Detección de autoanticuerpos anti-MDA5 mediante células HeLa e inmunocitoquímica con microscopía óptica

El objetivo principal del siguiente experimento es utilizar la inmunocitoquímica para detectar anticuerpos anti-MDA5. Esto se hace mediante el uso de las células HeLa y luego transfecte la célula HeLa con la construcción MDA5. Como tal, las células HeLa producirán proteínas MDA5 que pueden ser unidas por anticuerpos MDA5.

Después de incluir la célula HeLa con la construcción MDA5, el reactivo Triton se utiliza para permeabilizar la membrana de las células HeLa, lo que permitiría el paso de los anticuerpos anti-MDA5. Después de lo cual, se agrega el suero del paciente que contiene los anticuerpos anti-MDA5. Los anticuerpos anti-MDA5 se unirían a las proteínas MDA5 dentro de las células HeLa.

Después de eso, los anticuerpos secundarios, a los que se une la peroxidasa de rábano picante, se despliegan en las células, los anticuerpos secundarios se unirían a los anticuerpos anti-MDA5. Finalmente, el cromógeno se agrega a las células y se oxida en presencia de anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa de rábano picante, produciendo un color visible bajo un microscopio óptico. Un resultado positivo mostraría algo como la imagen de arriba.

En la demostración en video de hoy, nos adentramos en un área crítica de la investigación médica, la detección del anticuerpo del gen cinco asociado a la diferenciación antimelanoma, también llamado anticuerpo anti-MDA5. Estos autoanticuerpos desempeñan un papel fundamental como indicador de diagnóstico simple para pacientes con enfermedad pulmonar intersticial, especialmente aquellos con enfermedad pulmonar rápidamente progresiva. La importancia de esta investigación radica en su impacto potencial en los resultados de los pacientes. La detección temprana y precisa del autoanticuerpo MDA5 es vital para controlar eficazmente esta grave enfermedad autoinmune.

La principal ventaja del método que demostramos sobre el método de oro de detección de autoanticuerpos anti-MDA5 es que se puede hacer más rápido y ahorrar tiempo y esfuerzo en comparación con el ensayo de inmunovisitación tradicional radiomarcado. Esta mayor eficiencia nos permite procesar más muestras y generar resultados rápidamente. Además, es crucial tener en cuenta que nuestro método no solo ofrece una eficiencia superior, sino también en seguridad y rentabilidad en comparación con el ensayo de inmunoprecipitación de transición.

Ahora, veamos cómo se hace. Mi asistente de investigación, Teo Kai Fa, dirigirá el procedimiento. Mantenga las células HeLa con el medio de águila modificado de Dulbecco que contiene un 10% de suero bovino fetal y un 1% de antibiótico antimicótico a 37 grados centígrados en una atmósfera humidificada de 5% de CO2.

Pasar las células cada dos o tres días, o cuando las células alcancen una confluencia del 90 al 100%. Coloque 70, 000 células HeLa en cada pocillo de una placa de 24 pocillos. 24 horas antes de la transfección, y las células netas, que aproximadamente 90% de confluencia.

Diluir 500 nanogramos de plasmina y 1,5 microlitros de reactivo de transfección cada uno en un medio sérico reducido de 25 microlitros. Agregue ADN diluido, haga reactivo de transfección diluido en una proporción de uno a uno. Mezclar bien e incubar durante cinco minutos.

Agregue la mezcla a las células asentadas un día antes y agite para mezclar el complejo lipídico de ADN inmediatamente. Confirme que las células son 80 a 90% confluentes. Incube las células a 37 grados Celsius en un hemisferio humidificado al 5% de CO2, de 40 a cuatro horas, y proceda a la inmunocitoquímica.

Utilizamos un factor disponible comercialmente. Puede encontrar más información en la tabla de materiales. Su eficacia de transfección es del 50%El éxito de la transfección y la expresión de la proteína diana se puede determinar transfectando las células con proteína congelada que expresa plásmido y conduciendo sangre occidental para visualizar la expresión de la proteína diana. Después de la incubación, lave las células dos veces con PBS para eliminar cualquier medio restante.

El lavado se puede realizar agitando la placa o un agitador orbital. Fije las células con paraformaldehído al 4% en PBS Precaución. El paraformaldehído es tóxico.

Utilice pautas de manejo adecuadas. Deje las celdas durante 15 minutos a temperatura ambiente. A continuación, deseche el reactivo fijador.

Use PBS para lavar la celda dos veces. Aplique el reactivo Triton y luego deje reposar las células durante 10 minutos a temperatura ambiente. Usamos Triton X 400 en PBS a una concentración de 0,3%Después de 10 minutos, deseche el reactivo Triton.

Agregue PBS para lavar las células una vez. Siguiente paso, realizar el bloqueo con suero bovino fetal al 10% en PBS y dejar las células durante una hora a temperatura ambiente, retirar el reactivo de bloqueo. Luego, agregue PBS para lavar las células una vez.

Agregue el plasma diluido del paciente a las células. Asegúrese de diluir el plasma del paciente en una proporción de una a 5, 000 diluciones en PBS antes de su uso. Ajuste la dilución para mejorar la señal o reducir el fondo según sea necesario para garantizar resultados imparciales.

El personal realizó la prueba, no tenía conocimiento de qué muestras pertenecían a pacientes y cuáles eran de individuos sanos. Incube una muestra a cuatro grados centígrados durante 12 a 16 horas. Después del período de incubación, retire la muestra del paciente y lave las células tres veces con PBS.

Tratar las células con cabra conjugada con peroxidasa de rábano picante diluida, anti-IgG humana en una proporción de una a 250 diluciones en PBS. Deje las celdas durante una hora a temperatura ambiente. Una hora más tarde, deseche el anticuerpo secundario.

Enjuague con PBS tres veces. Después de lavar las células, tiña las células con 300 microlitros de solución de trabajo DAB por pocillo. La solución de trabajo DAB se prepara omitiendo el concentrado de promoción DAB y el diluyente DAB siguiendo las instrucciones del fabricante.

Después de teñir la célula durante cinco minutos, retire el tinte. Después de retirar el tinte, enjuague con el agua destilada ionizada y agite durante cinco minutos. Contratiña el núcleo celular con hematoxina diluida.

Usamos hemotoxina en como un, en 10 veces la dilución. Espere cinco minutos para el proceso de tinción. Después de cinco minutos, deseche la hemotoxina, luego lave con el agua destilada analizada dos veces durante cinco minutos cada una.

Paso final, observe los resultados de la tinción bajo un microscopio óptico. Interpretemos los resultados de nuestro ensayo de inmunocitoquímica para los autoanticuerpos anti-MDA5. Un resultado positivo.

Un verdadero positivo muestra una fuerte tinción marrón dentro de HeLa que expresa MDA5. Esto confirma los autoanticuerpos anti-MDA5 en la muestra del paciente. Un resultado negativo.

Un resultado negativo muestra células HeLa sin tinción marrón, lo que indica que no hay autoanticuerpos anti-MDA5. Un resultado falso positivo. Críticamente, un falso positivo muestra una extensa tinción marrón en todas las células, independientemente de la expresión de MDA5s.

Esta tinción inespecífica observada para que las condiciones autoinmunes se distingan de un verdadero positivo para evitar un diagnóstico erróneo. Nuestro método ofrece una forma más rápida, segura y rentable de detectar anticuerpos anti-MDA5 en los órganos. Esto tiene el potencial de afectar significativamente los resultados de los pacientes en el tratamiento de la enfermedad pulmonar intersticial.

Después de ver este video, habrá aprendido cómo realizar el procedimiento de inmunocitoquímica y cómo identificar la relevancia clínica en los resultados de la prueba.