Estudio de la muerte celular programada inducida por nanopartículas de cobre en bacterias

Esta investigación investiga la eficacia bactericida nanopartica del cobre contra tres bacterias comunes clínicamente significativas. Explora casos que incluyen la generación de ROS y la posible participación de la muerte celular programada.

Un desafío actual es lograr recuentos consistentes de colonias. Creo que esto se debe a la intervención. La modernización celular durante la dilución evita el recuento falso con ubicación en comparación con el recuento más experimentado.

Nuestro grupo fue el primero en utilizar un modulador celular para estudiar los mecanismos bactericidas de nanopartículas de cobre, revelando que la muerte bacteriana involucra procesos celulares como la generación de ROS y la autofagia.

El protocolo aborda la necesidad de una comprensión más profunda del mecanismo por el cual las nanopartículas de cobre matan a las bacterias, centrándose particularmente en el área poco explorada de las vías de muerte celular programada bacteriana.

Usando diferentes moduladores celulares, confirmamos que la muerte bacteriana inducida por nanopartículas de cobre implica autofagia y sobrecarga de ROS e identificamos vías clave respaldadas por experimentos confiables basados en triplicado con un diseño simple

[Narrador] Para comenzar, obtenga nanopolvos de cobre comerciales con diámetros de 25 nanómetros y de 60 a 80 nanómetros de un proveedor comercial. Use un mililitro de una SDS milimolar como dispersante para cada tamaño de nanopartícula. A continuación, disperse las nanopartículas mediante un baño ultrasónico durante al menos 30 minutos a temperatura ambiente. A continuación, obtenga las cepas de Escherichia coli, Acinetobacter baumannii y Staphylococcus aureus de los respectivos centros de recursos biológicos. Cultive cada bacteria en 10 mililitros de caldo LB en condiciones aeróbicas a 37 grados centígrados. Diluya los cultivos bacterianos en medio LB para alcanzar una densidad óptica de aproximadamente 0,5 a 600 nanómetros. Ahora use soluciones de nanopartículas de cobre para preparar un rango de concentraciones entre cero y 100 microgramos por mililitro de ambos tamaños. Pipetear 500 microlitros de los cultivos bacterianos en tubos de microcentrífuga y centrifugar a 3.300 G durante 10 minutos a temperatura ambiente. Después de pipetear el sobrenadante, agregue diferentes concentraciones de ambos tamaños de nanopartículas a cada tubo. Tratar los grupos de control con 500 microlitros de PBS como control negativo y 500 microlitros de alcohol al 70% como control positivo. Luego incube todas las muestras agitando a 200 revoluciones por minuto a 37 grados Celsius durante 24 horas. Después de la incubación, lave las bacterias con PBS y extiéndalas en placas de agar LB. Incube las placas a 37 grados centígrados durante 24 horas. Al día siguiente, cuente las colonias en cada placa para todos los grupos de tratamiento. Trate las bacterias con cinco micromolares SBI durante dos horas, 0,5 micromolares de necrosulfonamida durante una hora, 100 nanomolares de wortmannina durante 30 minutos o 100 nanomolares Z-VAD durante 30 minutos. Una vez finalizado todo el pretratamiento, centrifugar todos los tubos a 3.300 G durante 10 minutos. Luego vuelva a suspender el pellet en 800 microlitros de PBS para lavar el modulador de pretratamiento. Distribuya los gránulos resuspendidos. Centrifuga cada tubo, luego desecha el sobrenadante. Vuelva a suspender los gránulos en mezclas moduladoras de nanopartículas antes de incubarlos con agitación. Ahora agregue etanol al 70% y PBS como controles positivos y negativos. Incluya grupos de control en blanco tratados con inhibidores, pero no nanopartículas. Después de la incubación, pipetee el reactivo de viabilidad celular en una proporción de uno a diez volúmenes e incube. Después de centrifugar los cultivos nuevamente, transfiera los sobrenadantes a placas de 96 pocillos. Mida la fluorescencia a 560 nanómetros de excitación y 590 nanómetros de emisión utilizando un lector de microplacas. Diluir los sobrenadantes restantes a 10 a la potencia de menos cinco y 10 a la potencia de menos cuatro y esparcir en placas de agar LB para cultivo. Cuente las colonias individuales al día siguiente. Pipetee los cultivos bacterianos en tubos de microcentrífuga. Luego exponga los cultivos a luz ultravioleta de 405 nanómetros durante tres horas. A continuación, incube los cultivos a 45 grados centígrados durante dos horas. Luego incube las bacterias a cuatro grados centígrados durante dos horas. Después del tratamiento en frío, incube las bacterias en peróxido de hidrógeno al 3% durante 30 minutos. Mantenga un grupo de control a 37 grados Celsius en caldo LB. Ahora trate las bacterias con partículas de 20 o 60 nanómetros en concentraciones entre uno y 100 microgramos por mililitro durante 24 horas. Luego lave las bacterias tratadas dos veces con PBS. Después de la centrifugación, vuelva a suspender los gránulos bacterianos en una solución de cinco micromolares de colorante de diacetato de diclorodihidrofluoresceína 2',7'. Analice la intensidad de fluorescencia a 520 o 530 nanómetros de emisión. Los recuentos de colonias de Escherichia coli se redujeron significativamente en nanopartículas de cobre de 20 nanómetros a un microgramo por mililitro y en nanopartículas de cobre de 60 nanómetros a cinco microgramos por mililitro. Staphylococcus aureus mostró reducciones significativas en los recuentos de colonias en todas las concentraciones de ambos tamaños de nanopartículas. En Acinetobacter baumannii, las reducciones en el número de colonias requirieron cinco microgramos por mililitro de nanopartículas de cobre de 20 nanómetros y 10 microgramos por mililitro de nanopartículas de cobre de 60 nanómetros. Los tratamientos con nanopartículas de cobre indujeron la producción de especies reactivas de oxígeno en todas las bacterias, con partículas de 20 nanómetros que muestran las fracciones más altas de células positivas en concentraciones más bajas. Por el contrario, los tratamientos con nanopartículas de cobre de 60 nanómetros condujeron a una generación constante de especies reactivas de oxígeno en todas las concentraciones. El modulador de muerte celular programado Z-VAD aumentó la supervivencia de Escherichia coli tratada con ambos tamaños de nanopartículas a concentraciones bajas a moderadas. El tratamiento con NSA mejoró la supervivencia de Staphylococcus aureus en las concentraciones de nanopartículas de cobre de 20 nanómetros. Acinetobacter baumannii exhibió una viabilidad mejorada con Z-VAD bajo uno, cinco y 10 microgramos por mililitro de exposición a partículas de cobre de 20 y 60 nanómetros, mientras que la NSA aumentó la viabilidad a solo 10 microgramos por mililitro de exposición a nanopartículas de cobre de 20 nanómetros.