Name: Marcaje de fluorescencia para visualizar proteínas de baja expresión en el pez cebra (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-01-24T14:40:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: Aprende a etiquetar proteínas con marcadores fluorescentes en larvas de pez cebra para visualizar proteínas de baja abundancia. Este protocolo optimiza la construcción de donantes y mejora la eficiencia en estudios de biología molecular.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<meta charset="utf8"></head><body>Marcaje de proteínas fluorescentes en larvas de pez cebra mediante CRISPR/Cas9 knock-in

<ol><li>Brittijn, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+development+and+regeneration%3A+new+tools+for+biomedical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Zebrafish development and regeneration: new tools for biomedical research.</a> Int J Dev Biol. 53 (5-6), 835-850 (2009).</li>
<li>Gemberling, M., Bailey, T. J., Hyde, D. R., Poss, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+as+a+model+for+complex+tissue+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">The zebrafish as a model for complex tissue regeneration.</a> Trends Genet. 29 (11), 611-620 (2013).</li>
<li>Haraoka, Y., Miyake, M., Ishitani, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+imaging+reveals+hidden+oncogenic-normal+cell+communication+during+primary+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Struct+Funct%22%5BJournal%5D)">Zebrafish imaging reveals hidden oncogenic-normal cell communication during primary tumorigenesis.</a> Cell Struct Funct. 48 (1), 113-121 (2023).</li>
<li>Gomes, M. C., Mostowy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+case+for+modeling+human+infection+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The case for modeling human infection in zebrafish.</a> Trends Microbiol. 28 (1), 10-18 (2020).</li>
<li>Trede, N. S., Langenau, D. M., Traver, D., Look, A. T., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+zebrafish+to+understand+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">The use of zebrafish to understand immunity.</a> Immunity. 20 (4), 367-379 (2004).</li>
<li>Karlsson, J., von Hofsten, J., Olsson, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generating+transparent+zebrafish%3A+a+refined+method+to+improve+detection+of+gene+expression+during+embryonic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Mar+Biotechnol+%28NY%29%22%5BJournal%5D)">Generating transparent zebrafish: a refined method to improve detection of gene expression during embryonic development.</a> Mar Biotechnol (NY). 3 (6), 522-527 (2001).</li>
<li>White, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transparent+adult+zebrafish+as+a+tool+for+in+vivo+transplantation+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis.</a> Cell Stem Cell. 2 (2), 183-189 (2008).</li>
<li>Antinucci, P., Hindges, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+crystal-clear+zebrafish+for+in+vivo+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">A crystal-clear zebrafish for in vivo imaging.</a> Sci Rep. 6, 29490(2016).</li>
<li>He, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+ligase+3-dependent+microhomology-mediated+end+joining+repair+of+DNA+double-strand+breaks+in+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat+Res%22%5BJournal%5D)">Efficient ligase 3-dependent microhomology-mediated end joining repair of DNA double-strand breaks in zebrafish embryos.</a> Mutat Res. 780, 86-96 (2015).</li>
<li>Hisano, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precise+in-frame+integration+of+exogenous+DNA+mediated+by+CRISPR%2FCas9+system+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Precise in-frame integration of exogenous DNA mediated by CRISPR/Cas9 system in zebrafish.</a> Sci Rep. 5, 8841(2015).</li>
<li>Luo, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9-based+genome+engineering+of+zebrafish+using+a+seamless+integration+strategy%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9-based genome engineering of zebrafish using a seamless integration strategy.</a> FASEB J. 32 (9), 5132-5142 (2018).</li>
<li>Wierson, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+targeted+integration+directed+by+short+homology+in+zebrafish+and+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Efficient targeted integration directed by short homology in zebrafish and mammalian cells.</a> Elife. 9, e53968(2020).</li>
<li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+tagging+strategies+for+illuminating+expression+profiles+of+genes+with+different+abundance+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Commun+Biol%22%5BJournal%5D)">Optimal tagging strategies for illuminating expression profiles of genes with different abundance in zebrafish.</a> Commun Biol. 6 (1), 1300(2023).</li>
<li>Li, C., Evans, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ligation+independent+cloning+irrespective+of+restriction+site+compatibility%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Ligation independent cloning irrespective of restriction site compatibility.</a> Nucleic Acids Res. 25 (20), 4165-4166 (1997).</li>
<li>Yu, C., Zhang, Y., Yao, S., Wei, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+PCR+based+protocol+for+detecting+indel+mutations+induced+by+TALENs+and+CRISPR%2FCas9+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A PCR based protocol for detecting indel mutations induced by TALENs and CRISPR/Cas9 in zebrafish.</a> PLoS One. 9 (6), e98282(2014).</li>
<li>Hirata, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Connexin+39.9+protein+is+necessary+for+coordinated+activation+of+slow-twitch+muscle+and+normal+behavior+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Connexin 39.9 protein is necessary for coordinated activation of slow-twitch muscle and normal behavior in zebrafish.</a> J Biol Chem. 287 (2), 1080-1089 (2012).</li>
<li>Cason, N., White, T. W., Cheng, S., Goodenough, D. A., Valdimarsson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+cloning%2C+expression+analysis%2C+and+functional+characterization+of+connexin44.1%3A+a+zebrafish+lens+gap+junction+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Molecular cloning, expression analysis, and functional characterization of connexin44.1: a zebrafish lens gap junction protein.</a> Dev Dyn. 221 (2), 238-247 (2001).</li>
<li>Urushibata, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+developmental+speed+in+zebrafish+embryos+using+different+incubation+temperatures%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">Control of developmental speed in zebrafish embryos using different incubation temperatures.</a> Zebrafish. 18 (5), 316-325 (2021).</li>
<li>Yu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+digestion+and+ligation-mediated+PCR+used+for+flanking+sequence+walking%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Cyclic digestion and ligation-mediated PCR used for flanking sequence walking.</a> Sci Rep. 10 (1), 3434(2020).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>1000 y micro; L&nbsp; puntas</td><td>Cualquier marca</td><td>N/A</td><td>Para todas las manipulaciones</td></tr><tr><td>Tubos de 1,5 mL</td><td>Cualquier marca</td><td>N/A</td><td>Para el almacenamiento y centrifugación de diversas soluciones</td></tr><tr><td>Tubos de 1,5 mL (sin RNasa)</td><td>Cualquier marca</td><td>N/A</td><td>Para el almacenamiento y centrifugación de soluciones sin RNasa</td></tr><tr><td>10 &micro; L puntas</td><td>Cualquier marca</td><td>N/A</td><td>Para todas las manipulaciones</td></tr><tr><td>10 &micro; Puntas L (sin RNasa)</td><td>Cualquier marca</td><td>N/A</td><td>Para manipulaciones sin RNasa</td></tr><tr><td>1000 y micro; L&nbsp; puntas (sin ARNasa)</td><td>Cualquier marca</td><td>N/A</td><td>Para manipulaciones sin ARNasa</td></tr><tr><td>1-fenil 2-tiourea (PTU)</td><td>Sigma</td><td>P7629</td><td>Para inhibir la melanogénesis y mantener las larvas transparentes</td></tr><tr><td>200 &micro; L puntas</td><td>Cualquier marca</td><td>N/A</td><td>Para todas las manipulaciones</td></tr><tr><td>200 y micro; Puntas L (sin RNasa)</td><td>Cualquier marca</td><td>N/A</td><td>Para manipulaciones sin RNasa</td></tr><tr><td>2x Taq Plus Master Mix II (Dye Plus)</td><td>Vazyme</td><td>P213-03</td><td>PCR para pruebas de eficiencia de sgRNA</td></tr><tr><td>Placas de 35 mm</td><td>Corning</td><td>430165</td><td>Para la obtención</td></tr><tr><td>de imágenes Placas de 6 pocillos</td><td>Cualquier marca</td><td>N/A</td><td>Para la cría de peces cebra de forma individual y temporal</td></tr><tr><td>Acc65I</td><td>NEB</td><td>R0599S</td><td>Para digestión enzimática</td></tr><tr><td>Ácido acético</td><td>Sigma</td><td>695092</td><td>Para la preparación de tampones TAE</td></tr><tr><td>Agar</td><td>Biofroxx</td><td>8211GR500</td><td>Para placas LB</td></tr><tr><td>Ampicilina, sal sódica</td><td>Sangon</td><td>A610028</td><td>Para placas LB</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>C5080</td><td>Para la preparación de tampones embrionarios</td></tr><tr><td>Tubos capilares</td> Harvard <td>Apparatus</td><td>30-0016</td><td>Para agujas generadoras para inyección</td></tr><tr><td>Tubos capilares</td><td>Cualquier marca</td><td>ID (diámetro interior) = 0,1 mm</td><td>Para cuantificar una gota de 1 nL</td></tr><tr><td>CRISPRscan</td><td>CRISPRscan</td><td>&nbsp; http://www.crisprscan.org/</td> <td>Para el diseño de sgRNA</td></tr><tr><td>DH5 y alfa;</td><td>TIANGEN</td><td>CB101</td><td>Para la transformación</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E6758</td><td>Para la preparación de tampones de lisis y tampones TAE</td></tr><tr><td>Ensembl</td><td>Ensembl</td><td>&nbsp; https://asia.ensembl.org/Danio_rerio/Info/Index</td><td>Para encontrar información genética</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>HUSHI</td><td>64-17-5</td><td>Para purificación y extracción de ADN</td></tr><tr><td>Exonucleasa III Takara</td><td></td><td>2170A</td><td>LIC</td></tr><tr><td>Microinyector de gas</td><td>Warner Instruments</td><td>PLI-100A</td><td>Para microinyección</td></tr><tr><td>Sistema de electroforesis en gel</td><td>WIX</td><td>WIX-EP3000</td><td>Para gel electroforesis</td></tr><tr><td>Guantes</td><td>Cualquier marca</td><td>N/A</td><td>Para todas las manipulaciones</td></tr><tr><td>Glucosa</td><td>sgdbio</td><td>10010518</td><td>Para placas LB</td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sangon</td><td>A501745</td><td>Para placas LB</td></tr><tr><td>gRNA-pMD19-T</td><td>China Zebrafish Resource Center (CZRC)</td><td>CZP3</td><td>plásmido sgRNA que contiene andamio sgRNA</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P5405</td><td>Para embrión Preparación de tampón</td></tr><tr><td>Solución de precipitación de cloruro de litio</td><td>Thermofisher</td><td>AM9480</td><td>Precipitación de sgRNAs, libre de RNasa Agarosa</td></tr> de <tr><td>bajo punto de fusión</td><td>Sangon</td><td>A600015</td><td>Para la preparación de geles de agarosa al 4%</td></tr><tr><td>Sulfato de magnesio</td><td>sgdbio</td><td>20025118</td><td>Para placas LB</td></tr><tr><td>Baño de metal</td><td>Cualquier marca</td><td>N/A</td><td>Para incubación a temperatura constante</td></tr><tr><td>Azul de metileno</td><td>Sigma</td><td>M9140</td><td>Para la preparación de tampones de embriones</td></tr><tr><td>Molde de microinección</td><td>Casero</td><td>N/A</td><td>Para generar ranuras para sujetar embriones durante la microinyección</td></tr><tr><td>Microcargador, punta para el llenado de Femtotips y otros microcapilares de vidrio, estéril, 0.5 &ndash; 20 &micro; L, 100 mm, gris claro, 192 uds. (2 bastidores y tiempos; 96 piezas.)</td><td>Eppendorf</td><td>5242956003</td><td>Para cargar la solución de microinyección en la aguja de inyección, sin ARNasa</td></tr><tr><td>Extractor de micropipetas</td><td>Sutter Instrument</td><td>P-97</td><td>Para la generación de agujas para inyección</td></tr><tr><td>Micropipetas</td><td>Eppendorf</td><td>N/A</td><td>Para todas las manipulaciones</td></tr><tr><td>Microondas</td><td>Cualquier marca N</td><td>/A</td><td>Para fundición de placa de inyección y geles de agarosa</td></tr><tr><td>MinElute PCR Kit de purificación (50)</td><td>QIAGEN</td><td>28004</td><td>Para purificar productos de PCR y productos de digestión, sin RNasa</td></tr><tr><td>mMESSAGE mMACHINE T3 Kit de transcripción</td><td>Invitrogen</td><td>AM1348</td><td>Transcripción in vitro de ARNm Cas9, sin N</td></tr><tr><td>2</td><td>Cualquier marca</td><td>N/A</td><td>Para microinyección</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S5886</td><td>Para la preparación de tampones embrionarios y tampones de lisis</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td>Para la preparación de tampones embrionarios</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sangon</td><td>A100173</td><td>Para la preparación de tampones TAE</td></tr><tr><td>Agua libre de nucleasas Thermofisher</td><td></td><td>R0581</td><td>Manipulaciones relacionadas con ARN, libre de ARNasa</td></tr><tr><td>PciI</td><td>NEB</td><td>R0655S</td> Para máquina de PCR para <td>digestión enzimática</td></tr><tr><td></td><td>Cualquier marca</td><td>N/A</td><td>Amplificación</td></tr><tr><td>de PCR, tubos de tiras de PCR</td><td>, Cualquier marca</td>, <td>N/A</td><td>, Para PCR,</td></tr><tr><td>tubos de PCR,</td><td>FEITONGKANG</td><td>BLP-200</td>, <td>Para PCR</td></tr>, <tr><td>placa de Petri</td>, <td>Cualquier marca</td><td>, N/A</td><td>Para la cría de larvas de pez cebra, etc.</td></tr><tr><td>Rojo de fenol</td><td>Sigma</td><td>P0290</td><td>Para microinyección, sin RNasa</td></tr><tr><td>Soporte para pipetas</td><td>Warner Instruments</td><td>PLI-PH1</td><td>Para microinyección</td></tr><tr><td>PrimeStar (Premezcla)</td><td>Takara</td><td>DR040A</td><td>Para clonación molecular</td></tr><tr><td>Proteinasa K</td><td>Merck</td><td>539480</td><td>Para extracción de ADN genómico</td></tr><tr><td>pT3TS (T3:zCas9-UTRglobin)</td><td>China Zebrafish Resource Center (CZRC)</td><td>Plantilla de plásmido</td> <td>CZP11</td> Cas9</tr><tr><td>Centrífuga refrigerada</td><td>Cualquier marca</td><td>N/A</td><td>Para centrifugación relacionada con ARN</td></tr><tr><td>Escala</td><td>Sartorius</td><td>BCE124-1CCN</td><td>Para fundición de placa de inyección y geles de agarosa</td></tr><tr><td>Tijeras</td><td>Cualquier marca</td><td>N/A</td><td>Para cortar colas de peces adultos</td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sangon</td><td>A600485</td><td>Para la preparación</td></tr> <tr><td>de tampones de lisisCepillos pequeños</td><td>Cualquier marca</td><td>N/A</td><td>Para el movimiento suave de embriones en placas de microinyección</td></tr><tr><td>Espectrofotómetro</td><td>Thermofisher</td><td>NanoDrop 2000</td><td>Para mediciones de concentración de ADN/ARN</td></tr><tr><td>Micrómetro de etapa</td><td>Cualquier marca</td><td>DIV (División) = 0,01 mm</td><td>Para cuantificar una gota de 1 nL</td></tr><tr><td>Microscopio de fluorescencia estereoscópica</td><td>Olympus</td><td>SZX16</td><td>Para la observación de la expresión génica</td></tr><tr><td>Microscopio estereoscópico</td><td>Motic</td><td>SMZ-168</td><td>Para observación y microinyección</td></tr><tr><td>T7 RiboMAX Express Sistema de producción de ARN a gran escala</td><td>Promega</td><td>P1320</td><td>Transcripción in vitro de sgRNAs, sin RNasa</td></tr><tr><td>Incubadora de temperatura controlada</td><td>Cualquier marca</td><td>N/A</td><td>Para la incubación de embriones</td></tr><tr><td>TIDE</td><td>TIDE https://tide.nki.nl/</td><td></td> <td>Para el análisis de la eficiencia del sgRNA&nbsp;</td></tr><tr><td>Metanosulfonato de tricaína</td><td>Sigma</td><td>A5040</td><td>Para la preparación de soluciones de tricaína</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sangon</td><td>A600194</td><td>Para la preparación de soluciones de tricaína, tampón de lisis y tampón TAE</td></tr><tr><td>Triptona</td><td>OXOID</td><td>LP0042</td><td>Para placas LB</td></tr><tr><td>Pinzas</td> Cualquier <td>marca</td><td>N/A</td><td>Para cortar agujas de inyección</td></tr><tr><td>XbaI</td><td>NEB</td><td>R0145S</td><td>Para enzimáticas digestión</td></tr><tr><td>Extracto de levadura</td><td>OXOID</td><td>LP0021</td><td>Para placas LB Sistema</td></tr> de <tr><td>acuario de pez cebra</td><td>ESEN</td><td>ESEN-AW-S1</td><td>Para la cría de peces adultos</td></tr><tr><td>Tanques de apareamiento de pez cebra (con divisor)</td><td>Cualquier marca</td><td>N/A</td><td>Para el apareamiento de los peces</td></tr><tr><td>Zeiss LSM 900+Airyscan2</td><td>ZEISS</td><td>Zeiss LSM900</td><td>Para la obtención de imágenes confocales de los peces marcados con fluorescencia y análisis de datos</td></tr><tr><td>Sitio web de ZFIN</td><td>ZFIN http://zfin.org/</td><td></td> <td>Para encontrar información sobre genes</td></tr></tbody></table>

marcaje de fluorescencia para visualizar proteínas de baja expresión en el pez cebra

Fluorescence Labeling to Visualize Low-Expressed Proteins in Zebrafish

Las uniones gap que consisten en proteínas poliméricas llamadas conexinas son esenciales para el intercambio de metabolitos e iones de bajo peso molecular entre las células en contacto. El método de marcaje de proteínas fluorescentes descrito anteriormente se utilizó para marcar la conexina 39.9 (Figura 5A) y la conexina 44.1 (Figura 5B), respectivamente. El KI correcto se verificó mediante PCR de unión (Figura 6)....

Marcaje de fluorescencia para visualizar proteínas de baja expresión en el pez cebra

CRISPR/Cas9-mediated knock-in (KI) technology allows for easier fluorescent-protein tagging in zebrafish (Danio rerio), a preferred model organism for in ...

fluorescence-labeling-to-visualize-low-expressed-proteins-in-zebrafish

Research

Investigación

JoVE Journal

Genetics

Genética

Todo el montaje hibridación in situ es una de las técnicas más utilizadas en la biología del desarrollo. Aquí se presenta una alta resolución de doble fluorescente en el protocolo de hibridación in situ para analizar el patrón de expresión precisa de un solo gen y para determinar la superposición de los dominios de expresión de dos genes. Se incluye un yoduro de propidio nuclear tinción de contraste para destacar la organización del tejido.

Pez cebra todo el montaje de alta resolución doble fluorescente In Situ La hibridación

La clave para entender los procesos morfogenéticos que forma el embrión temprano es la capacidad de las células de la imagen en alta resolución. Se describe aquí una técnica para el etiquetado de las células individuales o pequeños grupos de células en embriones de pez cebra con toda la membrana dirigidos proteína verde fluorescente.

Etiquetado y las Pilas de imágenes en la parte posterior del cerebro de pez cebra

Este protocolo esboza una manera de etiquetar y rastrear el destino de los pequeños grupos de células de embriones de pez cebra empleando la radiación UV-uncaging de fluoresceína enjaulado, seguido de monte se inmunomarcaje para amplificar la señal de la fluoresceína uncaged.

Etiquetado linaje de células de pez cebra con láser Uncagable fluoresceína Dextran

Las células que mueren son expulsados ​​de los tejidos epiteliales por la contracción concertada de las células vecinas sin interrumpir la función de barrera. La claridad óptica del pez cebra en desarrollo ofrece un excelente sistema para visualizar la extrusión en la vida epitelios. A continuación se describen los métodos para inducir y extrusión de la imagen en la epidermis larvas de pez cebra a una resolución de celulares.

Imágenes en directo de extrusión celular de la epidermis del pez cebra en desarrollo

Se describe un método para photoactivate células individuales que contienen una proteína fluorescente enjaulado con la absorción de dos fotones de un Ti: Zafiro de femtosegundos oscilador láser. Para asignar el destino de la célula fotoactivado, inmunohistoquímica se usa. Esta técnica se puede aplicar a cualquier tipo de célula.

Sola célula de mapeado de destino en el pez cebra

Descrito aquí es un protocolo para la formación de imágenes semiautomático de la fluorescencia específica de tejido en embriones de pez cebra.

Imaging semi-automatizado de fluorescencia específica de tejido en embriones de pez cebra

El embrión de pez cebra es un excelente modelo para la investigación de la biología del desarrollo. Durante la embriogénesis, el desarrollo de pez cebra con una masa de yema, que presenta retos en tres dimensiones para la observación de muestras y análisis. Este protocolo se describe cómo crear dos dimensiones planas montar preparaciones de todo el montaje in situ (WISH), teñidas muestras de embriones de pez cebra.

Preparativos Piso en observación y análisis de embrión de pez cebra muestras teñidas por todo el montaje<em&gt; In situ</em&gt; La hibridación

Los niveles de proteína en células y tejidos son a menudo estrechamente regulada por el equilibrio de la producción y eliminación de proteínas. Utilizando fluorescencia Decay Después Fotoconversión (FDAP), la cinética de eliminación de proteínas pueden ser medidos experimentalmente in vivo.

Medición de la estabilidad de proteínas en la sala de embriones de pez cebra Utilizando fluorescencia Decay Después Fotoconversión (FDAP)

Obtener imágenes del comportamiento dinámico de orgánulos y otras estructuras subcelulares in vivo puede arrojar luz sobre su función en condiciones fisiológicas y de enfermedad. Aquí, presentamos métodos para marcar genéticamente dos orgánulos, centrosomas y mitocondrias, e imágenes de su dinámica en embriones vivos de pez cebra utilizando microscopía confocal y de campo amplio.

La formación de imágenes estructuras subcelulares en el embrión vivo de pez cebra

Las manipulaciones dirigidas para causar estrés dirigido o muerte en células individuales han sido relativamente difíciles de lograr. Aquí, se describe un enfoque de ablación de resolución de una sola célula para estresar selectivamente y matar células individuales en cultivos celulares y animales vivos basado en un láser UV confocal estándar.

Desencadenar el estrés celular y la muerte Uso convencional UV láser confocal Microscopía

Este protocolo demuestra la inmunofluorescencia secuencial y la inmunohistoquímica en criosecciones de embriones de pez cebra en etapa temprana que permiten análisis precisos de la colocación en poblaciones celulares específicas.

Inmunofluorescencia secuencial e inmunohistoquímica en embriones de pez cebra crioseccionados

Aprende a etiquetar proteínas con marcadores fluorescentes en larvas de pez cebra para visualizar proteínas de baja abundancia. Este protocolo optimiza la construcción de donantes y mejora la eficiencia en estudios de biología molecular.

Marcaje de fluorescencia para visualizar proteínas de baja expresión en el pez cebra

Explorar más videos