemático ilustra la diferenciación in vitro de células NK modificadas anti-GPC3-CAR derivadas de células madre pluripotentes inducidas humanas (iPSC) y una representación esquemática del vector piggyBac portador de la construcción GPC3 CAR. Inicialmente, las iPSCs no modificadas se transfectan con un vector piggyBac que codifica el GPC3 CAR (receptor de antígeno quimérico). D...

Avances en células asesinas naturales que expresan receptores de antígenos quiméricos derivados de células madre pluripotentes humanas

Natural killer (NK) cells are innate immune cells that play a crucial role in the body's defense against tumors and viral infections. The generation of ...

advances-human-induced-pluripotent-stem-cell-derived-chimeric-antigen

Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Aquí se describe un método para activar y expandir las células NKT de granel poblaciones de células T usando células artificiales presentadoras de antígenos (AAPC). El uso de CD1d basado AAPC proporciona un método estandarizado para la generación de un número elevado de células NKT funcionales.

Antígeno Artificial célula presentadora (AAPC) La activación mediada y expansión de linfocitos T citolíticos naturales

Este video muestra una técnica para la generación ex vivo de células T con receptor de antígeno quimérico (CAR) específico de antígeno tumoral. Los vectores retrovirales portadores de ARN transgénico se mezclan con células de bazo en un medio suplementado con interleucina-2 para promover la supervivencia y proliferación de las células T. A continuación, la mezcla se transfiere a una placa recubierta con fragmentos de fibronectina humana recombinante y se centrifuga para facilitar la fusión del...

Una técnica ex vivo para generar células T receptoras de antígenos quiméricos específicos de tumores

Un método sencillo y fiable se describe aquí para analizar un conjunto de funciones de las células NK, tales como la desgranulación, de citoquinas y la producción de quimioquinas dentro de los diferentes subconjuntos de células NK.

Ensayo de citometría de flujo de base para la supervisión de funciones de las células NK

Describimos un sistema de ensayo cuantitativo de citolisis in vitro en tiempo real para evaluar la potencia de las células T del receptor de antígeno quimérico dirigidas a células tumorales líquidas y sólidas. Este protocolo se puede ampliar para evaluar otras células efector inmune, así como tratamientos combinados.

Un ensayo de potencia en tiempo real para células T receptores de antígeno quimérico dirigido a células cancerosas sólidas y hematológicas

Aquí, describimos un método de cultivo in vitro de co para recurrentemente desafío orientada a tumor las células T, que permite el análisis fenotípico y funcional de la actividad de las células T antitumorales.

En Vitro Tumor celular Rechallenge de evaluación predictiva de antígeno quimérico del Receptor de la célula T función antitumoral

Aquí, presentamos un protocolo para la edición de genes en células T humanas primarias utilizando la tecnología CRISPR Cas para modificar las células CAR-T.

Producción de células CAR-T humanas diseñadas por CRISPR

Aquí, presentamos un método para expandir el asesino natural de sangre periférica (PBNK), las células NK de los tejidos hepáticos y las células NK del receptor de antígeno quimérico (CAR) derivadas de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) o sangre del cordón umbilical (CB). Este protocolo demuestra la expansión de las células NK y CAR-NK utilizando células alimentadoras 221-mIL-21, además de la pureza optimizada de las células NK expandidas.

Método de expansión celular Natural Killer (NK) y CAR-NK utilizando línea de células B modificada con IL-21 unida a la membrana

El presente protocolo muestra cómo diferenciar las células CD3−/CD45+CD56+ con citotoxicidad leve de las células madre humanas de potencial expandido (hEPSC) en condiciones de cultivo 3D y 2D. Esto permite la validación fenotípica rutinaria sin la destrucción del microambiente complejo.

Generación de células asesinas naturales a partir de células madre humanas de potencial expandido

Este protocolo proporciona un flujo de trabajo optimizado para generar y probar células T reguladoras del receptor de antígeno quimérico humano (CAR Tregs).

Generación de linfocitos T reguladores del receptor de antígeno quimérico humano

Describimos un protocolo de transfección para producir células asesinas naturales con receptor de antígeno quimérico (CAR-NK) dirigidas a patógenos fúngicos utilizando el sistema de transposones no viral de la Bella Durmiente. Para evaluar la activación específica del antígeno, cocultivamos las células modificadas con tubos germinativos de Aspergillus fumigatus y medimos la secreción de IFN-γ.

Ingeniería de células asesinas naturales con receptor de antígeno quimérico dirigidas a infecciones fúngicas utilizando el sistema de transposones no viral de la Bella Durmiente

Este protocolo proporciona un flujo de trabajo estandarizado in vitro. para la medición consistente de la citotoxicidad natural, mediada por receptores de antígenos quiméricos y dependiente de anticuerpos en células humanas natural killer mediante imagen de células vivas y citometría de flujo.

Cuantificación de la citotoxicidad de células NK potenciada por receptores de antígenos quiméricos y anticuerpos terapéuticos mediante imagen de células vivas y citometría de flujo

Aprende a generar células CAR-NK a partir de iPSCs humanas mediante integración génica no viral y CRISPR-Cas9. Este protocolo mejora la actividad antitumoral y la persistencia in vivo para terapias contra cáncer.

Avances en células asesinas naturales que expresan receptores de antígenos quiméricos derivados de células madre pluripotentes humanas (Video) | JoVE Journal

Avances en células asesinas naturales que expresan receptores de antígenos quiméricos derivados de células madre pluripotentes humanas

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