Name: Análisis de la actividad de las células T humanas en un entorno de cocultivo alogénico de células tumorales pretratadas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-03-07T13:40:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: Aprende a analizar la estimulación de células T humanas en cocultivo alogénico con células tumorales pretratadas mediante radioterapia e inhibidores de quinasas. Este método evalúa la proliferación y expresión de marcadores superficiales.

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<li>Schnellhardt, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+prognostic+value+of+FOXP3%2B+tumor-infiltrating+lymphocytes+in+rectal+cancer+depends+on+immune+phenotypes+defined+by+CD8%2B+cytotoxic+T+cell+density%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">The prognostic value of FOXP3+ tumor-infiltrating lymphocytes in rectal cancer depends on immune phenotypes defined by CD8+ cytotoxic T cell density.</a> Front Immunol. 13, 781222(2022).</li>
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</ol>

<table><tbody><tr><td>Tubos Cellstar de 15 ml</td><td>Greiner Bio-One GmbH</td><td>188271</td><td></td></tr><tr><td>Tubos Cellstar de 50 ml</td><td>Greiner Bio-One GmbH</td><td>227261</td><td></td></tr><tr><td>placa de cultivo celular de 6 pocillos estéril, con tapa</td><td>Greiner Bio-One GmbH</td><td>657160</td><td></td></tr><tr><td>placa de cultivo celular de 96 pocillos estéril, fondo F, con tapa</td><td>Greiner Bio-One GmbH</td><td>655180</td><td></td></tr><tr><td>AZD0156</td><td>Selleck Chemicals GmbH</td><td>S8375</td><td></td></tr><tr><td>Berzosertib (VE-822)</td><td>Selleck Chemicals GmbH</td><td>S7102</td><td></td></tr><tr><td>CASYcups</td><td>OMNI Life Science GmbH & Co KG&nbsp;</td><td></td><td></td>5651794</tr><tr><td>CASYton</td><td>OMNI Life Science GmbH & Co KG&nbsp;</td><td></td><td></td>5651808</tr><tr><td>CD25a, PE-Dazzle594, IgG1 de ratón</td><td>Biolegend</td><td>356126</td><td></td></tr><tr><td>CD28-UNLB</td><td>Beckmann Coulter, Inc.</td><td>IM1376</td><td></td></tr><tr><td>CD3a, Krome Orange, IgG1 de ratón</td><td>Beckmann Coulter, Inc.</td><td>B00068</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo monoclonal CD3e</td><td>Thermo-Fisher Scientific, Inc.</td><td>MA1-10176</td><td></td></tr><tr><td>CD4, APC, Ratón Anti-Humano IgG1</td><td>BD Pharmingen</td><td>555349</td><td></td></tr><tr><td>CD8 MicroBeads, humano</td><td>Miltenyi Biotec, Inc.</td><td>130-045-201</td><td></td></tr><tr><td>CD8a, PerCP-Cy5.5, IgG1 de ratón</td><td>Biolegend</td><td>300924</td><td></td></tr><tr><td>CellTracker Tinte rojo oscuro</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>C34565</td><td></td></tr><tr><td>CFSE</td><td>&nbsp; Merck KGaA (Sigma-Aldrich)</td><td>21888</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (Dulbecco&acute; s Águila modificada&aguda; Citómetro</td> de flujo <td>PAN-Biotech GmbH</td><td>P04-02500</td><td></td></tr><tr><td>DxFlex (con cargador automático)</td><td>Beckmann Coulter, Inc.</td><td>C44326, C02846</td><td></td></tr><tr><td>EDTA sal disódica dihidratada</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>8043.2</td><td></td></tr><tr><td>FBS superior</td><td>&nbsp; Merck KGaA (Sigma-Aldrich)</td><td>S0615-500ML</td><td></td></tr><tr><td>FBS superior&nbsp;</td><td>&nbsp; Merck KGaA (Sigma-Aldrich)&nbsp;</td><td>S0615-100ML</td><td>Para la producción de FBS inactivado por calor. Calentar durante 30 min a 56 ° C con mezcla para inactivar las proteínas del complemento.</td></tr><tr><td>Graph Pad Prism (número de versión 9)</td><td>GraphPad</td> <td>Software-HLA-DR</td><td></td></tr><tr><td>, DP, DQ Anticuerpo antihumano, APC-Vio770</td><td>Miltenyi Biotec, Inc.</td><td>130-123-550</td><td></td></tr><tr><td>Kaluza (número de versión 2.1)</td><td>Beckmann Coulter, Inc.</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>L-Arginina</td><td>Merck KGaA (Sigma-Aldrich)</td><td>A8094-25G</td><td></td></tr><tr><td>L-Lisina-monoclorhidrato</td><td>Merck KGaA (Sigma-Aldrich)</td><td>L5626-100G</td><td></td></tr><tr><td>MACS BSA Solución madre</td><td>Miltenyi Biotec, Inc.</td><td>130-091-376</td><td></td></tr><tr><td>Columnas MS</td><td>Miltenyi Biotec, Inc.</td><td>130-042-201</td><td></td></tr><tr><td>Cámara de recuento mejorada por Neubauer</td><td>Paul Marienfeld GmbH & Co. KG</td><td>640010</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Merck KGaA (Sigma-Aldrich)</td><td>D8537-500mL</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina</td><td>Thermo-Fisher Scientific, Inc.</td><td>1514-122</td><td></td></tr><tr><td>ROTISep 1077</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>0642.2</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 Medio</td><td>Merck KGaA (Sigma-Aldrich)</td><td>R1790</td><td></td></tr><tr><td>SepMate Tubos de 50 ml</td><td>Stemcell Technologies</td><td>85450</td><td></td></tr><tr><td>Azul de tripano</td><td>Merck KGaA (Sigma-Aldrich)</td><td>T6146-25G</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Thermo-Fisher Scientific, Inc.</td><td></td><td></td>15400054</tr></tbody></table>

análisis de la actividad de las células t humanas en un entorno de cocultivo alogénico de células tumorales pretratadas

Analysis of Human T Cell Activity in an Allogeneic Co-Culture Setting of Pre-Treated Tumor Cells

Las células tumorales HSC4 derivadas de un HNSCC se sembraron e incubaron durante la noche. Después de 24 h, las células fueron tratadas con un inhibidor de la quinasa. A las 3 h se aplicaron las dos primeras dosis de 5 Gy por fracción. Después de 24 h, se aplicó la segunda dosis y las células se incubaron nuevamente durante la noche. Paralelamente, 48 h antes del inicio del cocultivo, se aislaron células T de la sangre de un donante sano. En primer lugar, se aislaron las PBMC utilizando tubos de centrifugación en gradiente de densidad y un medio de separación estéril. Las PBMC se contaron utilizando una cámara de recuento de células, y las células T CD8+ se aislaron utilizando el kit de aislamiento de células T CD8+. A continuación, los linfocitos T CD8+ aislados se tiñeron con CFSE (1 μM) y posteriormente se contaron. Las células T se sembraron en placas de pocillos prerrevestidas CD3/CD28 con una densidad de 1,5 x 106 células/3 mL. Después de 48 h de estimulación, las células T se recolectaron, contaron y resuspendieron en una densidad de 10.000 células/10 μL. Además, se recolectaron y contaron pocillos representativos de las células tumorales sembradas, y el medio se intercambió por todos los pocillos restantes. Las células T se agregaron a las células tumorales en una proporción de 1:1. El cocultivo se cosechó después de 96 h, el sobrenadante se almacenó a -20 °C y las células se tiñeron y midieron por citometría de flujo (Figura 1).
Los linfocitos T se identificaron por exclusión de tamaño y positividad para CD3/CD8. La señal CFSE de las células CD3+/CD8+ positivas mostró la distribución de las células T no proliferativas (alta señal de CFSE) y distintas subpoblaciones de células T en proliferación (pérdida de la intensidad de la señal CFSE). La proporción de linfocitos T en proliferación se midió de forma ejemplar para la línea celular HSC4 HNSCC (Figura 4A). Todos los linfocitos T que mostraron al menos una división se definieron como "proliferativos". Los linfocitos T que mostraron más de 3 divisiones se definieron como "altamente proliferativos" (Figura 4B). En el caso de la línea celular HSC4 negativa para el VPH, se detectó un ligero aumento en la tasa de proliferación cuando las células T se cultivaron conjuntamente con células tumorales irradiadas. La inhibición de RT y RT más ATR dio lugar a un aumento significativo de la proliferación consecutiva de células T en comparación con los cocultivos de células HSC4 tratadas con inhibición de RT más ATM con células T. Con respecto a la fracción "altamente proliferativa" de las células T, el pretratamiento de las células HSC4 con RT más inhibición de ATR fue más eficaz para estimular la proliferación de células T (Figura 4B).
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67643/67643fig04v2.jpg"> 
Figura 4: Proliferación de linfocitos T teñidos con CFSE para análisis de cambios dependientes del tratamiento de HSC4 en la proliferación de linfocitos T. (A) Proporción de linfocitos T en proliferación después de 96 h de cocultivo con linfocitos tumorales HSC4 negativos para el VPH pretratados. La proliferación de linfocitos T fue significativamente menor después del cocultivo con células tumorales HSC4 tratadas con RT+ATMi en comparación con el tratamiento con RT o RT más ATRi. (B) La RT de las células tumorales HSC4 indujo una fracción más alta de células T altamente proliferantes (más de tres divisiones celulares. Después del cocultivo de células tumorales HSC4 pretratadas con RT+ATRi con células T, el porcentaje de células T altamente proliferativas fue el más alto. Las barras muestran datos de cuatro experimentos independientes con las células T de cuatro donantes independientes y sanos (n = 4; Media ± DE). (*p≤ 0.05, **p≤ 0.01, ***p≤ 0.001, ****p≤ 0.0001; significación estadística probada comparando todas las condiciones experimentales con cada una utilizando Mann-Whitney-U de dos colas para datos no distribuidos normalmente). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67643/67643fig04largev2.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
La pérdida de CFSE basada en la proliferación se puede utilizar para cuantificar la tasa de proliferación de células T. Además, se describen varios marcadores de superficie celular asociados con la actividad de las células T, como CD25 y HLADR. Por lo tanto, se realizó el análisis de CD25 y HLA-DR en la superficie de todos los linfocitos T CD3+ y CD8+ mediante citometría de flujo (Figura 5). La expresión se puede cuantificar si se detectan subpoblaciones distintas de CD25alto o HLA-DRalto y se puede discriminar mediante la activación de estas células altamente positivas (Figura 3B). Si no se detectan subpoblaciones distintas, se puede medir la intensidad media de fluorescencia (MFI) de toda la población y se pueden cuantificar los cambios basados en la condición del MFI (Figura 3C).
De manera ejemplar, la expresión identificada por el MFI de CD25 y HLA-DR se analizó después de 96 h de cocultivo con células tumorales HSC4 pretratadas (Figura 5). Después del cocultivo de células T con células tumorales HSC4 tratadas con RT, la expresión de CD25 en las células T se reguló fuertemente a la baja. En particular, el pretratamiento de las células tumorales solo con ATMi resultó en una disminución significativa de la expresión de CD25 en comparación con el pretratamiento con ATRi. En el entorno combinado con RT, aunque la RT dio lugar a una disminución de la expresión de CD25 en las células T, la combinación de RT con ATMi dio lugar a un aumento de la expresión de CD25 en comparación con RT más ATRi (Figura 5A). Con respecto a la expresión de HLA-DR en las células T, la RT generalmente condujo a una regulación positiva de HLA-DR, pero nuevamente, en combinación con ATMi o ATRi, se observó un comportamiento diferente (Figura 5B). Los linfocitos T cocultivados con linfocitos HSC4 que fueron pretratados con una combinación de RT+ATRi aumentaron la expresión de HLA-DR en comparación con RT solo o RT+ATMi.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67643/67643fig05v2.jpg"> 
Figura 5: Expresión de los marcadores de activación CD25 y HLA-DR en la superficie de los linfocitos T tras 96 h de cocultivo con células tumorales HSC4 pretratadas. La expresión de CD25 y HLA-DR se analizó a partir del desplazamiento del MFI de toda la población de linfocitos T. La RT de HSC4 resultó en una disminución de la expresión de CD25 en las células T y un aumento de la expresión de HLA-DR. La combinación de RT con ATMi dio lugar a patrones de expresión significativamente diferentes en comparación con RT más ATRi. Los diagramas de caja muestran datos de cuatro experimentos independientes con las células T de cuatro donantes independientes y sanos (n = 4; Media ± DE). Los datos se analizaron comparando todas las condiciones experimentales entre sí utilizando una prueba de Mann-Whitney-U de dos colas para datos no distribuidos normalmente (*p≤ 0,050). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67643/67643fig05largev2.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Estos datos indican de manera ejemplar que el tratamiento de las células tumorales, en este caso de las células HSC4 HNSCC, afecta la inmunogenicidad de las células tumorales. Esto se puede monitorear mediante el cultivo conjunto de las células tumorales con células T preestimuladas, lo que conduce a un comportamiento de proliferación diverso y expresión de marcadores de activación en las células T humanas según el régimen de tratamiento de células tumorales aplicado.

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