Name: Lavado salino para la toma de muestras del microambiente inmunitario nasal canino (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-12-27T14:50:00.000+00:00
Duration: 4 min 35 s
Description: Aprende el lavado salino nasal para muestrear el microambiente inmunitario en perros con tumores nasales. Esta técnica no invasiva permite análisis seriados de respuestas inmunes durante la radioterapia.

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<ol><li>Cohn, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Canine+nasal+disease%3A+An+update%5BTitle%5D)+AND+%22Vet+Clin%3A+Small+Anim+Pract%22%5BJournal%5D)">Canine nasal disease: An update.</a> Vet Clin: Small Anim Pract. 50 (2), 359-374 (2020).</li>
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<li>Choi, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+canine+pd-1%2Fpd-l1+specific+monoclonal+antibodies+and+amplification+of+canine+t+cell+function%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Development of canine pd-1/pd-l1 specific monoclonal antibodies and amplification of canine t cell function.</a> PLoS One. 15 (7), e0235518(2020).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>1,5 ml&nbsp; Tubos</td><td>Eppendorf</td><td>05-402</td><td></td></tr><tr><td>1000 &micro; L Pipeta</td><td>VWR</td><td>89079-974</td><td></td></tr><tr><td>1x PBS</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Jeringas de 20 mL</td><td>VWR</td><td>BD302830</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Tubos cónicos</td><td>VWR</td><td>89039-656</td><td></td></tr><tr><td>70 &micro; Filtro de células m</td><td>Fisherbrand</td><td>22-363-548</td><td></td></tr><tr><td>8FR Catéter de goma rojo estéril</td><td>Med Vet International</td><td>50-252-2428</td><td></td></tr><tr><td>ACK Tampón de lisis</td><td>Gibco</td><td>A1049201</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Beckman Coulter</td><td>366816</td><td></td></tr><tr><td>Fisiología Salina (0.9%)</td><td>Vetivex</td><td>17033-492-01</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>VWR</td><td>10153-838</td><td></td></tr></tbody></table>

lavado salino para la toma de muestras del microambiente inmunitario nasal canino

Saline Lavage for Sampling of the Canine Nasal Immune Microenvironment

Con este método de lavado nasal, la muestra recolectada aparecerá ligeramente turbia, posiblemente con pedazos visibles de desechos celulares y moco cuando se gira el tubo. Se consideraría que una muestra está contaminada con sangre periférica si el procedimiento de lavado induce inadvertidamente una hemorragia y la muestra está teñida de rojo. Si bien parte de la solución salina infundida se perderá durante el procedimiento, se consideraría un lavado negativo si la solución salina infundida no fluye de regreso fuera de la fosa nasal hacia el tubo; Las posibles causas podrían ser que la cabeza no esté inclinada hacia abajo lo suficiente como para permitir un reflujo efectivo, que la muestra se haya drenado caudal o lateralmente a través de la fosa nasal contralateral, o que el catéter de goma roja no esté firmemente fijado a la jeringa y que la solución salina se haya filtrado hacia afuera desde el punto de conexión.
Cuando se han recogido con éxito muestras de lavado nasal de perros con cáncer nasal, se prevén recuentos de células nucleadas en el rango de 1 × 10 6-200 × 106, con un 75-96% de células vivas. Por otro lado, cuando se han recogido con éxito muestras de lavado nasal de perros con cavidades nasales sanas y no inflamadas, los recuentos de células han estado en el rango de 7 × 105-2 × 106, con un 6-16% de células vivas. En la Figura 2 se presenta una imagen representativa de los especímenes citológicos obtenidos de muestras de lavado nasal de perros portadores de tumores. Además, en la Figura 3 se presenta la evaluación citométrica de flujo de las poblaciones celulares analizadas a partir de muestras de lavado nasal de perros sanos y portadores de tumores. Se esperaría que los recuentos de células y el porcentaje de viabilidad inferiores a estos rangos indicaran que el procedimiento de lavado nasal y la recolección de muestras no tuvieron éxito. En la Tabla 1 se resumen los resultados de la técnica de lavado nasal realizada por los autores con respecto al número de procedimientos realizados, el número de perros, el estado de la cavidad nasal (sana o portadora de tumor), el rendimiento de los recuentos de células nucleadas, la viabilidad de las células obtenidas para el procedimiento y si la muestra de lavado se consideró un éxito o un fracaso para el análisis posterior. A los efectos de los experimentos realizados con las muestras de lavado nasal incluidas en la Tabla 1, se consideró que una producción mínima de 150.000 células era una recolección exitosa de muestras de lavado nasal.
Con esta técnica de lavado nasal, se utiliza solución salina estéril al 0,9% para recoger las células. Alternativamente, se podría considerar la solución de Hartmann (solución de Ringer lactato); sin embargo, las muestras recolectadas con solución salina o solución de Hartmann tendrían que ser analizadas para garantizar una viabilidad y resultados comparables para las células de interés. Además, una alternativa al uso de un catéter de goma roja en perros no portadores de tumores podría ser realizar el lavado nasal con un catéter Foley. Aunque no se utiliza en la técnica de lavado nasal que se presenta aquí, el uso de un catéter de Foley permitiría inflar el balón en la punta del catéter, ocluyendo la cavidad nasal y evitando la pérdida de líquido caudal. Además, aunque no se ha probado en el enfoque de procesamiento de lavado nasal presentado aquí, se podría considerar la adición de hialuronidasa a la muestra de lavado nasal para romper la mucosidad recolectada en la muestra de lavado nasal y liberar más células para el análisis. Esto también tendría que optimizarse para garantizar que los resultados no se vean alterados por la adición de hialuronidasa al procedimiento de procesamiento de lavado nasal.
En la Figura 310 se presentan los resultados publicados obtenidos de procedimientos exitosos de lavado nasal realizados en perros inscritos en un ensayo clínico de cáncer canino. Los resultados presentados en la Figura 3 provienen de un estudio que investigó el impacto de la irradiación ganglionar electiva en el microambiente inmunitario local de perros con tumores nasales cuyos tumores se irradiaron solos o en combinación con la irradiación de ganglios linfáticos cervicales regionales. A través de muestreos seriados de la cavidad nasal de perros en el ensayo clínico con lavado nasal, el análisis citométrico de flujo de las células recolectadas reveló una disminución significativa en las poblaciones de células T efectoras en el último día de radioterapia cuando los ganglios linfáticos regionales se irradiaron simultáneamente con el tumor nasosinual en comparación con los perros que recibieron radioterapia dirigida al tumor y los ganglios linfáticos regionales se salvaron. Esto demuestra la utilidad de tomar muestras en serie de la cavidad nasal con lavado para investigar los cambios en las poblaciones celulares en diferentes puntos y con diferentes condiciones de tratamiento.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67577/67577fig01.jpg"> 
Figura 1: Esquema del método de lavado nasal. La solución salina estéril y calentada se infunde en la cavidad nasal de los perros anestesiados mediante un catéter de goma roja. El líquido de lavado nasal se recoge en un tubo a medida que drena de la nariz. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67577/67577fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67577/67577fig02.jpg"> 
Figura 2: Composición celular de una muestra de lavado nasal recogida de un perro con un tumor nasal. Imagen representativa de muestras citológicas obtenidas de muestras de lavado nasal (aumento de 500x, tinción de Wright-Giemsa modificada). Los neutrófilos (flechas) son las células predominantes, con algunas células epiteliales escamosas (punta de flecha) y pequeños linfocitos maduros (resaltados en el cuadro cuadrado) también presentes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67577/67577fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67577/67577fig3v2.jpg"> 
Figura 3. Análisis citométrico de flujo de muestras de lavado nasal recolectadas de perros sanos y portadores de tumores. Comparación de la abundancia de células vivas, células inmunitarias y neutrófilos entre perros sanos (azul, n = 3) y perros portadores de tumores con carcinoma nasal (rojo, n = 4). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67577/67577fig3v2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67577/67577fig04.jpg"> 
Figura 4: Análisis citométrico de flujo de células recolectadas del lavado nasal de perros inscritos en un ensayo clínico que investiga el impacto de la irradiación ganglionar electiva (ENI) en el microambiente inmunológico local. Cuantificación de linfocitos T CD4 (CD5+CD4+) y CD8 (CD5+CD8+) a partir de muestras de lavado nasal. Los perros tratados con ENI simultáneamente con la irradiación tumoral (n = 3) tuvieron una reducción significativa de las células T efectoras CD4 y CD8 en el último día de radiación (día 3) en comparación con los perros tratados con radiación dirigida al tumor solo (n = 3). Esta figura fue modificada a partir de Darragh et al.10. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67577/67577fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Saludable (n=3)</td>
			<td>Portación tumoral (n= 19)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Número de procedimientos realizados</td>
			<td>3</td>
			<td>80</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recuento de células</td>
			<td>0,7 x 106 - 2,8 x 106</td>
			<td>1,6 x 106 - 210 x 106; Mediana: 8.7 x 106</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Viabilidad celular</td>
			<td>6.3 - 15.9%</td>
			<td>75% - 96%; Mediana: 87%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tasa de éxito</td>
			<td>100%</td>
			<td>98.80%</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabla 1: Resumen de los procedimientos de lavado nasal realizados y características celulares de las muestras obtenidas.

Lavado salino para la toma de muestras del microambiente inmunitario nasal canino

Evaluating the local immune microenvironment of the canine nasal cavity can be important for investigating normal tissue health and disease conditions, ...

saline-lavage-for-sampling-of-the-canine-nasal-immune-microenvironment

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Medicine

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