Ensayo modificado del número más probable para cuantificar la salmonela en productos de pollo crudos y listos para cocinar

Nuestra investigación desarrolla tecnologías de detección rápida, cuantificación y caracterización de patógenos transmitidos por los alimentos, centrándose en métodos sensibles que pueden mejorar la seguridad alimentaria mediante la identificación de una contaminación en entornos del mundo real. Los desafíos clave incluyen lograr una detección rápida y sensible y matrices complejas con soluciones de bajo costo, pero escalables. También abordamos las dificultades para reducir los falsos positivos y mejorar la compatibilidad con diversos entornos de prueba.

Para la seguridad alimentaria, esto significa detectar con precisión patógenos a bajas concentraciones en una variedad de matrices alimentarias. Nuestro protocolo aborda la brecha entre la prevalencia, la detección y la cuantificación de la salmonela para proporcionar valores deterministas del nivel de contaminación en los productos alimenticios. El proceso es mínimamente disruptivo, ya que incorpora ensayos validados utilizados en los protocolos FSIS y lo suficientemente flexible como para acomodar patógenos adicionales y matrices de alimentos.

Para comenzar, coloque el pollo molido adquirido del departamento de carne fresca de los minoristas locales en una plataforma de trabajo. Divida asépticamente la carne en muestras de 25 gramos. Adquiera productos de pollo listos para cocinar de la sección de alimentos congelados de los minoristas locales y divídalos asépticamente en muestras de 25 gramos.

Raya salmonella enterica serovar Typhimurium ATCC 14028 en una placa de barrena de infusión cerebro-corazón. Incubar la placa durante la noche a 37 grados centígrados. Al día siguiente, inocule 25 mililitros de caldo de infusión cerebro-corazón con una colonia de salmonela recién cultivada.

Cultivo de cultivo aeróbico durante la noche a 37 grados centígrados con agitación a 100 RPM. Para preparar una serie de diluciones diez veces, transfiera 0,5 mililitros de cultivo a 4,5 mililitros de agua peptídica tamponada o BPW y mezcle bien. A continuación, transfiera 0,5 mililitros de la dilución preparada a 4,5 mililitros de BPW para cada dilución subsiguiente.

A continuación, transfiera asépticamente 25 gramos de pollo molido irradiado a bolsas estomacales estériles. Inocular la muestra con un mililitro de la concentración deseada de la dilución del cultivo. Con un esparcidor de células estéril, distribuya suavemente el inóculo de manera uniforme sobre la superficie del pollo y déjelo reposar a cuatro grados centígrados durante una hora.

Después de incubar muestras de pollo molido irradiadas con cultivo de salmonela durante una hora, agregue 225 mililitros de BPW a cada muestra para lograr la proporción deseada de muestra a medio. Homogeneizar las muestras de pollo con el estómago a velocidad normal durante 120 segundos. Con una pipeta de 50 mililitros, retire con cuidado el líquido del lado filtrado del estómago y divídalo en dos botellas de centrífuga estériles.

Centrifugar las muestras a 10.000 g durante 10 minutos y desechar el sobrenadante. Vuelva a suspender el pellet celular en tres mililitros de BPW con una espátula estéril. Agregue 12 mililitros de BPW al pellet resuspendido y mezcle bien revolviendo con una espátula estéril.

Combine el contenido de ambas botellas de centrífuga en una botella. Agregue tres mililitros de la muestra resuspendida a cada pocillo en la columna uno del bloque de 48 pocillos para crear ocho réplicas. Para preparar una serie de diluciones diez veces en las columnas uno a seis utilizando una pipeta de ocho canales, agregue 0,3 mililitros de la muestra de cada pocillo a 2,7 mililitros de BPW en la siguiente columna asegurando una mezcla completa.

Incubar los bloques durante la noche a 37 grados centígrados con agitación a 100 RPM. Al día siguiente, utilizando una pipeta multicanal, coloque siete microlitros de cultivo de cada dilución en placas de barrena de infusión cerebro-corazón en una rejilla de cuatro por seis. Deje que las placas se sequen durante 10 minutos antes de incubarlas a 37 grados centígrados durante 18 a 24 horas.

Después de la incubación, examine las placas de barrena, marcando al menos una colonia como positiva y ningún crecimiento como negativo. Introduzca el número de dilución y el factor de dilución en una hoja de cálculo. Introduzca el volumen o peso adecuado de la muestra.

A continuación, especifique el número de réplicas e introduzca el número de muestras que dieron positivo. Haga clic en calcular resultados para analizar los resultados positivos y negativos anotados utilizando el método simple de resolución de máxima probabilidad. Para comenzar, configure el bloque MPN de 48 pocillos para el cultivo de salmonela inoculado con muestras de pollo.

Mezcle los cultivos en un bloque de 48 pocillos pipeteando hacia arriba y hacia abajo varias veces. Transfiera 200 microlitros de cada cultivo a una placa de PCR de 96 pocillos. Selle la placa y la centrífuga a 6.600 G durante 10 minutos.

Retire el sobrenadante y agregue 20 microlitros del reactivo del kit de extracción de ADN al pellet. Mezcle el pellet pipeteando hacia arriba y hacia abajo. Nuevamente, selle el plato y caliéntelo a 99 grados centígrados durante 10 minutos, seguido de enfriamiento a 20 grados centígrados.

Después de la centrifugación, utilice dos microlitros del sobrenadante para preparar la mezcla de QPCR de acuerdo con el protocolo establecido. Con las siguientes condiciones, realice la PCR en tiempo real. Después de la PCR, exporte los resultados y considere los pocillos con valores de umbral de ciclo menores o iguales a 30 como positivos y mayores que 30 como negativos.

Mezcle los cultivos en un bloque de 48 pocillos pipeteando hacia arriba y hacia abajo varias veces. Transfiera 20 microlitros de cada muestra al tubo de lisis provisto por el kit de ensayo de detección molecular de salmonela. Calentar las muestras a 100 grados centígrados durante 15 minutos.

A continuación, incubar las muestras durante 10 minutos a temperatura ambiente. Transfiera 20 microlitros de lisado de cada tubo de lisis a un tubo de reactivo y cargue los tubos de reactivo en el soporte. Añada el soporte con tubos de reactivo al instrumento del sistema de detección molecular.

Configure los ajustes de software para el ensayo del sistema de detección molecular. Ejecute el ensayo y exporte el informe para su análisis. El informe de ejecución de MDS proporciona información de salida detallada, que es positiva o negativa.