Cultivo y selección monoclonales microbianos automatizados y de alto rendimiento mediante el sistema ómico de cultivo de gotas de microlitros de una sola célula

Esta investigación explora las ómicas de cultivo microbiano, utilizando una plataforma automática, para mejorar el aislamiento microbiano, el cultivo y el cribado monoclonal. El objetivo es mejorar la comprensión del intestino humano, el microbioma y sus aplicaciones. Los tecnólogos que avanzan en la investigación del microbioma incluyen la caída de microfluídica, el aislamiento automático de cepas y las plataformas de detección, los algoritmos de aprendizaje automático y los dispensadores monoclonales para el análisis de microbiomas y cultivos de alta tensión.

El sistema de células medias mejora significativamente la microvista, el aislamiento monoclonal y la coloración, generando casi el doble de clones en comparación con los métodos tradicionales, avanzando así en la capacidad de investigación en la mezcla de cultivos de microvista intestinal. Este protocolo aborda la necesidad de una plataforma de cribado microbiano de bajo coste y alto soporte, superando las limitaciones de los métodos tradicionales en cuanto a eficiencia y capacidad de puntuación para la investigación de la mezcla de cultivos. Nuestro laboratorio se centrará aún más en la integración de técnicas adicionales de manipulación de gotas, como la división y fusión de gotas para ampliar el alcance de las aplicaciones tecnológicas.

Para comenzar, abra la puerta de la cámara de generación y cultivo de gotas de la celda MISS. Retire verticalmente la cubierta protectora para el microtubo y el chip microfluídico de generación de gotas. Con una jeringa desechable, agregue 10 mililitros de agua destilada estéril a la cámara interior del humidificador y vuelva a instalar la cubierta protectora.

Abra el envase estéril del microtubo y el chip microfluídico de generación de gotas, y colóquelo verticalmente directamente encima de la cámara de cultivo. Luego, en la interfaz del software, haga clic en instalación. Cuando aparezca la ventana emergente de confirmación, haga clic en sí para iniciar la instalación.

Saque el removedor de burbujas de aire y fíjelo boca abajo en la ubicación del removedor de burbujas de aire en la cámara. Conecte el tubo de salida de gotas del removedor de burbujas de aire a la válvula de sujeción que se encuentra debajo de él. Guíalo a través de todo el camino hasta la cámara de detección y recolección de gotas.

Después de abrir la puerta de la cámara, inserte verticalmente el tubo de detección en el zócalo de detección. Asegúrese de que el tubo de detección esté completamente insertado. Apriete el tornillo que sujeta el tubo de detección en el sentido de las agujas del reloj.

Después de confirmar la inserción completa y la seguridad, cierre la puerta de la cámara. Conecte cada uno de los 10 tubos de silicona del chip microfluídico, etiquetados como L1 a L10, a sus correspondientes válvulas de abrazadera numeradas. A continuación, conecte el conector rápido del chip microfluídico al puerto correspondiente del sistema ómico, siguiendo las conexiones adecuadas.

Una vez completada la instalación del chip, aparece una ventana emergente con el mensaje se abre la válvula de sujeción del tubo de gota. Haga clic en Aceptar cuando se complete la instalación del microtubo y el chip de generación de gotas. Después de asegurarse de que todos los tubos estén correctamente conectados a sus válvulas de abrazadera correspondientes, haga clic en Aceptar.

Antes de realizar la inicialización, haga clic en la interfaz de configuración para configurar los parámetros relevantes, como el modo selectivo, la temperatura de incubación, el tiempo de incubación, la velocidad del agitador, la longitud de onda de detección de OD y la longitud de onda de excitación y emisión para la detección de fluorescencia. Vaya a la interfaz de inicio y haga clic en inicializar. Aparece la ventana emergente de confirmación, haga clic en sí para permitir que el sistema IC realice una autoverificación de sus componentes, incluida la bomba de inyección, los ajustes de temperatura, la prueba de descarga de líquidos residuales, el módulo de cribado y el módulo de detección de gotas.

Una vez completada la inicialización, haga clic en Aceptar en la ventana emergente. Para preparar la muestra, tome la muestra microbiana y realice una dilución en serie con el medio correspondiente para lograr una concentración de alrededor de 50 células por mililitro para obtener una suspensión de muestra de 40 mililitros. A continuación, desenrosque el tapón del frasco de muestra y vierta la suspensión fecal diluida en el frasco con una barra de agitación magnética, hasta la posición de adición de la muestra.

Enrosca la tapa y apriétala firmemente. A continuación, inserte el conector rápido A en el conector rápido B para completar el proceso de carga de la muestra. Después de colocar el frasco de muestra en la posición designada, separe los conectores rápidos A y B del frasco de muestra.

Conecte el conector rápido A del frasco de muestras al puerto O3 del sistema ómico. Conecte el conector C3 del chip microfluídico al conector rápido B y cierre la puerta de la cámara. En la interfaz de inicio del software, seleccione el número deseado de tubos de gotas que se generarán y haga clic en producir para iniciar la generación de gotas de una sola célula.

Espere a que aparezca la ventana emergente que indica la finalización de la creación de la gota y haga clic en Aceptar. Cierre la abrazadera de los tres conectores y retire el frasco de muestra. En la interfaz de inicio del software, seleccione el mismo número de tubo de gotas que se utilizó durante la generación de gotas.

Haga clic en la cultura. Confirme el tiempo y la temperatura de cultivo y comience el proceso. Espere a que aparezca la ventana emergente que indica la finalización del cultivo de gotas.

Presione el botón UV en el sistema ómico para encender la luz ultravioleta UV. Irradie la cámara de detección y recolección de gotas durante 30 minutos antes de apagarla. En un banco súper limpio, abra las placas de 96 pocillos utilizadas para la recolección de gotas y apílelas una encima de la otra sin tapas, numerándolas secuencialmente de abajo hacia arriba.

Asegúrese de que la placa del pocillo superior esté cubierta con una tapa. Abra la puerta de la cámara de detección y recolección de gotas y coloque las placas de pocillos en las posiciones designadas. Retire la tapa de la placa del pocillo superior y, a continuación, cierre la puerta de la cámara.

Vuelva a encender la luz ultravioleta del sistema ómico durante 30 minutos para realizar una esterilización secundaria. A continuación, retire el removedor de burbujas de aire de su posición de colocación. Desenrosque la tapa y retire el tornillo en forma de mariposa de la tapa.

Vierta 200 mililitros de aceite para eliminar burbujas de aire en el removedor de burbujas de aire. Asegure la tapa firmemente, luego fije el removedor de burbujas de aire boca abajo en su ubicación designada. En la interfaz de inicio, seleccione el tubo de gotas para clasificar.

Haga clic en Ordenar. Introduzca el número de placas de pocillos que se van a recoger e inicie el proceso de clasificación. Observe el área de visualización del proceso para obtener mediciones en tiempo real de la densidad óptica de las gotas o los valores de fluorescencia.

Analice aproximadamente de 20 a 30 gotas para verificar el valor de OD. Si la mayoría de las gotas tienen un diámetro exterior de aproximadamente 0,2, establezca el umbral inferior de diámetro exterior en 0,5 y el umbral superior de diámetro exterior en cuatro. El sistema recogerá automáticamente las gotas dentro de este rango en las placas de 96 pocillos.

Espere a que aparezca la ventana emergente que indica la finalización de la clasificación y recolección de gotas y, a continuación, haga clic en Aceptar. Abra la puerta de la cámara de detección y recolección de gotas. Coloque la tapa de la placa del pocillo en la placa del pocillo superior y retire las placas juntas.

Haga clic en exportar datos para guardar los datos de señal de gota recopilados. Haga clic en mapa de calor. Seleccione el archivo de datos de recolección de gotas y observe el diámetro exterior que se muestra en el formato de microplaca.

Visualice estos valores de DO como un mapa de calor donde la intensidad del color corresponde a la distribución de DO en los pozos, proporcionando una representación clara e intuitiva. Se comparó la diversidad de especies de la microbiota intestinal humana obtenida del sistema ómico, el método de la placa sólida y la muestra inicial de heces a nivel familiar. 34 familias microbianas se enriquecieron tanto con el método de placa sólida como con el método ómico demostrado, y el sistema ómico enriqueció adicionalmente cuatro familias.

El sistema ómico también enriqueció eficazmente a algunas de las familias de baja abundancia. A nivel de género, ambos métodos enriquecieron 74 géneros microbianos, mientras que el método de células MISS enriqueció adicionalmente 13 géneros. Además, dos géneros inicialmente presentes en baja abundancia se enriquecieron de manera efectiva, utilizando el sistema OMIC.

Estos resultados mostraron que el método de cultivo celular MISS proporcionó mejores condiciones de crecimiento para aquellas cepas que estaban presentes en bajas proporciones o tenían un rendimiento de crecimiento deficiente en la suspensión microbiana original.