Cribado in vitro basado en LED para la evaluación de moléculas fotoactivables en la inactivación fotodinámica bacteriana

Mi investigación se centra en explorar diferentes moléculas de la familia de los compuestos de flavilio, tanto naturales como sintéticos, con un interés central en estudiar su bioactividad en el contexto de la fotoprotección UV y evaluar su potencial como fotosensibilizadores para aplicaciones de terapia fotodinámica. Los hallazgos recientes en nuestro grupo de investigación demostraron las propiedades activadas por la luz de los colorantes de flavilo basados en aminoácidos, estableciéndolos como una nueva clase prometedora de fotosensibilizantes. Estos compuestos exhiben un potencial significativo para una mayor exploración, allanando el camino para aplicaciones innovadoras en el campo.

Utilizando el sistema de microplacas y paneles de luz de 96 pocillos, podemos obtener un cribado de alto rendimiento de fotosensibilizadores en un entorno controlado, lo que simplifica la identificación y comparación entre diferentes candidatos para la terapia fotodinámica. Para comenzar, introduzca la bacteria Staphylococcus aureus en la placa de agar Mueller-Hinton del cultivo de parada. Incubar la placa a 37 grados centígrados durante 24 horas para obtener cultivo fresco.

Recoja dos o tres colonias frescas de la placa de agar y dilúyalas en seis mililitros de PBS filtrado estéril precalentado a pH 7.4. Agite el inóculo a 1.200 revoluciones por minuto durante tres o cuatro ciclos para homogeneizar la muestra y extraer tres mililitros del inóculo homogeneizado en una cubeta desechable. Después de medir la densidad óptica a 600 nanómetros, diluya la muestra para que coincida con la densidad óptica de 0,1 usando PBS.

Prepare una solución madre del compuesto fotosensibilizador en un disolvente adecuado, como DMSO o PBS. Diluya la solución madre en PBS para crear la solución de trabajo, asegurándose de que los componentes del medio de cultivo bacteriano no interfieran con la absorción de luz. Vortex la solución de trabajo para garantizar una homogeneización completa.

Para comenzar, prepare la suspensión de Staphylococcus aureus y la solución de trabajo del compuesto fotosensibilizador. Prepare dos placas separadas de 96 pocillos, una designada para la exposición a la luz y otra para el control de la oscuridad. En cada placa, dispense 100 microlitros de la solución fotosensibilizadora y de la suspensión bacteriana.

Mezcle las soluciones de 5 a 10 veces con la pipeta. Incubar las placas a 37 grados centígrados durante 30 minutos para permitir que el fotosensibilizador interactúe con las células bacterianas. Después de la incubación, retire las placas de la incubadora.

Mantenga una de las placas protegida de la exposición a la luz como control de oscuridad. Coloque la otra placa de 96 pocillos sobre el panel LED rectangular de 50 vatios. Marque los bordes de la placa en la superficie del LED para garantizar una ubicación coherente en las repeticiones de protocolo.

Exponga la placa a la luz LED durante unos 15 minutos. Utilice otra placa de 96 pocillos para preparar diluciones en serie de las muestras, incluidos los pocillos de control, los pocillos irradiados y los no irradiados. Agregue 180 microlitros de PBS a cada pocillo, de acuerdo con el número de muestras.

Alícuota 20 microlitros de cada pocillo en las placas irradiadas y no irradiadas en la primera columna de la placa llena de PBS. Con una micropipeta multicanal, realice una dilución en serie simple desde el pocillo 1 hasta el pocillo 6. Divida una placa de agar en seis secciones iguales, cada una de las cuales corresponde a una de las diluciones.

Alícuota 10 microlitros de cada pocillo en la sección correspondiente de la placa de agar. Incubar la placa durante 18 a 20 horas. Retire la placa de agar de la incubadora e identifique las áreas adecuadas para el recuento de colonias.

Dentro de cada sección de la placa de barrena, cuente el número de unidades formadoras de colonias. El espectro del rango de luz visible mostró tres picos distintos entre 400 y 700 nanómetros. En condiciones de oscuridad, ninguno de los compuestos de flavilio probados mostró efectos citotóxicos.

Por el contrario, después de la exposición a la luz, los compuestos probados causaron una disminución dependiente de la dosis en la viabilidad de Staphylococcus aureus con efectos significativos observados a concentraciones de 6 y 12 micromolares.