Un protocolo eficiente para evaluar la modulación de la actividad de ERK en modelos tempranos de síndrome de Noonan de pez cebra mediante microscopía FRET en vivo e inmunofluorescencia

Generamos modelos de pez cebra de enfermedades complejas del desarrollo, vinculando la secuenciación del paciente con la genómica funcional, para apoyar la interpretación de variantes y también pruebas preclínicas de fármacos. A pesar de la mejora de los sensores FRET, aún no hay ensayos robustos in vivo que detecten cambios patógenos sutiles en la señalización Ras-MAPK con suficiente sensibilidad espaciotemporal. Para empezar, coloca la placa de microinyección personalizada que contiene 2%agarosa moldeada en medio E3 sobre una plataforma de trabajo.

Coloca y alinea los huevos de pez cebra adolescentes fertilizados en la placa con las líneas adecuadas para restringir el movimiento durante la microinyección. Recarga la aguja con dos microlitros de material inyectable usando una micro cargadora. Ajusta la presión y el tiempo para calibrar cada inyección según la aguja y la calidad del embrión en el dispositivo de microinyección.

Inyectar la solución en la etapa unicelular de embriones adolescentes de pez cebra. Criar embriones adolescentes microinyectados bajo condiciones de manejo controlado. Limpia cualquier huevo que parezca turbio o degenerado en un plazo de tres horas tras la deposición.

Aproximadamente cuatro horas después de la fertilización, utilizando un microscopio estereoscópico de fluorescencia estándar, ajustado a un rango de longitudes de onda de 465 a 500 nanómetros. Haz un cribado de los embriones para detectar la expresión de los reporteros de fluorescencia. Selecciona peces adolescentes positivos para la imagen FRET y reserva los hermanos negativos para evaluaciones inmunohistoquímicas.

Colocar grupos de embriones de igual número en diferentes pozos de una placa de seis pozos. Para iniciar el tratamiento, sumergir los embriones en tres mililitros de medio E3 que contenga control vehicular como DMSO o MEK diluido a la concentración deseada. Para empezar, funde la alocota de agarosa que se derrite al 1,5% al 2% bajo en un termomezclador a 50 grados Celsius.

Una vez disuelto, reduce la temperatura a aproximadamente 30 grados Celsius. Coloca un único embrión positivo de adolescente inyectado en el centro de un recipiente inferior de cristal de 35 milímetros para obtener imágenes en vivo. Retira el exceso de medio E3 y añade una gota de agarosa de baja fusión para inmovilizar el embrión.

Deja que la agarosa se polimerice a temperatura ambiente. Enciende el controlador de la incubadora al menos una hora antes de la adquisición y ajusta la temperatura a 28 grados Celsius para mantener la salud del embrión. Una vez que la incubadora se estabilice, coloca la bandeja de imagen junto al embrión sobre el portamuestras y utiliza un objetivo seco 10x para visualizar la muestra.

Enciende el láser de iones de argón y ajusta la potencia del láser al 50%. En Configuración de hardware, elige resolución de profundidad de ocho bits para adquirir imágenes. A continuación, en el panel de Adquisición, selecciona el modo de escaneo de detección espectral xy, gamma, lambda, z y ajusta el formato de imagen a 512 por 512 píxeles, velocidad de escaneo de 400 hercios y zoom óptico de 0,75. Activa la línea láser de 458 nanómetros del láser de iones de argón y ajusta su valor de intensidad al 8,5%. Luego selecciona un detector híbrido y ajusta su sensibilidad a un valor de ganancia de 500.

Abre el menú desplegable en la barra del detector para seleccionar la proteína de fluorescencia cian o curva de emisión ECFP. Para mostrar la curva de emisión del YPET, active un segundo detector. Luego selecciona la curva de emisión de proteína de fluorescencia amarilla del YFP.

Para iniciar adquisiciones en vivo, coloca el cursor de detección en el rango de la señal YFP más intensa para visualizar la muestra. Establece las posiciones inicial y final del grosor de la muestra en la ventana LASX de la pila Z. Configura las propiedades del rango de escaneo gamma para que comiencen en 460 nanómetros y terminen en 570 nanómetros del rango de detección.

Define el ancho de banda de detección como cinco nanómetros y el tamaño del paso de escaneo como cinco nanómetros. Inicia la adquisición de z-stack. Inserta y guarda dos espectros de emisión de referencia adaptados para CFP y YFP en la base de datos de colorantes disponible en la ventana de Configuración para excluir el filtro espectral.

Selecciona el archivo de imagen espectral resultante de la sesión de imagen y abre la ventana del proceso. A continuación, en la herramienta de separación de colorantes, selecciona Separación Espectral de Colorantes y configura los ajustes para la separación de colorantes. En las listas desplegables a la izquierda del diálogo, selecciona el nuevo espectro de emisiones CFP en la primera posición y el nuevo espectro de emisiones YFP de la base de datos del espectro.

En el escaneo gamma de las imágenes, identifica la imagen con la mayor intensidad de señal. Luego avanza a lo largo del z-scan para seleccionar la sección óptica que resalta el área de interés en la zona del margen. Activa el modo de selección de ROI en la zona de margen del polo animal para definir el área con el mejor espectro.

Haz clic en la mira de ROI en la ventana de visualización y ajusta el tamaño del ROI de referencia a 40 vóxeles en el área de mediciones. Abre el archivo recién generado que contiene los dos canales separados. Produce una imagen de proyección bidimensional a partir de la serie de imágenes tridimensionales usando la proyección de máxima intensidad.

En la ventana de Procesos, selecciona recortar para separar los canales en dos archivos distintos, el canal uno y el canal dos. En la ventana de Procesos, selecciona Combinar imágenes, luego selecciona el archivo del canal dos e insértalo en la primera opción. Luego selecciona el archivo del canal uno e insértalo en la segunda opción.

Establezca una reescala con un factor cinco y elige la operación de ratio. Haz clic en Aplicar para generar el nuevo archivo que contiene la imagen de la métrica de ratio. Guarda el archivo para el análisis de datos.

Importa los archivos de imagen espectral y separación de colorantes al software de código abierto Fiji para su análisis. Configura los parámetros para las mediciones de lectura en Fiyi usando Analizar y Establecer Mediciones. Selecciona área, densidad integrada y valor gris medio como parámetros de interés.

Usando la herramienta de selección de polígonos de la barra de herramientas, selecciona la región de interés correspondiente al margen de la gástrula. Secuencialmente, haz clic en Analizar, Herramientas y Gestor de ROI para guardar las especificaciones de ROI xy. Para realizar mediciones en un ROI seleccionado, haz clic en Analizar y Medir.

Organiza los FRET por valores de la relación CFP para cada ROI en una hoja de cálculo con grupos experimentales en columnas y valores en bruto en filas. Para una única réplica biológica, se crea una tabla de columnas con una variable de agrupación, donde cada grupo está definido por una columna. Al final de la gastrulación, fijar los embriones mediante inmersión en paraldehído al 4% preparado en PBS durante 20 minutos a temperatura ambiente.

Después de la fijación, lava los embriones varias veces con PBS. Utilizando una pipeta pastor, orientar los embriones lateralmente en un solo pozo de una placa de 12 pozos que contiene PBS fresco. Utilizando un microscopio estereoscópico con objetivo de aumento de 2,7x, objetivo de escaneo de 0,63x y factor de zoom de 8,6, captura las imágenes en modo campo claro para evaluar la presencia de una forma ovalada.

Importa la imagen del embrión capturada en el software de Fiyi. Para medir la longitud de los ejes del embrión, selecciona la herramienta recta desde la barra de herramientas y haz clic en Analizar, seguida de Medir. Tras realizar las mediciones seleccionadas, añádelas a la lista del gestor de ROI y guarda el archivo de ROI.

Exporta los datos a una hoja de cálculo. Calcula la proporción de ejes dividiendo la longitud del eje mayor por la longitud del eje menor. Calcular la media, la desviación estándar de la media o el error estándar de la media de diferentes réplicas.

Nuestra tubería de FRET en vivo en pez cebra permite la detección sensible y temprana de la activación patógena de la señalización ERK, el apoyo a la interpretación de variantes y la prueba de eficiencia de inhibidores MEK.