Análisis de la actividad de las células T humanas en un entorno de cocultivo alogénico de células tumorales pretratadas

Las células tumorales cambian el fenotipo inmune durante la terapia, lo que podría afectar el resultado y, por lo tanto, el objetivo de nuestra investigación es investigar la interacción entre las células T y las células tumorales para crear una mejor comprensión de esas interacciones.

Mejorar la radiosensibilidad, particularmente en tumores radiorresistentes mediante la combinación de radioterapia con inhibidores de quinasas. Apuntar a la respuesta al daño del ADN es actualmente una parte central de los desarrollos recientes. Actualmente se han establecido modelos tridimensionales de cultivo celular y modelos de cocultivo en el campo de la radiobiología para aumentar la comparabilidad entre los datos in vitro e in vivo.

[Narrador] Para comenzar, obtenga células tumorales HSC4 en un volumen adecuado de medio D10. Siembre al menos tres pocillos por condición, cada uno con 15,000 células en 200 microlitros de medio en placas de 96 pocillos. Designe una placa para el tratamiento de la muestra, incluidos los pocillos para el control de células tumorales y solo de células T y los pocillos para el recuento de células para cada tratamiento en el día del cocultivo. El segundo día, trate las células tumorales con inhibidores de la quinasa en las concentraciones requeridas. Irradie una placa después de tres a cuatro horas y lo mismo después de 24 horas de incubación con cinco grises para irradiación hipofraccionada. Para el aislamiento de células mononucleares de sangre periférica, o PBMC, transfiera la sangre mezclada con EDTA recolectada de un donante sano a dos tubos de centrifugación de 50 mililitros. Llene ambos tubos de centrifugación hasta 50 mililitros con PBS y FBS al 2%. A continuación, prepare seis tubos de centrifugación con incrustaciones de plástico para la separación de PBMC. Llene cada uno con 15 mililitros de medio de gradiente de densidad fría. Superponga cuidadosamente el medio de gradiente de densidad con 12 a 15 mililitros de sangre diluida. Centrifugar los tubos a 1.200 G durante 10 minutos sin desacelerar. Después de la centrifugación, transfiera el sobrenadante a cuatro nuevos tubos de centrifugación de 50 mililitros. Deseche los tubos usados. Llene los nuevos tubos de centrifugación hasta 50 mililitros con PBS y FBS al 2% y centrifugue a 120 G durante 10 minutos a temperatura ambiente. Deseche con cuidado el sobrenadante. Vuelva a suspender el gránulo celular en un mililitro de PBS que contenga un 2% de FBS y combine los dos gránulos en un tubo de halcón. Vuelva a llenar el tubo de centrifugación a 50 mililitros con PBS que contenga un 2% de FBS. Centrifugar los PBMC a 300 G durante 10 minutos. Deseche con cuidado el sobrenadante. Vuelva a suspender el sedimento celular en 80 microlitros de MACS más tampón por 10 a la potencia de siete celdas. Agregue 20 microlitros de microperlas CD8 por 10 a la potencia de siete celdas y mezcle cuidadosamente pipeteando hacia arriba y hacia abajo. Incubar durante 15 minutos a cuatro grados centígrados. Después de la incubación, lave las células con dos mililitros de MACS más tampón por 10 a la potencia de siete células. Centrifugar el tubo a 300 G durante 10 minutos a temperatura ambiente. Después de desechar el sobrenadante, vuelva a suspender las células en 1000 microlitros de MACS más tampón. Coloque dos columnas MS en el imán y coloque dos tubos de centrifugación de 15 mililitros debajo. Equilibre las columnas con 500 microlitros de MACS más tampón. A continuación, cargue un volumen igual de la suspensión de la célula en la columna MS preparada. Enjuague las columnas con 500 microlitros de MACS más tampón tres veces. Etiquete las células recolectadas finales como flujo continuo o CD8 negativo y combínelas en un solo tubo de centrifugación. Luego tome un nuevo tubo de centrifugación de 15 mililitros etiquetado con células T CD8 positivas. Enjuague ambas columnas que contienen células T CD8 positivas marcadas magnéticamente con 1000 microlitros de MACS más tampón cada una. Antes de teñir las células T, centrifugarlas a 300 G durante cinco minutos. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el sedimento celular en 1000 microlitros de PBS. Centrifugar de nuevo la suspensión a 300 G durante cinco minutos. Después de desechar el sobrenadante, vuelva a suspender el sedimento celular en 2000 microlitros de una solución de tinción micromolar de CFSE. Incubar durante 20 minutos a 37 grados centígrados. A continuación, centrifugar las células teñidas a 300 G durante cinco minutos. Después de lavar las células con PBS, vuelva a suspenderlas en medio de células T. Siembre las células en la placa de seis pocillos recubierta de CD3 y CD28 e incube. El cuarto día, recolecte las células T y vuelva a suspenderlas en su medio respectivo. Agregue el número deseado de células T a los pocillos de células tumorales en una proporción de uno a uno después de contar los pocillos designados. El séptimo día, retire la placa de cultivo de la incubadora para cuantificar la proliferación de células T. Después de lavar las células, tiñéndolas con los anticuerpos deseados y realizando citometría de flujo para evaluar las células T. Excluya la población doblete en función del área de dispersión directa frente a la altura de dispersión directa para obtener singletes. Trace los singlets para identificar las células T en función del área de dispersión directa frente al área de dispersión lateral. Represente la expresión de CD3 contra el área de dispersión lateral para discriminar las células T. Además, identifique las células T CD8 positivas después de trazar la señal CD8 contra el área de dispersión lateral. Todas las células T deben expresar CD3 y CD8. Grafique la señal CFSE de todas las células T CD8 positivas como un histograma. Después de completar los pasos de compuerta, seleccione células T CD8 positivas como entrada y analice su expresión de isotipo CD25 o HLA-DR trazando la fluorescencia del marcador de superficie respectivo contra el área de dispersión lateral. La proporción de células T proliferativas aumentó cuando se cocultivaron con células tumorales HSC4 irradiadas. La radioterapia o RT y RT más inhibición de ATR mejoraron significativamente la proliferación de células T en comparación con RT más inhibición de ATM. Entre las células T altamente proliferativas, la inhibición de RT más ATR fue la más efectiva para estimular la proliferación. La expresión de CD25 en células T se reguló a la baja después del cocultivo con células tumorales HSC4 tratadas con RT. El pretratamiento de las células tumorales con inhibidor de ATM solo disminuyó significativamente la expresión de CD25 en comparación con el inhibidor de ATR. La combinación de RT e inhibidor de ATM dio como resultado un aumento de la expresión de CD25 en comparación con RT más inhibidor de ATR. La expresión de HLA-DR en las células T generalmente se reguló al alza con RT. El cocultivo con células HSC4 pretratadas con RT más inhibidor de ATR aumentó aún más la expresión de HLA-DR en comparación con RT solo o RT más inhibidor de ATM.