Un método para el 2-Photon imágenes del flujo sanguíneo en la neocorteza a través de una ventana craneal

La capacidad de obtener imágenes de la vasculatura cerebral y registrar la dinámica del flujo sanguíneo en el cerebro intacto de roedores vivos es una técnica poderosa que se puede aplicar al estudio de la isquemia cerebral o la fisiología cerebral normal. Aquí demostraremos cómo usar dos fotomicroscopía para obtener imágenes de la dinámica del flujo sanguíneo en el neocórtex de ratones vivos utilizando tintes fluorescentes inyectados en la vena de la cola. Esta técnica fue desarrollada originalmente por David Kleinfeld en Winfred Dank.

Hola, soy Ricardo Mota del Laboratorio de Carlos Porter Cayo en el Departamento de Neurología de la Universidad de California en Los Ángeles. En un vídeo anterior, os mostramos el método para implantar una ventana craneal para experimentos de imagen crónica in vivo. Hoy vamos a mostrarte el procedimiento para obtener imágenes de la dinámica del flujo sanguíneo en la corteza cerebral a través de una ventana craneal.

Esta preparación es muy útil porque permite obtener imágenes del interior del cerebro utilizando la microscopía láser de fotones. Así que empecemos. Para obtener imágenes de la vasculatura cerebral, los animales deben ser inyectados por vía intravenosa con un tinte fluorescente.

Utilizamos tintes conjugados Dexter porque la mota dextronera evita que el tinte cruce la barrera hematoencefálica y se filtre fuera de los vasos sanguíneos. Los ratones se anestesian con flúor, un 4% para la inducción y un 1,5 a 2% durante la inyección. A continuación, se desinfecta la cola con tres hisopos de alcohol al 70% con una aguja de calibre 26, se inyectan de 75 a cien microlitros de una solución al 5% de R domine Dextrano disuelto en solución salina a través de la vena de la cola.

mitad de camino a lo largo del eje de la cola, los animales pueden ser fotografiados inmediatamente después de la inyección de la vena de la cola hasta que el dado se excreta en la orina, que se volverá rosada si se usa el tinte ERO domine. Alrededor de dos horas después de la inyección de tinte fluorescente Dexter, el ratón es anestesiado con isde flúor. De nuevo, 4% para inducción, 1 a 1,5% para imagen. El ratón se fija firmemente mediante la barra de titanio a la platina del microscopio, que contiene una almohadilla térmica regulada para mantener al animal caliente.

Se aplica un poco de ungüento para los ojos para mantener los ojos húmedos. La cubierta de vidrio de la ventana craneal se limpia con alcohol al 70%. La ventana se coloca paralela al plano focal y centrada en el campo de visión.

Bajo el objetivo de cuatro x, es mejor tomar una fotografía de los vasos de la superficie del cerebro con una cámara digital. Esta imagen se utilizará como imagen de referencia en las siguientes sesiones de imágenes para encontrar la región de la imagen repetidamente día tras día. A continuación, el objetivo de cuatro x se sustituye por un objetivo de inmersión en agua de 40 x.

Sin mover el escenario, se toma la imagen digital de la vista. De nuevo, las coordenadas del manipulador de escenario se establecen en cero. Utilizamos la imagen de escaneo como software de adquisición de imágenes.

Este artículo fue escrito en MATLAB por Tom Paul Rudo y Bernardo Sabatini en el laboratorio de Carls Voto. A continuación, encendemos todos los demás equipos, el láser, el medidor de potencia, los tubos fotomultiplicadores, los amplificadores, etcétera. El área de la ventana adecuada para ser fotografiada se escanea brevemente con un aumento bajo para encontrar las mejores regiones.

Una vez que se identifican, se toma la pila de bajo aumento de la región elegida para obtener la imagen y se anotan sus coordenadas XY para registrar la dinámica del flujo sanguíneo en vasos pequeños o capilares. Utilizamos escaneos lineales a lo largo de al menos 40 micras del recipiente de interés. Estos barridos individuales que duran un segundo se realizan utilizando la menor potencia láser posible, y se anotan las coordenadas y el ángulo de escaneo.

Una vez finalizada la sesión de imagen, el animal es trasladado a una cámara caliente donde puede recuperarse de la anestesia. Aquí mostramos una pila de cien imágenes tomadas cada cinco micras con nuestro microscopio de dos fotones a través de una ventana craneal colocada sobre la corteza somatosensorial de un ratón de cinco meses de edad al que se le inyectó r Domine dextran a través de la vena de la cola. Esta secuencia de imágenes muestra la compleja red de vasos sanguíneos grandes y pequeños, incluidos los capilares.

Acabamos de mostrarle un método para la visualización de la dinámica del flujo sanguíneo in vivo a través de una ventana craneal. Se trata de un método extremadamente potente para obtener imágenes de la dinámica del flujo sanguíneo cerebral en la vasculatura cortical, por ejemplo, para investigar las alteraciones del flujo sanguíneo después de un accidente cerebrovascular. Se pueden hacer múltiples imaginaciones en varios momentos en BUL mediante el uso de inyecciones repetidas de venas de cola del tinte fluorescente.

Al realizar este procedimiento, es importante recordar trabajar en las condiciones más limpias y estériles posibles y tener una mano muy firme. Bien, y eso es todo. Gracias por mirar y buena suerte con tu experimento.