Transducción retroviral eficiente y localización competitiva para investigar la localización de células T mediada por GPCR en diversos microentornos tisulares

Nuestra investigación explora cómo los GPCR influyen en el tráfico y posicionamiento de células inmunitarias en varios microambientes tisulares. Utilizando este protocolo y otros protocolos complementarios, nuestro laboratorio ha identificado un eje quimioatrayente específico de órganos en los tejidos de la mucosa no intestinal. Así que ahora, hemos descubierto cómo los linfocitos, hogar del estómago, los pulmones, la tráquea y el tracto GU. Estoy presentando un método eficiente y mejorado para probar cómo los GPCR individuales afectan el movimiento de las células T in vivo. Hemos desarrollado una forma confiable de introducir estos receptores en las células T, que ahora permiten la comparación directa lado a lado en ensayos de búsqueda competitivos. Ahora que sabemos cómo los GPCR guían a las células T in vivo, los investigadores pueden conectar mejor la expresión del receptor con la función inmune. Esto ayudaría a los investigadores en inmunología básica, así como en investigación terapéutica. Con este enfoque, ahora podemos preguntarnos cómo los GPCR menos conocidos o no caracterizados están involucrados en guiar a las células T a tejidos específicos. Podemos aprender cómo la señalización de GPCR podría ajustarse para tratar el cáncer o la autoinmunidad. Podemos ayudar a las células T a llegar al lugar correcto en el momento adecuado para los enfoques terapéuticos.

[Narrador] Para comenzar, el primer día, cubra placas de cultivo de tejidos de 10 centímetros con cinco mililitros de 50 microgramos por mililitro de solución de poli-D-lisina preparada en agua estéril. Incube las placas a temperatura ambiente durante 45 minutos, luego lave las placas dos veces con PBS estéril sin calcio ni magnesio para asegurarse de que no queden residuos. A continuación, separe las células Plat-E con dos mililitros de tripsina al 0,05% y EDTA 0,5 milimolar a 37 grados Celsius durante tres minutos. Para garantizar la viabilidad celular utilizando el ensayo de exclusión de azul de tripano, mezcle un volumen igual de la suspensión celular con una solución de azul de tripano. Luego, siembre 3 millones de células vivas en una placa de Petri de cultivo de tejidos de 10 centímetros con medio Plat-E libre de antibióticos. El segundo día, reemplace el medio en cultivos de células Plat-E con 6,5 mililitros de medio de suero reducido. Prepare la mezcla de transfección de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Para cada placa, mezcle 45 microlitros de Lipofectamine 2000 con 210 microlitros de medio de suero reducido en un tubo y 15 microgramos de ADN con 235 microlitros de medio de suero reducido en otro tubo. Combine el contenido de los tubos pipeteando tres o cuatro veces e incube durante 20 minutos a temperatura ambiente para facilitar la formación de complejos. Ahora, agregue la mezcla gota a gota a los platos e incube durante 16 horas a 37 grados centígrados. A continuación, recubra las placas de 24 pocillos para la activación de células T con CD28 y CD3 anti-ratón en 375 microlitros por pocillo de PBS. Incube las placas durante la noche a cuatro grados centígrados o durante tres o cuatro horas en una incubadora a cuatro grados centígrados. El tercer día, use un émbolo de jeringa para triturar suavemente los bazos de ratones aislados en un colador de células de malla de nailon de 100 micrómetros colocado en una placa de seis pocillos que contiene medio RPMI. Transfiera la suspensión celular a través de un colador celular de malla de nailon de 40 micrómetros a un tubo cónico de 50 mililitros para obtener una suspensión de una sola célula. Centrifugar la solución a 450g durante cinco minutos a cuatro grados centígrados. Luego lave las células con PBS sin calcio ni magnesio. A continuación, realice una selección magnética negativa utilizando el kit de aislamiento CD4 de células T de ratón de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Cuente la célula T aislada usando un contador de células. Coloque las células T en los pocillos de activación de células T recubiertos a una densidad de uno a 1,5 millones de células por pocillo en un mililitro de medio RPMI 10. Incube las células a 37 grados centígrados con un 5% de dióxido de carbono en una incubadora humidificada durante 24 a 48 horas. El cuarto día, recolecte aproximadamente 12 mililitros de sobrenadante viral de las placas de 10 centímetros en un tubo cónico. Reemplace el medio en las placas de cultivo Plat-E con 10 mililitros de medio Plat-E libre de antibióticos para generar más sobrenadante viral para una segunda transducción al día siguiente. Para filtrar el sobrenadante viral recolectado, páselo a través de un filtro de jeringa de 0,45 micrómetros. Agregue ocho microgramos por mililitro de Polybrene y una dilución de 100 de tampón HEPES al sobrenadante filtrado. Gira la placa de células T de 24 pocillos durante siete minutos a 950 g. Luego, recolecte y guarde cuidadosamente el sobrenadante sin desalojar las células T. Para realizar la spinfección, agregue un mililitro de sobrenadante viral a cada pocillo. Selle los platos con una envoltura de plástico y gírelos a 1.150 g durante cuatro horas a 32 grados centígrados. Después de la infección, reemplace cuidadosamente el medio en cada pocillo con el sobrenadante de células T previamente guardado. El sexto día, recolecte las células T de la placa en un tubo cónico y centrifuge. Lave el gránulo con PBS que contenga calcio y magnesio. Transfiera las células a una nueva placa de cultivo que contenga 130 unidades por mililitro de interleucina-2 de ratón y 10 nanogramos por mililitro de interleucina-7 de ratón. Incube las células durante al menos dos días o hasta que alcancen el nivel de expansión deseado según la cantidad de células necesarias para la inyección. El octavo día, centrifugar a 450 g durante cinco minutos a cuatro grados centígrados para granular las células. Agregue cinco mililitros de Histopaque-1077 en un tubo de 15 mililitros. Vuelva a suspender el gránulo de células T en cinco mililitros de PBS que contienen calcio y magnesio. Coloque cuidadosamente la suspensión celular sobre cinco mililitros de Histopaque-1077 en el tubo de centrífuga. Centrifugue la muestra a 400 a 500 g durante 20 minutos a temperatura ambiente, asegurándose de que la rotura o aceleración de la centrífuga esté ajustada a 0. Después de la centrifugación, observe la formación de distintas capas celulares. Recoja cuidadosamente la capa de interfaz que contiene las células deseadas con una pipeta, evitando la contaminación con otras capas. Las células T transducidas GPR25 exhibieron una migración mejorada hacia hCXCL17 y mCXCL17 en relación con los controles transducidos de relleno, validando la expresión funcional del receptor. GPR25 transdució células localizadas preferentemente en tejidos mucosos no intestinales, como el tracto genitourinario, el estómago y la tráquea, con un enriquecimiento significativo observado a las siete semanas, pero no a la semana después de la inyección. Los ensayos de búsqueda a corto plazo mostraron que GPR25 transdució células T preferentemente a órganos ricos en Cxcl17, como la tráquea, el estómago, la lengua, la vesícula biliar y la mucosa uterina, mientras que no se acumuló en ratones deficientes en Cxcl17. GPR25 transdució células predominantemente localizadas en los bronquios, mientras que las células de control se encontraron con mayor frecuencia cerca de las venas.