Name: Modelo de biopelícula agregada de fibrosis quística para estudiar la expresión génica relevante para la infección (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-04-18T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 58 s
Description: Aprende a desarrollar un modelo de biopelícula agregada para estudiar infecciones pulmonares en fibrosis quística. Este método permite analizar la expresión génica y evaluar la eficacia antimicrobiana en un entorno realista.

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HL, DN y JF recibieron apoyo de subvención para el Centro de Investigación Estratégica (SRC) Un marco preclínico basado en la evidencia para el desarrollo de terapias antimicrobianas en la fibrosis quística (PIPE-CF; Proyecto No. SRC 022) del UK Cystic Fibrosis Trust y la US Cystic Fibrosis Foundation. TH cuenta con el apoyo de una beca de doctorado de la Asociación de Formación Doctoral de MRC Discovery Medicine North. Agradecemos al CF Trust y CF Foundation (SRC022) y al esquema MRC DiMEN DTP por su financiación

1. Preparación de biopelículas de una sola especie
<ol>
	<li>Reviva P. aeruginosa PAO1 a partir de cultivos de perlas congeladas rayando una sola perla en agar caldo de lisogenia (LB) e incubando durante 24 h a 37 °C.</li>
	<li>Prepare cultivos nocturnos de PAO1 tomando una sola colonia de la placa de rayas y agregándola a un medio de 5 mL LB. Incubar durante la noche (18 h) y luego diluir a DE600 de 0,05 (equivalente a 1 x 108 UFC/mL), y diluir aún más 1:100 en SCFM2 preparado según Palmer, et al.16.</li>
	<li>Agregue 180 μL del inóculo a los pocillos de una placa de microtitulación de 96 pocillos de fondo redondo. Preparar biopelículas por triplicado biológico para su enumeración por unidades formadoras de colonias (UFC). Se realizan un total de 3 réplicas por réplica biológica solo para qPCR. A 3 pocillos separados, agregue 180 μL de SCFM2 estéril que se utilizará para los controles de medios. 
	NOTA: Se seleccionaron placas de fondo redondo en lugar de las placas tradicionales de fondo plano debido a su superioridad al permitir la exposición homogénea de toda la biopelícula al medio de crecimiento circundante17.</li>
	<li>Deje que se formen las biopelículas durante 24 h, incubando a 37 °C y agitando a 75 rpm.</li>
</ol>
2. Preparación de biofilms multiespecie
<ol>
	<li>Reviva P. aeruginosa PAO1 y S. aureus SH1000 a partir de cultivos de perlas congeladas como se describe anteriormente. Reviva C. albicans CAF2.1 a partir de cultivos de perlas congeladas mediante la colocación de una sola perla en agar dextrosa Saboraud e incubación durante 24 h a 37 °C.</li>
	<li>Prepare cultivos nocturnos de SH1000 y CAF2.1 tomando una sola colonia de la placa de rayas y agregando 5 mL de LB (cultivos nocturnos separados para cada organismo). Incubar durante la noche durante 18 h. Estandarizar los cultivos nocturnos de S. aureus SH1000 y C. albicans CAF2.1 en valores de LB a OD600 de 0.1, lo que equivale a 1 x 109 y 1.2 x 107 UFC/mL, respectivamente17,18.</li>
	<li>Diluir los S. aureus y C. albicans para formar un solo inóculo que contenga ambas especies a concentraciones de 1 x 106 y 1 x 105 UFC/mL, respectivamente, en SCFM2.</li>
	<li>Agregue 162 μL del inóculo a los pocillos de una placa de microtitulación de 96 pocillos. Inocular biopelículas en triplicado biológico para su enumeración por unidades formadoras de colonias (UFC). Se realizan un total de 3 réplicas por réplica biológica solo para qPCR. A 3 pocillos separados, agregue 180 μL de SCFM2 estéril que se utilizará para los controles de medios.</li>
	<li>Deje que se formen las biopelículas durante 24 h, incubando a 37 °C y agitando a 75 rpm.</li>
	<li>Prepare un cultivo nocturno de PAO1 tomando una sola colonia de la placa de rayas y agregándola a 5 mL de medio LB. Incubar durante la noche (18 h), luego agregar a DO600 de 0.05 (equivalente a 1 x 108 UFC/mL), y diluir aún más a 1 x 105 UFC/mL en SCFM2.</li>
	<li>Agregue 14,2 μL del inóculo de PAO1 a los pocillos de la placa de microtitulación de 96 pocillos, lo que da como resultado que el inóculo final de la PAO1 sea de 1 x 104 UFC/mL. 
	NOTA: Esta variación en la concentración del inoculado entre las diferentes especies es para asegurar que los S. aureus y C. albicans no sean superados por el P. aeruginosa y todos sean recuperables por siembra puntual del biofilm de 24 h donde no hay antibióticos presentes.</li>
	<li>Deje que las biopelículas polimicrobianas se formen durante 24 h, incubando a 37 °C y agitando a 75 rpm.</li>
</ol>
3. Tratamiento con DNasa y antibióticos de biopelículas de una y varias especies
<ol>
	<li>Añadir 2 μL de DNasa I directamente a los pocillos que contienen las biopelículas a una concentración final de 50 μg/mL, incubar durante 1 h a 37 °C y agitar a 75 rpm. 
	NOTA: Esto se agrega para diluir las biopelículas viscosas para permitir una mejor penetración de los antimicrobianos, lo que refleja la dosis de rhDNasa (ADNasa humana recombinante) que toman muchas personas con fibrosis quística como estrategia de tratamiento para las exacerbaciones pulmonares.</li>
	<li>Prepare una reserva de antibióticos de meropenem a 2,56 mg/mL, utilizando agua destilada como diluyente. Diluido en serie por un factor de 2 para lograr concentraciones de 0,01 mg/mL - 2,56 mg/mL.</li>
	<li>Agregue 20 μL de cada dilución de meropenem a las biopelículas para lograr un rango de dosis de 1 μg/mL - 256 μg/mL. Agregue 20 μL de agua destilada a las biopelículas de control negativo en lugar del antibiótico.</li>
	<li>Sellar la placa de microtitulación de 96 pocillos con film transparente e incubar a 37 °C durante 24 h, agitando a 75 rpm.</li>
</ol>
4. Enumeración de células viables y actividad metabólica
NOTA: Los siguientes pasos son solo para las biopelículas destinadas a la cuantificación de UFC.
<ol>
	<li>Añadir 10 μL de celulasa (100 mg/mL, tampón citrato 0,05 M) a los biofilms e incubar a 37 °C durante 1 h, agitando a 140 rpm. La celulasa se usa regularmente para alterar los esqueletos de celulosa dentro de las biopelículas19,20,21. Altere aún más las biopelículas pipeteando hacia arriba y hacia abajo si es necesario hasta que no haya grumos visibles.</li>
	<li>Añadir 10 μL de solución de resazurina al 0,02% para evaluar la actividad metabólica de los biofilms de ensayo y biofilms de control e incubar a 37 °C durante 1 h, agitando a 140 rpm.</li>
	<li>Mida la fluorescencia de cada pocillo utilizando una longitud de onda de excitación de 540 nm y una longitud de onda de emisión de 590 nm en el lector de microplacas.</li>
	<li>Corrija la fluorescencia de fondo restando los valores de fluorescencia de las muestras de medios en blanco y calcule el porcentaje de reducción como (media delas biopelículas tratadas con antibióticos F/media Fcontrol negativo) x 100 %.</li>
	<li>Enumere el contenido de los pocillos, que contienen tanto las biopelículas interrumpidas como las células planctónicas, diluyendo en serie y colocando placas puntuales en agar selectivo de la siguiente manera: 
	Agar selectivo Pseudomonas suplementado con glicerol al 1% y suplemento de CN para la enumeración de P. aeruginosa 
	Agar sal de manitol para la enumeración de S. aureus| 
	Agar peptona dextrosa de levadura suplementado con penicilina (250 U/mL), estreptomicina (250 μg/mL, sulfato de gentamicina (30 μg/mL) y vancomicina (3 μg/mL) para la enumeración de C. albicans. 
	NOTA: Se enumera todo el contenido de los pozos debido a los desafíos de separar la biopelícula agregada que flota libremente de las células planctónicas. Sin embargo, este enfoque refleja con mayor precisión las condiciones presentes en el pulmón de fibrosis quística. Puede haber condensación en la tapa después de la incubación. Para asegurarse de que no haya contaminación entre pocillos, coloque los controles estériles en agar selectivo.</li>
	<li>Después de la siembra puntual en el agar selectivo, incubar las placas durante 24 h a 37 °C antes de la enumeración.</li>
</ol>
5. Preparación de biofilms para la extracción de ARN
NOTA: Todos los pasos a partir de este punto son solo para biopelículas destinadas al análisis RT-qPCR.
<ol>
	<li>Retire la placa de microtitulación de 96 pocillos que contiene las biopelículas de la incubadora a 37 °C y transfiéralas a un tubo de microcentrífuga de 1 mL. Al transferir, asegúrese de que las réplicas de la biopelícula se agrupen para cada repetición biológica realizada. Esto asegura que haya suficiente biomasa para la extracción de ARN.</li>
	<li>Centrifugar los tubos de 1,5 ml que contienen las biopelículas a 16.000 x g durante 5 min. Si realiza la extracción de ARN el mismo día, continúe con el paso 6.2.1. Si la extracción de ARN no se realiza el mismo día, retire el sobrenadante y almacene el pellet en 250 μL de solución de estabilización de ARN a -20 °C. Esta solución se ha utilizado para almacenar gránulos bacterianos en varios estudios22,23.</li>
</ol>
6. Extracción de ARN
<ol>
	<li>Extraiga biopelículas de ARN bacteriano de una sola especie y de varias especies utilizando un kit comercial. Prepare los tampones como se indica en las pautas del fabricante.</li>
	<li>Retire el sobrenadante del medio de cultivo y deséchelo. Si el pellet se almacenó en una solución de estabilización, descongélelo a temperatura ambiente y centrifugue a 16.000 x g durante 5 min. Vuelva a suspender el gránulo en 600 μL de reactivo de extracción de ARN y, a continuación, rómpalo manualmente con una aguja de 0,2 mm acoplada a una jeringa de 2 ml (aspire 5x-10x o hasta que el gránulo esté completamente alterado).</li>
	<li>Realice los pasos de purificación de ARN como se indica en las pautas del fabricante.</li>
	<li>Cuantifique el ARN utilizando un espectroscopio UV, un kit de ensayo BR de ARN y tubos. Los límites detectables de ARN utilizando el kit de ensayo son de 10 a 1200 ng/μL, por lo tanto, el rendimiento mínimo aceptable de ARN para este protocolo es de 10 ng/μL.
	<ol>
		<li>Configure el número requerido de tubos para muestras y patrones (se requieren 2 estándares).</li>
		<li>Prepare la solución de trabajo añadiendo 199 μL de tampón y 1 μL de reactivo por número de muestras (+ 2 patrones y 2 para error).</li>
		<li>Agregue 190 μL de solución de trabajo y 10 μL de Estándar 1 y Estándar 2 en tubos separados.</li>
		<li>Agregue 199 μL de solución de trabajo y 1 μL de muestra de ARN en tubos separados. Agite el vórtice durante 30 s y luego guárdelo en un lugar oscuro durante 5 minutos.</li>
		<li>En el fluorómetro, seleccione ARN > ARN de amplio rango y siga las instrucciones.</li>
		<li>Evaluar la calidad del ARN utilizando un espectrofotómetro. Limpie el espectrofotómetro pipeteando 1 μL de agua libre de DNasa/RNasa en el espectrofotómetro. Limpie el agua con una toallita sin pelusa y ajuste la relación de absorbancia a 260/280 nM. Pipetear 1 μL de ARN en el espectrofotómetro. Si el ARN es puro, se observará un solo pico entre 260 y 280 nM, y se mostrará una relación de ~ 2.0.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Convierta el ARN extraído en ADN complementario (ADNc) utilizando un kit de síntesis de ADNc. Para cualquier muestra de ARN que exceda los 50 ng/μL, primero diluya a 50 ng/μL con agua libre de DNasa/RNasa.
	<ol>
		<li>Usando tubos, prepare la mezcla de reacción de ADNc de acuerdo con la Tabla 1.</li>
		<li>Coloque los tubos en un termociclador utilizando las siguientes condiciones: 25 °C durante 5 min, 42 °C durante 30 min, 85 °C durante 5 min. Utilice el ADNc inmediatamente o guárdelo congelado a -20 °C.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. qPCR
<ol>
	<li>Realice la qPCR utilizando una mezcla maestra de qPCR. Utilice los siguientes cebadores de algD y del gen de mantenimiento (16S) (Tabla 2). 
	NOTA: Los cebadores se diseñaron utilizando la herramienta en línea NCBI-primer Blast con referencia a la secuencia completa del genoma de P. aeruginosa, y luego se sintetizaron a través de un proveedor comercial. Los cebadores se validaron para determinar la especificidad de las biopelículas polimicrobianas mediante la coincidencia de secuencias utilizando la herramienta NCBI-primer Blast.</li>
	<li>Diluya los cebadores a 4 μM (4 pm/μL) diluyendo 20 μL de cebador en 480 μL de agua libre de DNasa/RNasa. Estos se pueden congelar para múltiples usos.</li>
	<li>Prepare la solución de trabajo de la mezcla maestra de qPCR de acuerdo con las instrucciones de la Tabla 3. 
	NOTA: La solución de trabajo de algD contiene suficiente solución para 3 repeticiones biológicas y 3 veces repeticiones técnicas por concentración de meropenem, 6 controles negativos y 2 veces errores. Las soluciones de trabajo 16S contienen suficiente solución para 2 veces los estándares de concentración de ARN conocida y 2 veces el error.</li>
	<li>Añadir 18 μL de solución de trabajo de algD a los tubos de reacción de qPCR adecuados. Esto incluirá un total de 36 tubos para el análisis de expresión de algD y 6 tubos para controles negativos.</li>
	<li>Añadir 2 μL de ARN a cada uno de los tubos de reacción de qPCR o 2 μL de agua sin DNasa/RNasa a los controles negativos.</li>
	<li>Añada 18 μL de solución de trabajo 16S a los tubos de reacción de qPCR adecuados. Esto incluirá un total de 2 tubos. Añadir 2 μL de ARN de concentración conocida a los tubos de reacción de qPCR.</li>
	<li>Realice la qPCR de acuerdo con las siguientes condiciones: 2 min a 95 °C, 15 s a 95 °C (40 ciclos), 1 min a 60 °C.</li>
	<li>Analice los resultados de qPCR utilizando el método 2-ΔΔCt, como se describió anteriormente24. Al analizar la expresión de algD, utilice la expresión de algD a 0 μg/mL como control para las respectivas composiciones de biopelícula y considere que la expresión de cambio de pliegue es relevante para los cultivos no tratados</li>
</ol>

Anti-Infective Efficacy in Cystic Fibrosis with Aggregate Biofilm Models

Los autores no tienen nada que revelar.

Estos resultados muestran que, a pesar de su uso frecuente en el manejo de exacerbaciones pulmonares en personas con FQ, el meropenem no influyó significativamente en el crecimiento de P. aeruginosa en el modelo de biopelícula de una o varias especies. Se observó un ligero aumento en la recuperación de P. aeruginosa en ambos modelos después del tratamiento con 128 μg/mL y 256 μg/mL de meropenem, como también se observó para S. aureus en la biopelícula multiespecie; sin embargo, estos aumentos fueron insignificantes. La disminución de C. albicans cuando se somete a meropenem puede deberse a condiciones hostiles para el hongo creadas por las bacterias en respuesta al estrés del antimicrobiano. No se observaron diferencias significativas en la expresión de algD entre las concentraciones de meropenem cuando P. aeruginosa se cultivó como una biopelícula de una sola especie. Sin embargo, la expresión de algD fue significativamente mayor en biopelículas de múltiples especies cuando se trataron con meropenem de 256 μg / ml, lo que sugiere que la producción de alginato puede aumentar en estas condiciones. Las diferencias en la expresión de algD observadas entre las composiciones de biopelículas y las concentraciones de meropenem muestran cómo la presencia de factores relevantes puede influir en la expresión génica relevante para la infección y destaca la importancia de considerar el uso de antimicrobianos y el estado de infección polimicrobiana al desarrollar y probar alternativas a los antibióticos.
A pesar de la utilidad de los modelos, hay varias consideraciones para garantizar una aplicación exitosa. El establecimiento de S. aureus y C. albicans dentro de las biopelículas es esencial antes de la infección por P. aeruginosa, debido a los riesgos de que S. aureus y C. albicans sean superados por los Gram negativos. En este modelo de biopelícula, C. albicans parece ser un mal compañero debido a sus tasas de supervivencia significativamente más bajas en comparación con S. aureus y P. aeruginosa, incluso en ausencia de antibióticos. Esto sugiere que la levadura es superada por los recursos o se ve afectada negativamente por las interacciones entre especies dentro de la biopelícula27,28. La ausencia de C. albicans en presencia de meropenem, a pesar de que el antibiótico no tiene actividad antifúngica directa, apoya la idea de que la respuesta al estrés de S. aureus al meropenem puede crear un ambiente inhóspito para C. albicans29,30. Sin embargo, es importante tener en cuenta que la elección de la cepa puede tener un efecto sobre la cantidad de C. albicans que se puede recuperar del modelo de biopelícula polimicrobiana. Se observan diferentes tendencias cuando se usa P. aeruginosa LESB58 en lugar de PAO1 (Figura complementaria 1). Con LESB58, C. albicans es recuperable a todas las concentraciones de meropenem y, de hecho, muestra un ligero aumento a medida que la concentración de P. aeruginosa disminuye como resultado del antimicrobiano, lo que permite que cambie la composición de la comunidad. Sin embargo, a pesar de estas diferencias, la PAO1 se utiliza en este modelo debido a que es una cepa de referencia de laboratorio, lo que proporciona una línea de base consistente y bien caracterizada para estudios comparativos. Esta consistencia es crucial para la reproducibilidad y para sacar conclusiones fiables sobre las interacciones dentro de la biopelícula.
Puede ser un desafío extraer grandes cantidades de ARN de bacterias cultivadas en SCFM2, debido a la naturaleza viscosa del medio. Por lo tanto, la interrupción de la biopelícula con agujas de 0,2 mm antes de la extracción de ARN es un paso importante para aumentar el rendimiento de ARN y garantizar que se extraigan concentraciones suficientes (≥10 ng/μL) para RT-qPCR. El ARN es altamente susceptible a la degradación31, por lo tanto, después de la extracción, asegúrese de que todas las actividades posteriores que utilizan ARN se realicen en hielo. La congelación y descongelación regular de cebadores de ARN, ADNc y qPCR puede aumentar la probabilidad de degradación del producto. Por lo tanto, debe limitarse tanto como sea posible. Otro desafío común en la aplicación de estos modelos es el riesgo de contaminación durante la extracción de ARN o el ensayo de qPCR. Este riesgo se puede minimizar rociando el equipo con solución de degradación de ADN antes de la extracción de ARN y utilizando puntas de pipeta sin ADNasa/ARNasa durante todo el procedimiento. La sustitución periódica del agua libre de ADNasa/ARNasa también ayudará a reducir el riesgo de contaminación dentro del ensayo de qPCR.
Este protocolo optó por centrarse en algD como el gen de interés debido a su necesidad en la producción de alginato, que se describe como un factor de virulencia clave de P. aeruginosa durante infecciones agudas y crónicas32. Por lo tanto, el alginato se estudia cada vez más como objetivo para terapias antivirulencia33,34. Aunque este modelo se ha utilizado para evaluar la expresión de algD, se puede aplicar para evaluar la expresión de otros genes de P. aeruginosa para diferentes dianas farmacológicas antivirulencia. El meropenem se utilizó en este estudio debido a la evidencia que sugiere que el antibiótico influye en la expresión de los genes de biosíntesis de alginato, particularmente cuando P. aeruginosa se cultiva en presencia de C. albicans35. Además, el meropenem a menudo se prescribe clínicamente para tratar y manejar las infecciones respiratorias por P. aeruginosa, lo que destaca su relevante empleo dentro de este modelo36. Sin embargo, la adición de diferentes antibióticos, o incluso tratamientos duales, también es posible con estos modelos. La incorporación de antibióticos dentro de este modelo también permitiría que este modelo se utilice para estudiar cambios evolutivos en los mecanismos de resistencia bacteriana, como el desarrollo de resistencia mediada por porinas por P. aeruginosa a los carbapenémicos37. Este modelo de biopelícula polimicrobiana podría adaptarse para incluir otras especies relevantes, por ejemplo, bacterias comensales como Rothia sp. y Streptococcus sp. o sustituirse por otros microbios causantes de infecciones como Aspergillus sp. para reflejar los requisitos del candidato a fármaco que se está examinando.
Los modelos de biopelículas polimicrobianas que imitan el pulmón de la FQ se han desarrollado previamente38. El modelo descrito aquí se basa en trabajos anteriores con el fin de aumentar el rendimiento mediante el uso de una configuración susceptible de cultivos microbianos de pequeño volumen. Esto es ventajoso para probar compuestos novedosos donde el material disponible puede ser limitado. Como el modelo es estático y a pequeña escala, es posible cultivar las biopelículas en diferentes disponibilidades de oxígeno para reflejar más de cerca el entorno microaerofílico en los pulmones39,40. Para facilitar la reproducibilidad y por razones de rentabilidad, las biopelículas reportadas en este estudio se cultivaron aeróbicamente.
A pesar de los valiosos conocimientos obtenidos de este estudio, se deben reconocer varias limitaciones. En primer lugar, la ausencia de células huésped limita su utilidad para el estudio de factores de virulencia que tienen una diana celular directa en mamíferos. Esto describe los desafíos de establecer modelos in vitro adecuados para el estudio de factores de virulencia y destaca la necesidad de un mayor desarrollo de modelos que repliquen el entorno hostil de las infecciones crónicas. Además, aunque se considera un factor de virulencia, el alginato es una característica clave de las biopelículas y es producido por P. aeruginosa tanto en el laboratorio como en el medio ambiente. El uso de modelos in vitro para estudiar agentes antibiofilm puede ser menos desafiante que el uso de los modelos para estudiar otras terapias antivirulencia, como los agentes antiexotoxinas, donde el objetivo tiene acción directa sobre las células eucariotas41.
Si bien la elección de la cepa de P. aeruginosa de PAO1 es adecuada para la reproducibilidad y estandarización del modelo in vitro , puede ser deseable incluir aislamientos de infección crónica. Se llevará a cabo una experimentación futura utilizando este modelo con una cepa aislada de muestras de pacientes para observar el efecto de los antimicrobianos en cepas adaptadas al nicho respiratorio.
El uso de SCFM2 como imitador del esputo en este modelo in vitro permite la observación estandarizada y replicable de los cambios de comportamiento de las biopelículas agregadas cultivadas en un entorno relevante para las vías respiratorias durante el curso del tratamiento con antibióticos. SCFM2 se seleccionó sobre la versión original de SCFM debido a la inclusión de ADN extracelular (eDNA) y mucina, que son factores importantes para apoyar la formación de biopelículas. Sin embargo, es importante tener en cuenta que también están disponibles otras variantes del medio de esputo sintético, como SCFM3, que contiene ácido p-aminobenzoico, NAD+, adenina, guanina, xantina e hipoxantina42, y SCFM4, que es una versión deficiente en hierro. Además, el uso de medios de esputo sintéticos, como los medios pulmonares de fibrosis quística (CFLM) y los medios sinusales de fibrosis quística (CFSM), desarrollados por Ruhluel y sus colegas43, permitiría la compartimentación de las vías respiratorias para visualizar el comportamiento y el efecto de las terapias antivirulencia en biopelículas polimicrobianas en diferentes entornos.
Si bien AlgD es una enzima clave en la vía biosintética del alginato, su nivel de expresión por sí solo no debe tomarse como una indicación de la producción de alginato. Otros factores, como las modificaciones postranscripcionales y postraduccionales, así como los mecanismos reguladores, pueden influir en la cantidad de alginato producido, lo que conduce a una menor formación de biopelículas, una mayor susceptibilidad al estrés ambiental y una mayor sensibilidad a los antibióticos cuando se reduce la producción de alginato12,14. Hay varias terapias antivirulencia en desarrollo que se dirigen a la proteína alginato donde este modelo no sería apropiado para determinar su eficacia y donde sería más beneficioso medir directamente la producción de alginato o una lectura funcional44. Además, algunas terapias antivirulencia pueden dirigirse a diferentes etapas de la biosíntesis o regulación del alginato, por lo que medir la producción de alginato captura directamente el efecto neto de la terapia sobre el factor de virulencia44. Sin embargo, varias de las terapias antivirulencia en los estudios actuales se dirigen a genes clave de alginato, y modelos de expresión génica como estos serían apropiados para estudiar los efectos de tales terapias 13,14. Técnicas como esta también se pueden adaptar fácilmente para la detección de alto rendimiento, lo que permite la evaluación rápida de múltiples muestras o condiciones, lo que es beneficioso en estudios a gran escala que involucran la detección inicial de posibles compuestos antivirulencia.
En general, los modelos de biopelícula de una sola especie y de múltiples especies representan herramientas valiosas para estudiar la expresión de genes relevantes para la infección de P. aeruginosa en condiciones apropiadas para la FQ. El despliegue a gran escala de la terapia moduladora ha revolucionado el panorama de la atención médica de la FQ. Sin embargo, a pesar de la variedad de beneficios clínicos de los moduladores de la FQ, los estudios han demostrado que los linajes clonales de Pseudomonas estáncirculando, lo que destaca que aún se requieren nuevas terapias para controlar las infecciones pulmonares por P. aeruginosa 45,46. A pesar de las limitaciones discutidas, la aplicación de estos modelos podría ser útil dentro de la fase de descubrimiento de la línea de desarrollo de fármacos para evaluar la efectividad de los compuestos dentro del nicho pulmonar de FQ y las interacciones de nuevos compuestos antivirulencia con antibióticos conocidos dentro de este entorno.

La fibrosis quística (FQ) es el trastorno autosómico recesivo más común dentro de las poblaciones caucásicas1. Las mutaciones en el gen regulador de la conductancia transmembrana de la fibrosis quística (CFTR) dan lugar a una serie de síntomas clínicos, incluida la sobreproducción de moco dentro del tracto respiratorio. El deterioro del transporte de iones hace que esta mucosa se deshidrate, como consecuencia de lo cual, no es eliminada adecuadamente por el sistema mucociliar, lo que aumenta la susceptibilidad a las infecciones pulmonares crónicas1. La microbiología del pulmón con FQ consiste en un grupo distinto de patógenos oportunistas, siendo Haemophilus influenzae y Staphylococcus aureus considerados organismos primarios que infectan los pulmones de lactantes y niños con FQ, seguidos de una disminución de estos organismos y la posterior colonización con Burkholderia spp., o Pseudomonas aeruginosa durante la edad adulta1,2,3,4. Además de las especies bacterianas, los microorganismos fúngicos también son comunes en el entorno pulmonar de la FQ, siendo Candida spp y Aspergillus spp algunas de las especies fúngicas más comúnmente aisladas3,4,5. Aunque estos organismos desempeñan un papel importante en las infecciones pulmonares por FQ, los avances en las técnicas de cultivo y los métodos independientes del cultivo han demostrado que las infecciones pulmonares por FQ rara vez se limitan a una sola especie bacteriana, lo que pone de manifiesto la naturaleza compleja y polimicrobiana de la fibrosis quística pulmonar1,6.
A pesar de este conocimiento, los métodos actuales in vitro e in vivo para el desarrollo y la prueba de antibióticos para su uso en infecciones pulmonares crónicas carecen de una semejanza completa con el nicho pulmonar de la FQ7, centrándose en la determinación de la concentración inhibitoria mínima (MIC) del fármaco frente a cultivos de una sola especie. Esto proporciona una consideración limitada del microambiente infeccioso, que es un componente clave de la patología pulmonar de la FQ8. Como tal, los métodos generalmente involucran el crecimiento de bacterias como cultivos planctónicos, un estado de crecimiento que probablemente no refleja el de las bacterias dentro del pulmón de FQ. Esto es particularmente importante para P. aeruginosa, que típicamente se presenta como agregados de biopelícula que a menudo contienen adicionalmente otras especies bacterianas y fúngicas9. Estos factores presentan desafíos cuando se prueban antibióticos para infecciones pulmonares crónicas y resaltan una disparidad entre los métodos de prueba de susceptibilidad a los antibióticos y la actividad antimicrobiana dentro del entorno pulmonar de FQ9,10. Estos desafíos se exacerban cuando se seleccionan alternativas a los antibióticos, como las terapias antivirulencia, donde los ensayos de CMI no son un indicador de actividad y no proporcionan una comprensión de las interacciones huésped-patógeno11.
El alginato, un polisacárido extracelular, es un componente clave de las biopelículas de P. aeruginosa dentro del nicho pulmonar y aumenta la tolerancia bacteriana a los antibióticos y agentes inmunes, además de mejorar la adhesión a la superficie12. El alginato es un objetivo atractivo para el desarrollo de terapias contra la virulencia, y se han desarrollado varias terapias dirigidas a la biosíntesis de alginato, como las dirigidas a algD, un gen clave en la biosíntesis de alginato13,14. Tales terapias podrían usarse junto con terapias con antibióticos en personas con FQ para interrumpir las biopelículas de P. aeruginosa, convirtiendo las bacterias en un estado planctónico. Esto aumenta la eficacia del antibiótico, ya que la ruptura de la matriz extracelular de la biopelícula permite una mayor capacidad del antibiótico para alcanzar el objetivo bacteriano15. Sin embargo, a pesar de la evidencia de actividad in vitro, la acción de estas terapias dentro del nicho pulmonar de la FQ sigue sin estar clara.
El modelo de biopelícula agregada presentado aquí actúa para abordar estos problemas mediante la adición de S. aureus y C. albicans, que son cocolonizadores comunes con P. aeruginosa dentro del pulmón de FQ. También permite que P. aeruginosa crezca en agregados de biopelícula, como se observa en el entorno respiratorio. El uso del medio que imita el esputo, el medio sintético de fibrosis quística 2 (SCFM2), como entorno nutricional para el crecimiento, permite la adición de influencias del huésped, incluida la mucina, el ADN (e) extracelular y un perfil de aminoácidos que replica el observado en el pulmón de FQ16.
Para capturar aún más las condiciones del pulmón con FQ, se exponen biopelículas al meropenem, un antibiótico que se prescribe con frecuencia a las personas con FQ durante los períodos de exacerbación pulmonar. Se recomienda el uso de un antibiótico dentro de este modelo como un medio para replicar las condiciones clínicas en las que se puede prescribir un agente antivirulencia, por ejemplo, como una terapia combinada junto con un tratamiento con antibióticos para controlar los síntomas respiratorios durante la exacerbación. Además, la inclusión de meropenem permite evaluar la respuesta transcripcional de P. aeruginosa a la exposición a antibióticos en condiciones relevantes para la infección. Este modelo podría utilizarse para proporcionar información sobre qué factores serían dianas farmacológicas apropiadas dentro del pulmón con FQ. El modelo también podría modificarse para incluir otros antibióticos relevantes, como la tobramicina, y para evaluar la expresión de otros genes de interés.
Aquí, este modelo polimicrobiano agregado se utiliza para evaluar los efectos de la presencia de Staphylococcus aureus y Candida albicans y las concentraciones variables de meropenem (1, 16 y 256 μg/mL) sobre la expresión de algD por P. aeruginosa. El meropenem se prescribe para tratar principalmente las infecciones pulmonares por P. aeruginosa y no tiene ningún efecto directo sobre S. aureus o C. albicans, donde la CMI para estas dos especies cohabitantes es de >256 μg/mL.
Este trabajo aumentará la comprensión de cómo los factores relevantes, como los factores del huésped dentro de SCFM2 y los microorganismos cocolonizadores, pueden influir en la expresión de genes relevantes para la infección por P. aeruginosa y proporcionará las bases para el desarrollo y la prueba de terapias antivirulencia para su uso en infecciones respiratorias crónicas por FQ.

<table><tbody><tr><td>Membrana de sellado fácil de respirar para placas de pocillos múltiples&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich&nbsp;</td><td></td><td></td>Z763624</tr><tr><td>Mechero</td><td></td><td></td><td></td>Bunsen</tr><tr><td>Celulasa (100 mg/mL)</td><td>Cambridge Bioscience&nbsp;</td><td>HY-B2220-5g</td><td></td></tr><tr><td>CN suplemento&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich&nbsp;</td><td>1.07624</td><td></td></tr><tr><td>Kit de minipreparación de ARN de zol directo</td><td>Zymo Research</td><td>R2050</td><td></td></tr><tr><td>Dnase I&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EN0521</td><td></td></tr><tr><td>Agua libre de DNasa/ARNasa</td><td>VWR</td><td>J60610. Sulfato</td> de gentamicina XC <td></td></tr><tr><td>(30 &micro; g/mL)</td><td>Sigma Aldrich&nbsp;</td><td>G3632</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol (1 %)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15514029</td><td></td></tr><tr><td>GoTaq qPCR Master Mix&nbsp;</td><td>Promega&nbsp;</td><td>A6101</td><td></td></tr><tr><td>Kit de síntesis de iScript Cdna&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>1708890</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina (250 U/mL)</td><td>Suministros de laboratorio Scientfic</td><td>P3032-10MU</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 4 Fluorímetro</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q33238</td><td></td></tr><tr><td>Qubit RNA BR Kit de ensayo&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q10210</td><td></td></tr><tr><td>Tubos Qubit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q32856</td><td></td></tr><tr><td>Solución de resazurina (0,02 %)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R12204</td><td></td></tr><tr><td>RNAlater Soln</td><td>Invitrogen</td><td>AM7021</td><td></td></tr><tr><td>Estreptomicina (250 &micro; g/mL)</td><td>Sigma Aldrich&nbsp;</td><td>Termociclador S9137</td><td></td></tr><tr><td>(usamos el termociclador T100)</td><td>Biorad</td><td>1861096</td><td></td></tr><tr><td>reactivo TRIzol&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>15596026</td><td></td></tr><tr><td>Vancomicina (3 y micro; g/mL)</td><td>Sigma Aldrich&nbsp;</td><td></td><td></td>1709007</tr></tbody></table>

modelo de biopelícula agregada de fibrosis quística para estudiar la expresión génica relevante para la infección

Cystic Fibrosis Aggregate Biofilm Model to Study Infection-relevant Gene Expression

Los métodos estándar de pruebas preclínicas para nuevas terapias antimicrobianas utilizadas para tratar infecciones pulmonares crónicas en personas con fibrosis quística no reflejan las condiciones ambientales del nicho pulmonar hostil. Las condiciones actuales de las pruebas reduccionistas pueden conducir a la progresión de los compuestos a lo largo de una tubería preclínica sin evidencia de su actividad en condiciones apropiadas para el nicho pulmonar de la fibrosis quística. Varios enfoques utilizados para estudiar los antimicrobianos tradicionales pueden no ser adecuados para las alternativas a los antibióticos, incluidas las terapias antivirulentas como los agentes sensores anti-quórum y los inhibidores de sideróforos. Este protocolo documenta un modelo de biopelícula agregada de Pseudomonas aeruginosa para comparar la resistencia y la expresión génica relevante para la infección en cultivos de una sola especie y de varias especies (Staphylococcus aureus y Candida albicans), examinando las reducciones de las unidades formadoras de colonias (UFC) y los cambios en la expresión génica, utilizando algD como ejemplo. El modelo se optimizó para volúmenes pequeños y estáticos de cultivos bacterianos para permitir el estudio de nuevos compuestos en la fase de descubrimiento de la cartera de desarrollo de fármacos, donde las cantidades de compuestos pueden ser limitadas. Se formaron biopelículas de P. aeruginosa de una sola especie en el medio sintético de fibrosis quística 2 (SCFM2) durante 24 h antes del tratamiento con meropenem a diferentes concentraciones (1, 16 y 256 μg/mL) durante otras 24 h. Las biopelículas polimicrobianas se establecieron cultivando Staphylococcus aureus y Candida albicans juntos en SCFM2, luego se inocularon con P. aeruginosa durante 24 h adicionales y se trataron con meropenem. La falta de una conexión directa entre las medidas de eficacia de los compuestos en las pruebas preclínicas y los resultados de los ensayos clínicos ha puesto en duda la aplicabilidad de las herramientas de cribado de laboratorio actuales. Este modelo nos permite comprender el impacto de factores relevantes en la expresión génica de P. aeruginosa, incluidos los genes que contribuyen a la resistencia y la virulencia, cerrando así esta brecha.

Los resultados mostrados en la Figura 1A destacan la resistencia de los biofilms de Pseudomonas de una sola especie cuando se someten a tratamiento con meropenem, ya que no se observó una disminución significativa a ninguna de las dosis ensayadas. El control negativo, que no fue expuesto a meropenem, mostró una recuperación de 8,31 ± 0,07 Log10CFU/mL, mientras que la mayor reducción de células viables ocurrió a 16 µg/mL, resultando en una recuperación de 8,06 ± 0,10 Log10CFU/mL. Sin embargo, este nivel de resistencia es esperado, ya que se ha demostrado en la literatura que los biofilms de P. aeruginosa son mucho más resistentes al meropenem que sus contrapartes planctónicas, requiriéndose una concentración de &gt;256 µg/mL para ser bactericida frente a los biofilms25,26, en comparación con las células planctónicas, que tienen una CMI de 2 µg/mL.
Figura 1B muestra el porcentaje promedio de reducción en la actividad metabólica de los biofilms de P. aeruginosa en monocultivo a cada concentración de antibiótico en comparación con el biofilm de control, que no fue expuesto a meropenem. Una reducción en la fluorescencia se traduce en una menor actividad metabólica, considerada como un indicador de la reducción en células viables. Los cultivos tratados con meropenem mostraron un aumento en la actividad metabólica (indicado por una reducción porcentual negativa), lo que sugiere ausencia (o muy limitada) de actividad bactericida.
La mayor actividad metabólica sin un aumento en la recuperación de UFC podría indicar la respuesta metabólica de las bacterias a la exposición al antibiótico. Entre los biofilms de una sola especie y los biofilms multiespecie (Figura 2), el crecimiento general de P. aeruginosa difirió solo ligeramente, siendo la recuperación de células viables del biofilm de una sola especie 0,74 ± 0,17 Log10UFC/mL mayor que la observada en el biofilm polimicrobiano cuando no se añadió antibiótico. S. aureus se recuperó del biofilm polimicrobiano a 6,95 ± 0,11 Log10UFC/mL, y C. albicans se recuperó a 1,66 ± 2,88 Log10UFC/mL. C. albicans, sin embargo, solo está presente en los lugares donde no se ha añadido meropenem y no se recuperó de ningún biofilm al que se administró el antibiótico. Dado que el meropenem no tiene un efecto directo sobre Candida, como se ha demostrado en ensayos previos de CMI realizados en el laboratorio con cultivos puros de C. albicans, donde el valor de CMI del meropenem fue &gt;256 µg/mL, es probable que sea la respuesta al estrés bacteriano de las otras especies convivientes, S. aureus y P. aeruginosa, ante la exposición al antibiótico lo que genera condiciones hostiles para el hongo.
Dado que los biofilms de P. aeruginosa, tanto en monocultivo como con patógenos colonizadores conjuntos, no muestran una reducción en la recuperación de células viables en concentraciones de meropenem hasta 256 µg/mL, esto resalta la necesidad de terapias alternativas, como las terapias anti-virulencia, para combatir estas infecciones crónicas en el entorno clínico, las cuales podrían actuar en conjunto con agentes antimicrobianos para reducir eficazmente la carga bacteriana.
algD expresión en biopelículas de una sola especie de P. aeruginosa PAO1 
Se evaluó la expresión de algD en P. aeruginosa PAO1 expuesta a diferentes concentraciones de meropenem (1, 16 y 256 µg/mL) cultivada en SCFM2 mediante RT-qPCR con SYBR-Green. Luego, la expresión se analizó utilizando el método 2-ΔΔCt, empleando 16S como gen de control (Figura 3). La expresión de algD no mostró diferencias significativas entre las concentraciones de meropenem utilizadas, lo que sugiere que, cuando crece como una biopelícula de una sola especie, la expresión de algD en PAO1 no se ve fuertemente afectada por la presencia de meropenem.
algD expresión en biopelículas multiespecíficas de P. aeruginosa PAO1 
La expresión de algD también se evaluó en P. aeruginosa PAO1 cultivada en biopelículas compuestas por S. aureus SH100 y C. albicans CAF2.1, para determinar si la presencia de organismos colonizadores conjuntos influía en la expresión de algD o en la respuesta al meropenem en PAO1. No se observaron diferencias significativas en la expresión de algD entre las concentraciones de 0-16 µg/mL de meropenem. Sin embargo, a 256 µg/mL, la expresión de algD fue significativamente mayor en comparación con las otras concentraciones del antibiótico (0 µg/mL frente a 256 µg/mL, p = 0,0075; 1 µg/mL frente a 256 µg/mL, p = 0,035; 16 µg/mL frente a 256 µg/mL, p = 0,0048), aproximadamente 7 veces mayor que en la condición control (Figura 4). Esto destaca que, cuando se cultiva en presencia de S. aureus y C. albicans, existe un aumento en la expresión de algD a la concentración más alta de meropenem, en comparación con cuando P. aeruginosa se cultiva sola, lo que sugiere un incremento en la producción de alginato en el entorno polimicrobiano. A pesar de demostrar diferencias en la expresión de algD entre biopelículas uniespecíficas y multiespecíficas, no está claro si este aumento en la expresión está impulsado por la presencia de una especie específica (S. aureus o C. albicans) o si son las interacciones entre ambos microorganismos las que inducen este cambio en la expresión génica.
Estos resultados destacan la importancia de comprender el impacto de los tratamientos y el entorno sobre la expresión génica, particularmente en el contexto de las pruebas futuras de terapéuticos dirigidos a la virulencia.
<img alt="Gráficos de barras de inhibición del crecimiento bacteriano para P. aeruginosa, S. aureus y C. albicans frente a la concentración." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67477/67477fig1.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 1"> 
Figura 1: Biofilms de una sola especie compuestos por Pseudomonas aeruginosa PAO1. Los biofilms se cultivaron durante 24 h en SCFM2, se trataron con 50 µg/mL de DNasa I durante 1 h y luego con meropenem a diversas concentraciones durante otras 24 h. (A) Log10 promedio de UFC/mL. La línea punteada indica una reducción de 2 log (equivalente a una reducción del 99 %) en la recuperación de P. aeruginosa respecto al control negativo. (B) Porcentaje de reducción en unidades de fluorescencia relativa. La línea punteada indica una reducción del 50 % en la fluorescencia, siendo el primer punto por encima de esta línea considerado como el valor de CMI50. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67477/67477fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Concentración de meropenem frente al crecimiento bacteriano (A) y la reducción de fluorescencia (B) en gráficos." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67477/67477fig2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 2"> 
Figura 2: Biofilms multiespecie compuestos por Pseudomonas aeruginosa PAO1, Staphylococcus aureus SH1000 y Candida albicans CAF2.1. Los biofilms se cultivaron durante 24 h en SCFM2, se trataron con 50 µg/mL de DNasa I durante 1 h y luego se trataron con meropenem a diversas concentraciones durante otras 24 h. La línea punteada indica una reducción de 2 logaritmos (equivalente a una reducción del 99 %) en el recuento de P. aeruginosa respecto al control negativo. La significancia se determinó mediante ANOVA de dos vías, donde **** p &lt; 0,0001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67477/67477fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Gráfico de barras de expresión relativa frente a concentración (µg/ml), que muestra el resultado del análisis estadístico (ns)." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67477/67477fig3.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 3"> 
Figura 3: Expresión de algD extraída de una especie individual compuesta por P. aeruginosa PAO1. Los biofilms se cultivaron durante 24 h en SCFM2, se trataron con 50 µg/mL de DNasa I durante 1 h y se expusieron a concentraciones variables de meropenem (0, 1, 16, 256 µg/mL). La expresión génica se analizó mediante el método 2-ΔΔCt. En el análisis se utilizó el gen de referencia 16S. La significancia se determinó mediante la prueba de comparación múltiple de Tukey. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67477/67477fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Gráfico de barras de expresión relativa frente a concentración; significancia estadística; análisis de expresión génica." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67477/67477fig4.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 4"> 
Figura 4: Expresión de algD extraída de biofilms multi-específicos compuestos por P. aeruginosa PAO1, S. aureus SH1000 y C. albicans CAF2.1. Los biofilms se cultivaron en SCFM2, se trataron con 50 µg/mL de DNasa I durante 1 h y luego con meropenem a diversas concentraciones (0, 1, 16, 256 µg/mL) durante 24 h adicionales. La expresión génica se analizó mediante el método 2-ΔΔCt. En el análisis se utilizó el gen de referencia 16S. **p &lt; 0,01 según la prueba de comparación múltiple de Tukey. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67477/67477fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Volumen por reacción de ADNc (μL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mezcla de reacción 5X iscript</td>
			<td>4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transcriptasa inversa iscript</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agua libre de DNasa/RNasa</td>
			<td>14</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,5 ng de ARN</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volumen total de la reacción</td>
			<td>20</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabla 1: Soluciones de trabajo de la mezcla maestra de ADNc. Componentes y volúmenes necesarios por reacción de ADNc.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Gen</td>
			<td>Primer directo</td>
			<td>Primer inverso</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>algD</td>
			<td>CGCCGAGATGATCAAGTACA</td>
			<td>TGTAGTAGCGCGACAGGTTG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16S</td>
			<td>ACCGCATACGTCCTACGG</td>
			<td>CGAAGACCTTCTTCACACACG</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabla 2: algD y 16S primers de qPCR directos e inversos 
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Volumen por reacción (µL)</td>
			<td>Volumen de trabajo de algD (µL)</td>
			<td>Volumen de trabajo de 16S (µL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GoTaq qPCR Master Mix (2X)</td>
			<td>10</td>
			<td>440</td>
			<td>40</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer directo</td>
			<td>1</td>
			<td>44</td>
			<td>4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer inverso</td>
			<td>1</td>
			<td>44</td>
			<td>4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agua libre de DNasa/RNasa</td>
			<td>6</td>
			<td>264</td>
			<td>24</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Total </td>
			<td>18</td>
			<td>792</td>
			<td>72</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabla 3: Soluciones de trabajo de la mezcla maestra de qPCR. Componentes y volúmenes necesarios para las soluciones de mezcla maestra de qPCR de algD y 16S.
Figura suplementaria 1: Biofilms multiespecie compuestos por Pseudomonas aeruginosa LESB58, Staphylococcus aureus SH1000 y Candida albicans CAF2.1. Los biofilms se cultivaron durante 24 h (n = 3) en SCFM2, se trataron con 50 µg/mL de DNasa I durante 1 h y luego con meropenem a diversas concentraciones durante otras 24 h. La línea punteada indica una reducción de 2 logaritmos (equivalente a una reducción del 99 %) en el recuento de P. aeruginosa respecto al control negativo. El análisis estadístico se realizó mediante ANOVA de dos vías. *p=0.0242, ** p=0.0013, **** p &lt;0.0001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67477/Supplementary_Figure_1_RE.tif" target="_blank">Haga clic aquí para descargar esta figura.</a>

Este estudio describe un marco para desarrollar un modelo de biopelícula polimicrobiana agregada y optimizar un protocolo de extracción de ARN para evaluar la expresión génica de Pseudomonas aeruginosa que refleja el entorno pulmonar de la fibrosis quística. Las aplicaciones incluyen la evaluación de los efectos antimicrobianos y el estudio de alternativas a los antibióticos en condiciones relevantes para la fibrosis quística.

Modelo de biopelícula agregada de fibrosis quística para estudiar la expresión génica relevante para la infección

Standard pre-clinical testing methods for novel antimicrobial therapeutics used to treat chronic lung infections in people with cystic fibrosis do not ...

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Investigación

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