Aislamiento e identificación de cepas bacterianas de la piel de anfibios terrestres

Esta investigación tuvo como objetivo desarrollar un protocolo eficiente para recolectar la microbiota de la piel de los anfibios terrestres silvestres y garantizar la integridad microbiana durante el almacenamiento y la manipulación.

Los desafíos clave incluyen prevenir la contaminación de las muestras, mantener la viabilidad microbiana durante el almacenamiento y cultivar un crecimiento lento para evaluar completamente la diversidad de la microbiota de la piel de los anfibios.

Se estableció que la solución salina mejorada con glicerol preserva la integridad de la microbiota de la piel de los anfibios durante el almacenamiento y la manipulación, el cultivo bacteriano consistente y la mejora de las estrategias de conservación microbiana para la investigación ecológica y biotecnológica.

Este protocolo aborda la falta de métodos de muestreo estandarizados, preserva y maneja bacterias cultivables de la piel de los anfibios y garantiza la integridad de la comunidad.

[Narrador] Para comenzar, esterilice el medio en autoclave a 121 a 134 grados Celsius durante 15 a 30 minutos. Después del autoclave, deje que el medio de agar se enfríe a aproximadamente 45 a 50 grados centígrados. Debajo de una campana de flujo laminar previamente esterilizada, vierta el medio enfriado en placas de Petri estériles. Una vez que el agar se haya solidificado, etiquete las placas de Petri con el tipo de medio y la fecha de preparación. Mezcle la muestra obtenida del campo con la solución empujando el hisopo contra las paredes del tubo mientras aprieta el tubo y gira el hisopo completamente, 10 veces en el sentido de las agujas del reloj y 10 veces en el sentido contrario a las agujas del reloj. Mezcle bien la muestra microbiológica antes de procesarla. Preparar la dilución seriada de la muestra cutánea con solución salina que va de 10 a la potencia de -1 a 10 a la potencia de -6. Inocular 100 microlitros de la muestra sin diluir y diluir en serie en las placas de agar preparadas. Usando un bucle estéril en forma de L, raye la muestra a través de la superficie del medio de agar, asegurando una distribución uniforme sin aplicar una presión excesiva. Invierta las placas inoculadas y colóquelas dentro de una incubadora a 20 a 25 grados centígrados durante tres a cinco días para apoyar el crecimiento de bacterias mesófilas y psicotrópicas en la piel de los anfibios. Después de la incubación, seleccione colonias bacterianas con morfologías distintas para un análisis más detallado. Asegúrese de que las colonias estén bien aisladas y exhiban diferentes apariencias, como variaciones en el color, tamaño, forma, borde, superficie o textura. Para subcultivar las colonias seleccionadas, transfiera una colonia bien aislada de la placa de agar original a una placa de agar fresca utilizando un asa de inoculación en condiciones asépticas. Raya la colonia para aislarla. Y luego incubarlo adecuadamente. Aquí se muestra el procedimiento de muestreo coordinado de un individuo con espeleomantes itálicos utilizando herramientas estériles en un entorno de campo. El muestreo fue realizado por dos operadores utilizando guantes e hisopos estériles para minimizar el estrés en el anfibio y garantizar la precisión durante el manejo. El hisopo se transfirió inmediatamente a una solución salina con glicerol al 20% para preservar la integridad microbiana durante el transporte al laboratorio. Aquí se muestra una comparación de la densidad de la comunidad microbiana mantenida en solución salina con y sin adición de glicerol. La carga bacteriana en el almacenamiento de solución salina sin glicerol fue significativamente menor que la del control y la solución salina con glicerol. La comunidad microbiana almacenada en solución salina con glicerol mostró una carga bacteriana similar a la del control, lo que indica la preservación de la integridad microbiana. La mejor conservación de la comunidad microbiana se observó en solución salina con glicerol almacenado a cuatro grados centígrados, mostrando la carga bacteriana más estable a lo largo del tiempo. El almacenamiento en solución salina sola a temperatura ambiente dio como resultado el mayor crecimiento bacteriano, lo que indica contaminación microbiana o promoción selectiva de ciertos grupos bacterianos. La congelación a menos 20 grados centígrados redujo la carga bacteriana, lo que sugiere que las bajas temperaturas afectaron negativamente la supervivencia microbiana.