Name: Detección basada en fluorescencia de la actividad de la nucleasa FEN1 y cribado de inhibidores de moléculas pequeñas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-06-27T12:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 46 s
Description: Aprende a detectar la actividad de la nucleasa FEN1 mediante fluorescencia y cribar inhibidores de moléculas pequeñas. Este ensayo bioquímico ofrece una solución segura y eficiente para la investigación de terapias contra el cáncer.

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<ol><li>Xu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+cell-virus-virophage+tripartite+infection+systems+discovered+in+the+freshwater+lake+Dishui+Lake+in+Shanghai%2C+China%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Novel cell-virus-virophage tripartite infection systems discovered in the freshwater lake Dishui Lake in Shanghai, China.</a> J Virol. 94 (11), e00149(2020).</li>
<li>Mougari, S., Sahmi-Bounsiar, D., Levasseur, A., Colson, P., La Scola, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virophages+of+giant+viruses%3A+An+update+at+eleven%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Virophages of giant viruses: An update at eleven.</a> Viruses. 11 (8), 733(2019).</li>
<li>Paez-Espino, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity%2C+evolution%2C+and+classification+of+virophages+uncovered+through+global+metagenomics%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiome%22%5BJournal%5D)">Diversity, evolution, and classification of virophages uncovered through global metagenomics.</a> Microbiome. 7 (1), 157(2019).</li>
<li>Zheng, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+regulation+of+FEN1+nuclease+and+its+link+to+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Functional regulation of FEN1 nuclease and its link to cancer.</a> Nucleic Acids Res. 39 (3), 781-794 (2011).</li>
<li>Yang, F., Hu, Z., Guo, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small-molecule+inhibitors+targeting+FEN1+for+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecules%22%5BJournal%5D)">Small-molecule inhibitors targeting FEN1 for cancer therapy.</a> Biomolecules. 12 (7), 946(2022).</li>
<li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+FEN1+promotes+DNA+damage+and+enhances+chemotherapeutic+response+in+prostate+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Med+Oncol%22%5BJournal%5D)">Inhibition of FEN1 promotes DNA damage and enhances chemotherapeutic response in prostate cancer cells.</a> Med Oncol. 40 (8), 242(2023).</li>
<li>Abdel-Fatah, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+and+protein+expression+analysis+reveals+flap+endonuclease+1+%28FEN1%29+as+a+key+biomarker+in+breast+and+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Oncol%22%5BJournal%5D)">Genomic and protein expression analysis reveals flap endonuclease 1 (FEN1) as a key biomarker in breast and ovarian cancer.</a> Mol Oncol. 8 (7), 1326-1338 (2014).</li>
<li>Guo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FEN1+endonuclease+as+a+therapeutic+target+for+human+cancers+with+defects+in+homologous+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">FEN1 endonuclease as a therapeutic target for human cancers with defects in homologous recombination.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (32), 19415-19424 (2020).</li>
<li>Zhao, E., Zhou, C., Chen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flap+endonuclease+1+%28FEN1%29+as+a+novel+diagnostic+and+prognostic+biomarker+for+gastric+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Res+Hepatol+Gastroenterol%22%5BJournal%5D)">Flap endonuclease 1 (FEN1) as a novel diagnostic and prognostic biomarker for gastric cancer.</a> Clin Res Hepatol Gastroenterol. 45 (1), 101455(2021).</li>
<li>Finger, L. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+3%27-flap+pocket+of+human+flap+endonuclease+1+is+critical+for+substrate+binding+and+catalysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The 3'-flap pocket of human flap endonuclease 1 is critical for substrate binding and catalysis.</a> J Biol Chem. 284 (33), 22184-22194 (2009).</li>
<li>Liu, R., Qiu, J., Finger, L. D., Zheng, L., Shen, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+DNA-protein+interaction+modes+of+FEN-1+with+gap+substrates+and+their+implication+in+preventing+duplication+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The DNA-protein interaction modes of FEN-1 with gap substrates and their implication in preventing duplication mutations.</a> Nucleic Acids Res. 34 (6), 1772-1784 (2006).</li>
<li>McWhirter, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+high-throughput+fluorescence+polarization+DNA+cleavage+assay+for+the+identification+of+FEN1+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomol+Screen%22%5BJournal%5D)">Development of a high-throughput fluorescence polarization DNA cleavage assay for the identification of FEN1 inhibitors.</a> J Biomol Screen. 18 (5), 567-575 (2013).</li>
<li>Dorjsuren, D., Kim, D., Maloney, D. J., Wilson, D. M. 3rd, Simeonov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complementary+non-radioactive+assays+for+investigation+of+human+flap+endonuclease+1+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Complementary non-radioactive assays for investigation of human flap endonuclease 1 activity.</a> Nucleic Acids Res. 39 (2), e11(2011).</li>
<li>Van Pel, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+evolutionarily+conserved+synthetic+lethal+interaction+network+identifies+FEN1+as+a+broad-spectrum+target+for+anticancer+therapeutic+development%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">An evolutionarily conserved synthetic lethal interaction network identifies FEN1 as a broad-spectrum target for anticancer therapeutic development.</a> PLoS Genet. 9 (1), e1003254(2013).</li>
<li>Tumey, L. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+identification+and+optimization+of+a+N-hydroxy+urea+series+of+flap+endonuclease+1+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorg+Med+Chem+Lett%22%5BJournal%5D)">The identification and optimization of a N-hydroxy urea series of flap endonuclease 1 inhibitors.</a> Bioorg Med Chem Lett. 15 (2), 277-281 (2005).</li>
<li>Tang, Y., Wei, W., Liu, Y., Liu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+assay+of+FEN1+activity+with+nicking+enzyme-assisted+signal+amplification+based+on+ZIF-8+for+imaging+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Fluorescent assay of FEN1 activity with nicking enzyme-assisted signal amplification based on ZIF-8 for imaging in living cells.</a> Anal Chem. 93 (11), 4960-4966 (2021).</li>
<li>Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((fragment+maturation+involves+%CE%B1-segment+error+editing+by+the+mammalian+FEN1%2FMutS%CE%B1+functional+complex%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">fragment maturation involves α-segment error editing by the mammalian FEN1/MutSα functional complex.</a> EMBO J. 34 (13), 1829-1843 (2015).</li>
<li>Zheng, L., Dai, H., Qiu, J., Huang, Q., Shen, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+the+FEN-1%2FPCNA+interaction+results+in+DNA+replication+defects%2C+pulmonary+hypoplasia%2C+pancytopenia%2C+and+newborn+lethality+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Disruption of the FEN-1/PCNA interaction results in DNA replication defects, pulmonary hypoplasia, pancytopenia, and newborn lethality in mice.</a> Mol Cell Biol. 27 (8), 3176-3186 (2007).</li>
<li>Hilda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alginate-based+3D+cell+culture+technique+to+evaluate+the+half-maximal+inhibitory+concentration%3A+An+in+vitro+model+of+anticancer+drug+study+for+anaplastic+thyroid+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Thyroid+Res%22%5BJournal%5D)">Alginate-based 3D cell culture technique to evaluate the half-maximal inhibitory concentration: An in vitro model of anticancer drug study for anaplastic thyroid carcinoma.</a> Thyroid Res. 14 (1), 10(2021).</li>
<li>Nadine, S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Microstructure+analysis+of+polymer+amended+fluid+fine+tailings+using+Fiji-ImageJ+image+analysis+software%22">Microstructure analysis of polymer amended fluid fine tailings using Fiji-ImageJ image analysis software</a>. , Carleton University Theses and Dissertations. (2022).</li>
<li>Pablo, T. Quantifications figures 2-6 & supplemental fig. 1 (GraphPad Prism 8.1 files). <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPablo%2C+T+%22Figshare%22">Figshare</a>. , (2019).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>1 M Tris-HCL</td><td>Tiempo de beyo.</td><td>ST774</td><td></td></tr><tr><td>30% Acr-Bis (29:1)</td><td>Tiempo de beyo.</td><td>ST003-500ml</td><td></td></tr><tr><td>5M Nacl</td><td>Tiempo de beyo.</td><td>ST347</td><td></td></tr><tr><td>BeyoBlue Plus</td><td>Tiempo de beyo.</td><td>P0003S</td><td></td></tr><tr><td>BL21(DE3)-FEN1</td><td>Vazyme</td><td>C504-F1</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Tiempo de beyo.</td><td>P0007</td><td></td></tr><tr><td>Agitador decolorante</td><td>Kylin-Bell</td><td>TS-100</td><td></td></tr><tr><td>DL-Ditiotreitol</td><td>Tiempo de beyo.</td><td>ST041</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora de baño seco</td><td>RUICHENG</td><td>200 dirhams</td><td></td></tr><tr><td>Aparato de electroforesis</td><td>Bei jing Liuyi Biotechnology</td><td>DDY-6D</td><td></td></tr><tr><td>FEN1 EN 4</td><td>ObjetivoMOL</td><td>T8545</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Takaba</td><td>9030</td><td></td></tr><tr><td>Lodo de kanamicina</td><td>Biosharp</td><td>BS152</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga de laboratorio</td><td>Termo</td><td>SL 16R</td><td></td></tr><tr><td>LB Caldo</td><td>Solarbio</td><td>L8291</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA Su Bind Resina</td><td>7se biotecnología</td><td>PANF001-001C</td><td></td></tr><tr><td>Odisea FC</td><td>ODISEA</td><td>LI-COR</td><td></td></tr><tr><td>SDS-PÁGINA</td><td>Tiempo de beyo.</td><td>P0015L</td><td></td></tr><tr><td>Trición-x-100</td><td>Shyuanye</td><td>S15022</td><td></td></tr></tbody></table>

detección basada en fluorescencia de la actividad de la nucleasa fen1 y cribado de inhibidores de moléculas pequeñas

Fluorescence-Based Detection of FEN1 Nuclease Activity and Screening of Small-Molecule Inhibitors

Como se muestra en la Figura 2A, el reactivo de tinción se une a la proteína, lo que hace que la proteína aparezca como una banda azul en el gel. El primer carril contiene la proteína marcada utilizada como referencia de peso molecular, en la que la banda de proteína estándar BSA corresponde a un peso molecular de 70 kDa, y la banda de proteína de ácido nucleico FEN1 corresponde a un peso molecular de 45 kDa. Los resultados experimentales mostraron que la nucleasa FEN1 apareció como una band...

Detección basada en fluorescencia de la actividad de la nucleasa FEN1 y cribado de inhibidores de moléculas pequeñas

FEN1 (Flap Endonuclease 1) is a key DNA nuclease involved in DNA replication and damage repair, playing a crucial role in maintaining genomic stability. ...

fluorescence-based-detection-fen1-nuclease-activity-screening-small

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Un nuevo método que implica el análisis cuantitativo de FRET (transferencia de energía por resonancia de Förster) señales se describe para el estudio de la cinética de enzimas.

Cuantitativo FRET (transferencia de energía de resonancia de Förster) Análisis para SENP1 Proteasa Determinación Kinetics

Las exonucleasas desempeñan un papel fundamental para garantizar la estabilidad del genoma. La pérdida de la función de la exonucleasa WRN provoca un envejecimiento prematuro. El estudio de los sustratos y otros requisitos de la nucleasa in vitro puede ayudar a dilucidar su papel in vivo. Aquí demostramos un ensayo rápido y reproducible basado en fluorescencia para medir su actividad nucleasa.

Un ensayo de exonucleasa basado en fluorescencia para caracterizar DmWRNexo, ortólogo de la exonucleasa WRN progeroide humana, y su aplicación a otras nucleasas

Este trabajo presenta un método de cribado de alto rendimiento utilizando un sistema universal de cribado genético de enzimas que teóricamente puede aplicarse a más de 200 enzimas. En este caso, el sistema de cribado único identifica tres enzimas diferentes (lipasa, celulasa y fosfatasa alcalina) simplemente cambiando el sustrato utilizado (acetato de p-nitrofenilo, p-nitrofenil-β-D-celobiósido y fosfato de fenilo).

Multienzimático de detección sistemática mediante un sistema de cribado genético de la enzima de alto rendimiento

Se presenta un alto contenido de código abierto instrumento de análisis (HCA) que utiliza imágenes de vida de fluorescencia automatizado (Flim) para ensayar las interacciones proteína utilizando Förster transferencia de energía resonante (FRET) lecturas basadas. La adquisición de datos para este instrumento openFLIM-HCA es controlado por el software escrito en μManager y se lleva a cabo el análisis de datos en FLIMfit.

Open Source de análisis de contenidos de alta Utilizando microscopía de fluorescencia automatizado de imágenes por vida

Se han desarrollado ensayos de actividad basados en RMN para identificar y caracterizar los inhibidores de dos enzimas ribohidrolasas nucleósidos. Se proporcionan protocolos para ensayos compuestos iniciales a 500 m y 250 m, ensayos de dosis-respuesta para determinar los valores de IC50, ensayos de pantalla de contador de detergente, ensayos de pantalla de contador de dilución de salto y ensayos en células enteras de E. coli.

Ensayos de actividad basados en RMN para determinar la inhibición compuesta, valores IC50, actividad artifefectiva y actividad de células enteras de ribohidrolasas de nucleósidos

La actividad de nucleasa alterada se ha asociado con diferentes condiciones humanas, subyacentes a su potencial como biomarcador. La metodología de cribado modular y fácil de implementar presentada en este documento permite la selección de sondas específicas de ácido nucleico para aprovechar la actividad de nucleasa como biomarcador de enfermedades.

Examen cinético de la actividad de nucleasa utilizando sondas de ácido nucleico

El monitoreo de los cambios en la temperatura de fusión de una proteína objetivo(es decir,el ensayo de cambio térmico, TSA) es un método eficiente para examinar bibliotecas de fragmentos de unos pocos cientos de compuestos. Presentamos un protocolo TSA que implementa la fluorimetría de escaneo nano-diferencial asistida por robótica (nano-DSF) para monitorear la fluorescencia intrínseca de triptófano y la retrodisparión de luz para la detección de fragmentos.

Fluorimetría de barrido nanodes diferencial para el cribado en el descubrimiento de plomo basado en fragmentos

Las metiltransferasas de ADN son posibles objetivos farmacológicos contra el cáncer. Aquí, se presenta un protocolo para evaluar moléculas pequeñas para la inhibición de la metiltransferasa de ADN. Este ensayo utiliza una endonucleasa para acoplar la metilación del ADN a la generación de fluorescencia y permite monitorear la actividad enzimática en tiempo real.

Ensayo continuo de metilación del ADN acoplado a endonucleasa basado en fluorescencia para detectar inhibidores de la metiltransferasa de ADN

Las rasopatías son síndromes genéticos multisistémicos causados por la hiperactivación de la vía RAS-MAPK. Las variantes potencialmente patógenas que están a la espera de validación surgen continuamente, mientras que la escasa evidencia preclínica limita el tratamiento. Aquí, describimos nuestro protocolo in vivo para probar y validar los niveles de activación de ERK asociados a RASopatía y su modulación farmacológica durante la embriogénesis mediante imágenes FRET en vivo en pez cebra...

Un protocolo eficiente para evaluar la modulación de la actividad de ERK en modelos tempranos de síndrome de Noonan de pez cebra mediante microscopía FRET en vivo e inmunofluorescencia

Este protocolo introduce una metodología de cribado fluorométrico optimizada para identificar inhibidores naturales de productos o pequeñas moléculas en la síntesis de proteínas. Su viabilidad la hace adecuada tanto para la enseñanza de grado en técnicas de descubrimiento de fármacos como para su implementación en campañas de química medicinal.

Un protocolo basado en fluorescencia para el cribado preliminar de inhibidores de síntesis de proteínas de fuentes naturales

Aquí describimos un método para la visualización basada en células, la localización subcelular y el análisis cuantitativo de focos enriquecidos con poli(ADP-ribosa) (PAR) en células fijas de mamíferos. Este ensayo permite cuantificar los sitios de activación de PARP inducida por daño al ADN, incluyendo los asociados con la reparación por escisión de bases o la reparación de rotura de cadena simple, en los núcleos de células expuestas a genotoxinas.

Visualización y análisis cuantitativo de la activación de PARP1/PARP2 inducida por genotoxinas en células utilizando un reportero basado en proteínas de fusión fluorescentes

Aprende a detectar la actividad de la nucleasa FEN1 mediante fluorescencia y cribar inhibidores de moléculas pequeñas. Este ensayo bioquímico ofrece una solución segura y eficiente para la investigación de terapias contra el cáncer.

Detección basada en fluorescencia de la actividad de la nucleasa FEN1 y cribado de inhibidores de moléculas pequeñas

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