Cribado CRISPR de todo el genoma para revelar genes radiosensibles y radiorresistentes

Esta investigación se centra en la detección CRISPR de todo el genoma y la radioterapia. Proporcionamos un protocolo para ver genes radiosensibles y radiorresistentes utilizando una pantalla CRISPR de todo el genoma en células de cáncer de pulmón después de la irradiación. Los desafíos experimentales actuales incluyen los efectos fuera del objetivo, que son causados por la gran complejidad del genoma y las posibles dificultades para explorar los mecanismos subyacentes. En comparación con los métodos de cribado tradicionales, CRISPR logra una modificación genética permanente y muestra una precisión superior, lo que lo hace especialmente valioso en la investigación genómica funcional y el descubrimiento de objetivos. En el futuro, nuestro equipo se centrará en estudiar la pantalla CRISPR in vivo para resolver los problemas que dejó esta investigación, y nos comprometeremos a optimizar la tecnología CRISPR.

[Narrador] Para comenzar, ajuste la densidad de células adherentes a cinco veces 10 a la potencia de cinco células por mililitro. Con una pipeta, distribuya dos mililitros de la suspensión celular en cada placa de cultivo de 3,5 centímetros para el tratamiento de radiación a diferentes dosis. Coloque los platos en una incubadora a 37 grados centígrados con un 5% de dióxido de carbono e incube durante la noche. Numere cada plato de cultivo de 3,5 centímetros del uno al cinco, usando un marcador. Usando una fuente de radiación, administre dosis de radiación de 2, 4, 6 y 8 grises, respectivamente, a las placas dos a cinco. Ajuste la densidad de células irradiadas a uno por 10 a la potencia de cinco células por mililitro. Siembre 10 microlitros por pocillo, correspondientes a 1000 células por 100 microlitros en placas de seis pocillos con tres réplicas por dosis de radiación. Luego, siembre 30 microlitros por pocillo, correspondientes a 3000 células por 100 microlitros en placas de 96 pocillos con cinco réplicas por dosis de radiación. Ahora, mezcle el reactivo CCK-8 con medio RPMI 1640 sin FBS en una proporción de uno a nueve. Agregue la mezcla a la placa de 96 pocillos e incube la placa en la oscuridad durante una hora. Luego use un lector de microplacas para medir la densidad óptica a 450 nanómetros. Para comenzar el proceso de infección, configure un gradiente de concentración logarítmico para lentivirus de cero a 800 unidades por mililitro. Agregue el volumen correspondiente de lentivirus a dos microlitros de polibreno por plato y déjelo equilibrar a temperatura ambiente durante cinco minutos. Gotea lentamente la mezcla de lentivirus polybrene en cada pocillo. Ajuste la densidad de células parentales a tres veces 10 a la potencia de cinco células por mililitro e inocule un mililitro en cada pocillo de una placa de 12 pocillos. Agregue puromicina en un gradiente de concentración a los pocillos. Después de 72 horas de infección, reemplace el medio en cada pocillo con un medio completo que contenga la concentración mínima de puromicina para la eliminación celular. Calcule la multiplicidad de infecciones para cada pocillo en función de las células sobrevivientes. Ajuste la densidad celular adherente a uno por 10 a la potencia de siete celdas por mililitro. Agregue lentivirus a una multiplicidad de infección igual a 0,3 en 30 microlitros por plato de polibreno y deje que se equilibre a temperatura ambiente durante cinco minutos. Gotea lentamente la mezcla de lentivirus y polibreno en la placa de cultivo de 15 centímetros. Mezclar bien e incubar durante la noche a 37 grados centígrados con un 5% de dióxido de carbono. En el segundo día después de la infección, aspire el medio de la placa de cultivo y reemplácelo con 15 mililitros de medio completo RPMI 1640 que contenga 10% de FBS. Repita el mismo tratamiento para las células parentales no infectadas como control negativo y continúe cultivando durante 72 horas. Ahora, digiera las células de una placa de cultivo de 15 centímetros con tripsina al 0,25%. Vuelva a suspender las células en medio completo RPMI 1640 con 10% de PBS y cuente el número de células. Después de extraer el ADN genómico para el día cero, use un espectrofotómetro UV NanoDrop para medir la concentración y la pureza del ADN. Administre una dosis adecuada de radiación a las células del grupo de tratamiento y deje las células del grupo de control sin tratar para que se propaguen normalmente. Después de 14 días de tratamiento, digiera las células del grupo de tratamiento y control con tripsina al 0,25%. Vuelva a suspender las celdas en medio completo RPMI 1640 con 10% de FBS. Centrifugar las células a 300 G durante cinco minutos y desechar el sobrenadante. Vuelva a suspender el gránulo en un mililitro de PBS. Después de repetir el paso de centrifugación, extraiga el ADN genómico del día 14 del gránulo y determine la concentración de ADN. A continuación, prepare los cebadores necesarios y dilúyalos a 10 micromolares. Después de agregar los componentes para configurar un sistema de reacción de 20 microlitros, centrifugar el tubo brevemente a 300 G durante cinco segundos. Para la electroforesis en gel de agarosa, prepare el gel, retire el peine y llene el tanque de electroforesis con suficiente tampón para cubrir el gel. Agregue tampón de carga a la muestra de ADN y mezcle bien. Finalmente, cargue la mezcla en los pocillos y comience la electroforesis. La formación de colonias después de 14 días reveló que la exposición a dos Gray de radiación redujo significativamente el número de colonias sobrevivientes en comparación con cero Gray. El ensayo CCKA mostró una disminución sustancial en la viabilidad celular en dos Gray con una disminución adicional a dosis de radiación más altas. El tratamiento con concentraciones crecientes de puromicina durante 72 horas mostró que un micromolar era la concentración mínima requerida para eliminar las células A549. La validación de PCR mostró bandas distintas en 231 pares de bases, lo que confirma la longitud esperada de las secuencias de sgRNA en la biblioteca CRISPR. El análisis de secuenciación reveló que aproximadamente el 60% de las lecturas se asignaron con éxito al genoma de referencia. Los recuentos de lectura de sgRNA siguieron una distribución de Poisson, coincidiendo con las expectativas teóricas para una pantalla a escala genómica. El análisis de PCA y mapa de calor mostró alta variabilidad intergrupal y baja variación intergrupal, validando la consistencia experimental. El análisis de ontología genética identificó la respuesta al daño del ADN como una vía enriquecida entre los 15 resultados principales.