Detección basada en fluorescencia de la actividad de la nucleasa FEN1 y cribado de inhibidores de moléculas pequeñas

Desarrollamos un método basado en fluorescencia para detectar las actividades de la nucleasa FEN1 y detectar los inhibidores de moléculas pequeñas, avanzando en el diagnóstico y la investigación terapéutica dirigida.

Los desafíos actuales de la expresión incluyen la complejidad y las preocupaciones de seguridad de los métodos convencionales junto con el alto costo y el equipo especializado requerido para las técnicas existentes basadas en fluorescencia.

Este protocolo abordó la deficiencia del método radiológico tradicional y las técnicas de fluorescencia de alto costo, proporcionando una solución de detección más segura, eficiente y fácil de usar.

Nuestro laboratorio se centrará en la optimización de una plataforma de cribado de alto rendimiento para explorar las aplicaciones in vivo y los mecanismos de los inhibidores de FEN1 en la terapia del cáncer.

[Instructor] Para comenzar, diseñe hebras de oligonucleótidos de ADN basadas en la actividad de escisión específica de FEN1. Mezcle los oligonucleótidos de ADN monocatenario en un tampón de recocido. Agregue 10 microlitros de tampón de recocido y agua desionizada para obtener un volumen total de 50 microlitros. Luego, caliente la mezcla de reacción a 100 grados centígrados durante un minuto en un baño de metal. Transfiera inmediatamente el tubo a 72 grados centígrados e incube durante 10 minutos. Luego, apague la fuente de calor y deje que la solución se enfríe gradualmente a temperatura ambiente para formar el sustrato completo de ADN bicatenario. Para el ensayo de actividad de la nucleasa FEN1, primero combine dos microlitros del sustrato de ADN con la nucleasa FEN1 en el tampón de reacción. Incube la mezcla de reacción en un baño metálico a 37 grados centígrados durante 15 minutos. Agregue 20 microlitros de tampón de terminación 2X para detener la reacción. A continuación, cargue 20 microlitros de la muestra terminada en un gel de poliacrilamida desnaturalizante al 12 % preparado previamente. Electroforese el gel a 100 voltios durante 60 minutos. Una vez completado, visualice los resultados de la electroforesis bajo un sistema de imágenes de fluorescencia. Con una pipeta, transfiera dos microlitros de dimetilsulfóxido a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros. Agregue dos microlitros de nucleasa FEN1 y 10 microlitros de tampón de reacción 2X al tubo y seis microlitros de agua desionizada. Mezcle bien la solución, luego incube en hielo durante 10 minutos. Después de la incubación, pipetee dos microlitros de sustrato de ADN para alcanzar un volumen de reacción final de 20 microlitros. A continuación, prepare una dilución de trabajo del inhibidor de la nucleasa FEN1 FEN1-IN-4 realizando una dilución en serie doble de una solución madre de un molar en dimetilsulfóxido. Pipetee dos microlitros de cada una de las nucleasas FEN1 y el inhibidor diluido de FEN1-IN-4 en un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros. A continuación, pipetee 10 microlitros de tampón de reacción 2X y cuatro microlitros de agua desionizada. Mezclar suavemente e incubar la mezcla en hielo durante 10 minutos. Ahora, agregue dos microlitros de sustrato de ADN al tubo para hacer que el volumen final sea de 20 microlitros. Incube la mezcla de reacción a 37 grados centígrados en un baño metálico durante 15 minutos. Luego, termine la reacción agregando 20 microlitros de tampón de terminación. Una banda de proteína clara a aproximadamente 45 kilodaltons confirmó la purificación exitosa de la nucleasa FEN1 a partir de la expresión inducida. El sustrato de ADN bicatenario marcado con fluoresceína apareció a 80 kilodaltons, lo que confirma una síntesis exitosa en comparación con el sustrato monocatenario a 59 kilodaltons. La nucleasa FEN1 escindió el sustrato de ADN bicatenario de 80 nucleótidos de una manera dependiente de la dosis, con una escisión completa observada a 0,5 microgramos por microlitro. El compuesto FEN1-IN-4 inhibió significativamente la escisión del sustrato de ADN bicatenario por FEN1, como lo demuestra la retención de la banda de 80 nucleótidos. FEN1-IN-4 redujo la actividad de la nucleasa FEN1 de una manera dependiente de la concentración, con una concentración inhibitoria máxima de la mitad de 14,03 micromolares.